復方過氧化氫消毒劑在種蛋表面消毒中的應用

劉錦容，詹 子，張云麗，楊家榮，謝麗平

（肇慶大華農生物藥品有限公司，廣東 肇慶526238）

種蛋培養法是目前禽用疫苗抗原生產的主要方法，種蛋來源于種雞養殖場，在疫苗生產過程中需對其表面進行消毒，以避免其表面微生物對抗原的污染。目前種蛋消毒方式主要為熏蒸消毒和浸泡消毒，熏蒸消毒主要是福爾馬林與高錳酸鉀配合使用，熏蒸消毒1h后要通風24h，費時費力，殘留毒性不易去除，操作過程中危險性很大。另外福爾馬林與高錳酸鉀反應劇烈，腐蝕性強，有很大的刺激性，對設備及種蛋的胚齡有一定的局限性。苯扎溴銨和碘制劑的浸泡消毒對潔凈的種蛋能達到較好的消毒效果，但對粘有糞便、血漬、墊料等污垢的種蛋易殘留病菌，消毒不徹底，浸泡時間過長還會破壞種蛋膠原質層。近年來，過氧化氫協同殺菌效果的研究非常活躍，研究結果顯示，過氧化氫與熱、紫外線、無機碘化物、超聲波、等離子體、金屬離子、表面活性劑、醇、季銨鹽和戊二醛等均有協同殺菌作用。但市面上多數過氧化氫產品在種蛋消毒效果上存在腐蝕性大的缺點，為達到高效環保的功效，自主研究了一款復方過氧化氫消毒劑，并在實驗室殺菌試驗和種蛋表面熏蒸消毒效果中驗證其殺菌能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

自主研發復方過氧化氫消毒劑，組分含過氧化氫、過氧乙酸，水、還包括HEDP和苯扎溴銨。中和劑由50g/L硫代硫酸鈉、30g/L吐溫—80、3g/L卵磷脂、10g/L組氨酸組成的胰蛋白胨生理鹽水(TPS)溶液和CM Sephadex TM C—25分子篩柱。

試驗菌包括大腸桿菌8099，金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞桿菌ATCC15442、枯草桿菌黑色變種ATCC9372、蛋表面分離的白色念株菌和酵母菌。

試驗蛋是來自種蛋場生產3d內種蛋，熏蒸消毒設備為廣州東弘儀器開發有限公司空間滅菌系統。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同細菌殺滅試驗 按規范要求，各菌取分純單個典型菌落，接種瓊脂培養基斜面，用24h培養的新鮮斜面培養物洗下后，再用胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)稀釋至試驗所需含菌量的菌懸液。枯草桿菌黑色變種按規范規定的細菌芽孢制備程序制備成細菌芽孢懸液(操作步驟略)。然后參照2002版衛生部《消毒劑技術規范》的試驗測試方法要求在實驗室進行殺菌試驗。

1.2.2 腐蝕性試驗 設置復方過氧化氫，市場面過氧化氫產品以及注射用水對照組，按照國家標準GB10124-88金屬材料實驗室均勻腐蝕全浸試驗方法，對不銹鋼腐蝕性進行測定，記錄減輕情況。

1.2.3 種蛋表面消毒（1）分組 將試驗試驗組和對照組分為3組，每組150枚種蛋。試驗組采用復方過氧化氫消毒按1：4稀釋后在孵化機內霧化完后30min取出，霧化壓力0.3 MPa；用量為40mL/m3；對照組1采用20mg／m3濃度的臭氧，與試驗組同等時間后取出；對照2組按照甲醛（40%）10mL／m3、高錳酸鉀5g／m3計算用量和注射用水10mL／m3，在孵化機內進行熏蒸，與試驗組同等時間后取出；對照組3采用與試驗組量相同的注射用水在孵化機內霧化，與試驗組同等時間后取出。（2）采樣 將置于蛋架上的150枚蛋全部取樣，消毒前用無菌棉拭沾取生理鹽水在蛋朝下表面2cm×2cm面積范圍內反復涂擦3遍；消毒后用無菌棉拭沾取生理鹽水在蛋朝上表面2cm×2cm面積范圍內反復涂擦3遍。（3）消毒效果觀察 將采樣后的棉拭子投入中和劑中，漩渦振蕩10～15s，取洗液用普通瓊脂法作傾注培養進行活菌計數（37℃，24～48h），每組滅菌率取其平均數計算殺菌率。結果計算：殺菌率＝（消毒前菌數—消毒后菌數）/消毒前菌數100%

