凝結芽孢桿菌發酵復方中藥工藝研究

柴保國，陳佩格，韓 露，高貴超，崔俊亞，李登云

（1.河南牧翔動物藥業有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省畜牧總站）

黃芪、防風和白術是常用的中醫藥材，這三味藥組成又稱玉屏風散，是治療氣虛感冒的代表方劑。黃芪能夠調節血壓、增強免疫功能，白術能夠健脾胃，降血糖，而防風有消炎鎮痛等作用，防風配合著黃芪、白術，能夠健脾去濕，對于疾病有防范作用，同時還能夠治療感冒。絞股藍又名七葉膽，五葉參，具有降血脂，調血壓，防治血栓，防治心血管疾患，調節血糖，促睡眠，緩衰老，抗癌，提高免疫力等特點。

中藥發酵是指在微生態學理論指導下，將中藥研究與微生物發酵技術相結合，利用微生物強大的代謝和繁殖能力，以中草藥物或提取物（液）為基質使有機物分解的生物轉化反應過程。在中藥發酵過程中，菌種的選育是中藥發酵的關鍵。目前在多數實驗研究中，多采用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌等，但枯草芽孢桿菌對不同的中藥發酵效果也有所不同。根據李國紅等的實驗結果，在經枯草芽孢桿菌發酵后，部分中藥的發酵產物抗菌活性增加，而部分中藥的發酵產物抗菌活性卻有所降低。凝結芽孢桿菌是兼性厭氧菌，具備高抗逆性、強黏附性、分泌消化酶、產抑菌物質、易于培養與貯存穩定等獨特優勢，現已被農業農村部列為可直接飼用于畜禽生產的新型飼料添加劑。因此，凝結芽孢桿菌是目前畜牧業研究和應用的熱點。

1 材料與方法

1.1 藥材和菌種

黃芪、白術、防風、絞股藍購自河北省安國市永益中藥材有限公司，經河南省牧翔動物藥業有限公司質管部檢驗為正品。凝結芽孢桿菌（含量為20 億cfu/g），購自山東康地恩生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出物，均購自北京奧博星生物科技有限公司；人參皂苷Rb1，購自中國藥品生物制品檢定所；淀粉和玉米粉購自農貿市場；硫酸銨，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 凝結芽孢桿菌的復蘇與培養

將保存的凝結芽孢桿菌菌種接種到種子斜面培養基，活化培養。取活化的菌種接種到50 mL（250 mL 三角瓶）營養肉湯培養基中，37 ℃，180r／min，培養24 h后備用。

1.4 復方中藥發酵條件優化

采用單向透氣閥袋固體發酵方法對復方中藥黃芪、白術、防風、絞股藍進行發酵，發酵室溫度控制在30 ℃，濕度≤50%，考察不同碳源、氮源及發酵時間對發酵進程的影響。

1.4.1 最佳發酵碳源篩選

凝結芽孢桿菌可以分解淀粉，因此選擇以葡萄糖、淀粉和玉米粉作為備選碳源，考察不同碳源在不同發酵時間對發酵進程的影響。通過測定發酵后凝結芽孢桿菌數量，選擇最佳發酵碳源及發酵時間。

1.4.2 最佳發酵氮源篩選

選擇以硫酸銨、酵母浸出物及蛋白胨分別作為氮源，考察不同氮源在不同發酵時間對發酵進程的影響。通過測定發酵后凝結芽孢桿菌數量，選擇最佳發酵氮源及發酵時間。

1.5 發酵前后有效成分檢測

按比例分別稱取復方中藥和最優發酵體系發酵的復方中藥樣品100 g，各加10倍量水煎煮40 min，離心取上清液濃縮定容至400 mL，分別進行高效液相色譜法檢測絞股藍皂苷含量變化和紫外分光光度計法檢測總多糖含量變化。

早期中立評估(Early Neutral Evaluation，簡稱ENE)作為一種非訴訟糾紛解決方式，是近年來國際上興起的一種司法ADR制度。與民間ADR不同，司法ADR又稱法院附設ADR，是指以法院為主持機構或者受法院指導，但與訴訟程序截然不同的具有準司法性質的訴訟外糾紛解決程序。〔9〕

分別取適量的發酵前后提取液，加乙醇靜置24 h后離心，收集沉淀加適量蒸餾水溶解稀釋，然后進行二次醇沉，最后收集沉淀且烘干至恒重后使用蒸餾水溶解稀釋，制成樣品溶液。以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法，取2 mL樣品溶液在490 nm處測定吸收度，計算。