重復以上實驗6次，將以上結果進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 懸液定量殺菌試驗結果

從表1可以看出，復方過氧化氫消病毒對種蛋表面常見的細菌繁殖體、細菌芽孢、霉菌和霉菌孢子等微生物均能有效殺滅，最快殺滅時間達到1min。

表1 不同細菌完全殺滅時間

2.2 腐蝕性實驗結果

從表2可以看出，復方過氧化氫浸泡72h后不銹鋼片僅減輕0.001g，其減輕程度僅是市面上過氧化氫的0.33%。

表2 不銹鋼片浸泡后的重量變化

2.3 種蛋表面熏蒸消毒試驗結果

從圖1可以看出，復方過氧化氫消毒液平均殺菌率達到99.90%，遠高于臭氧消毒和甲醛熏蒸法（P＜0.01）。

圖1 不同消毒劑種蛋表面殺菌率

3 討論

過氧化氫是一種強氧化劑，其化學性質非常活潑，極易分解為氧氣和水，無殘留毒性，不會對環境造成二次污染，故被稱為最清潔的消毒劑。但過氧化氫屬于易制爆品，高濃度使用有爆炸風險，同時對金屬腐蝕性較大。

過氧乙酸消毒劑是本領域常用的消毒劑，其具有廣譜性、殺毒作用強、消毒時間短、分解物無毒的優點。中國專利申請CN201410311749.8公開了一種二元消毒劑，在其背景技術中指出，傳統的一元消毒劑采用8-羥基喹啉或尿素作為穩定劑，但是該一元消毒劑儲存時間短且具有爆炸的風險。

基于上述問題，中國專利申請CN201210209519.1公開了一種一元過氧乙酸消毒液及其制備方法，其采用基于多羥基多羧基多配位體結構復合物的HWP綜合協作穩定體系和特殊嵌段非離子表面活性劑作為穩定組合物提高雙氧水和乙酸的混合后的過氧乙酸的儲存穩定性，經過測試表明，其儲存穩定性優，在8個月內其儲存衰減不到4%。同時，其特殊嵌段非離子表面活性劑能夠降低消毒劑的表面張力，提高消毒劑的潤濕能力和滲透能力，使其殺菌效果更好。

本次實驗制備的復方過氧化氫消毒劑中，苯扎溴銨是作為一種表面活性劑，除了能增加對細菌的通透性還能加強消毒劑的滲透性，同時也是一種廣譜殺菌劑，與過氧乙酸起到協同作用，特別對霉菌有較好的殺滅效果，HEDP在穩定復合體系過程中，使過氧化氫和苯扎溴銨組合殺菌效果得到了顯著的提升。在殺菌試驗中，以復方中過氧乙酸濃度100mg/L殺滅霉菌只需要2min；以復方中過氧乙酸濃度400mg/L殺滅枯草芽孢桿菌只需要10min，有效克服了臭氧和甲醛熏蒸無法完全殺滅該細菌的缺點。

在種蛋消毒應用方面，目前種蛋消毒方式主要為熏蒸消毒和浸泡消毒，熏蒸消毒主要是福爾馬林與高錳酸鉀配合使用，熏蒸消毒1h后要通風24h，費時費力，殘留毒性不易去除，操作過程中危險性很大。另外福爾馬林與高錳酸鉀反應劇烈，腐蝕性強，有很大的刺激性，特別是對粘有糞便、血漬、墊料等污垢的種蛋易殘留病菌，消毒不徹底。

復方過氧化氫消毒劑應用于種蛋表面消毒時，對種蛋表面的各種芽孢菌和霉菌、霉菌孢子等頑固微生物均有顯著作用效果，殺菌高效平均無菌率99.9%，相比傳統的甲醛熏蒸法具有優越環保和安全性能，相對已有的過氧化氫消毒劑，消毒更加穩定，而且大大減少了對設備的腐蝕，應用性強。

通過對該復方過氧化氫消毒劑殺菌試驗、種蛋表面熏蒸消毒試驗表明，該消毒劑在較低濃度條件下可快速殺滅細菌繁殖體、芽孢和霉菌等，使用方便，性能穩定，配方符合環保要求，且便于儲存和運輸，具有較為廣闊的應用前景。