1.6 絞股藍皂苷含量變化檢測

絞股藍中含有50多種皂苷，其中Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅻ分別與人參皂苷Rb1、Rb2、Rd、F2 為同一物質，該研究以人參皂苷Rb1為對照品，采用高效液相色譜法檢測發酵前后提取液中絞股藍皂苷的含量變化。

高效液相色譜條件為，色譜柱：C18反相色譜柱（粒徑5 m，250 mmx4.6 mm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（32∶68）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 uL。樣品中人參皂苷Rb1 的含量（X1）以質量分數（%）表示，計算方式為：X1=（P1×m2×n1）/（P2×m1×n2）×100%。其中P1 為樣品溶液峰面積值；m2 為標準品稱樣質量（g）；n1為樣品稀釋倍數；P2為標準品溶液峰面積值；m1為樣品稱樣質量（g）；n2為標準品稀釋倍數。

2 結 果

2.1 發酵培養基及發酵時間優化

不同碳源在不同發酵時間對凝結芽孢桿菌數量的影響結果如圖1所示。由圖1可知，葡萄糖、淀粉及玉米粉作為碳源時，凝結芽孢桿菌的數量隨著發酵時間的增加呈現先增加后減少的趨勢，其中凝結芽孢桿菌的數量在發酵48 h時達到高峰。在發酵48 h時，用玉米粉發酵的凝結芽孢桿菌數量明顯比用葡萄糖和淀粉發酵的數量高，呈差異性顯著，所以在發酵時間為48 h時，最佳發酵碳源為玉米粉。

圖1 不同碳源在不同發酵時間對凝結芽孢桿菌數量的影響

不同氮源在不同發酵時間對凝結芽孢桿菌數量的影響結果如圖2所示。由圖2可知，硫酸銨、酵母浸出物及蛋白胨作為氮源時，凝結芽孢桿菌的數量隨著發酵時間的增加呈現先增加后減少的趨勢，其中凝結芽孢桿菌的數量在發酵48 h時達到高峰。在發酵48 h時，用蛋白胨發酵的凝結芽孢桿菌數量明顯比用酵母浸出物和硫酸銨發酵的數量高，呈差異性顯著，所以在發酵時間為48 h時，最佳發酵氮源為蛋白胨。

圖2 不同氮源在不同發酵時間對凝結芽孢桿菌數量的影響

2.2 發酵產物有效成分檢測

發酵前后皂苷含量的變化如圖3所示。由圖3可知，相較發酵前，發酵后絞股藍皂苷的含量大大提高，呈差異性極顯著。說明凝結芽孢桿菌發酵可以降解藥材中的纖維素，促進復方中藥的有效成分溶出。

圖3 發酵前后皂苷含量的變化

發酵前后多糖含量的變化如圖4所示。由圖4可知，相較發酵前，發酵后總多糖的含量大大提高，呈差異性顯著。說明凝結芽孢桿菌發酵可以分解藥材的細胞壁，促使多糖從細胞壁或者蛋白復合體中游離出來。

圖4 發酵前后多糖含量的變化

3 討論

為確保食品安全、降低耐藥性風險及抗生素殘留造成的危害，世界各國紛紛在食品動物飼養過程中實行“減抗”、“禁抗”政策，研究開發新型抗生素替代產品以減少抗生素的使用是一條可行之路。

發酵中獸藥作為一種新型抗生素替代產品，成為目前畜牧業研究的熱點。該研究通過單因素試驗法采用凝結芽孢桿菌對中藥復方進行固體發酵，摸索凝結芽孢桿菌發酵中藥的最佳碳源為玉米粉，與李登云、崔東良等研究結果一致；最佳氮源為蛋白胨，最優發酵時間為48 h。

黃芪、白術、防風及絞股藍作為一種提升機體免疫力的中藥組方，其發揮功能的主要有效成分是多糖類和皂苷類物質。該研究通過檢測發酵前后多糖類和皂苷類的含量變化，研究發現發酵后可有效提高多糖及皂苷等有效成分的溶出，為后期發酵復方中藥在臨床中應用奠定基礎。

4 小結

通過用凝結芽孢桿菌對復方中藥進行發酵，摸索發酵最佳碳源、氮源及發酵時間，并檢測發酵前后凝結芽孢桿菌含量及總多糖、絞股藍皂苷含量的變化。試驗結果表明：最佳發酵碳源為玉米粉，最佳發酵氮源為蛋白胨，最優發酵時間為48 h。該發酵條件下，凝結芽孢桿菌含量增加，發酵的復方中藥有效成分總多糖及絞股藍皂苷含量增加。□