甾體化合物綠色生物制造：從生物轉化到微生物從頭合成

熊亮斌，宋璐，趙云秋，劉坤，劉勇軍，王風清，魏東芝

（1 華東理工大學，魯華生物技術研究所，生物反應器國家重點實驗室，上海 200237；2 上海健康醫學院，協同科研中心，上海 201318）

甾體亦稱類固醇，是一類以環戊烷多氫菲為母核的有機小分子，廣泛存在于動植物、真菌及個別細菌，其在生命體生存繁育的過程中，作用極其多樣且無可取代。天然甾體一方面是細胞膜的重要組分，如膽固醇等對于維持細胞膜流動性和穩定性不可或缺［1］。在生物體內，甾體通常扮演著“激素”角色［2-4］，例如人體內的性激素、植物體內的生長激素蕓苔素內酯、昆蟲體內的蛻皮激素等。在哺乳動物體內，腎上腺皮質激素、性激素和蛋白同化激素等，密切參與了生殖、骨骼和大腦發育、生物效應調控及穩態維持等生命過程［5］。因此，人們很早就發現其可作為一種強效藥物，用于消炎、避孕、抗過敏、免疫調節、內分泌紊亂和老年性疾病等［6］。此外，甾體還具有非激素的功能，如抗病毒、抗抑郁、保護神經、治療心腦血管疾病以及促進骨骼發育等［7］。隨著甾體化合物愈加普遍地應用于臨床，從而逐漸形成了一類依據結構特征命名的藥物——甾體藥物。

目前，全球獲準上市的甾體藥物約有400 余種［8-9］，其中如地塞米松和倍他米松等，在用于癌癥、重癥感染和器官移植等危重病癥時療效顯著。作為基礎衛生體系的必備藥物，甾體藥物常作為戰略性物資進行儲備［10-11］。值得一提的是，在抗擊SARS，以及目前仍在全球肆虐的新冠肺炎疫情中，甾體藥物發揮了關鍵的治療作用［12］。2020 年10 月，世界衛生組織通過系統對比指出，地塞米松是對重癥患者唯一有效的藥物，可將依靠呼吸機維持生命的重癥患者死亡率降低約三分之一［13-15］。除此之外，甾體在農業［16］、環境［17］和化工［18］等領域，也有著廣闊的應用前景。由此，甾體的工業化制造是一項關乎國計民生的核心產業，對于維護人類健康、促進經濟發展等意義重大。

1 甾體制造的發展歷程

甾體藥物的發現和工業化生產，是20 世紀全球醫藥工業最成功的兩大進展之一。從20 世紀初發現甾體化合物具有強大的藥用功效，到如今甾體制藥已成為一個龐大的產業，其工業化過程大致經歷了以下4個階段：

（1）初創階段（近代—20 世紀40 年代） 受動物腺體提取物可用于內分泌、心血管等疾病治療的啟發，人們猜測其內容物可能具有強大的生理和藥理活性。由此，先后從動物組織中分離得到了雌酚酮、雌二醇、雌三醇、睪丸素、皮質酮等甾體激素成分［19］。此階段，3 位德國科學家Wieland、Windaus 和Butenandt 分別完成了膽酸、維生素D 以及雌甾酮、雄甾酮、孕甾酮等性激素活性成分的鑒定，從而分別獲得1927 年、1928 年和1939 年的諾貝爾化學獎［20］。然而由于動物腺體的成分復雜、甾體含量極低，加之收集比較困難，導致此階段的甾體藥物不僅供應種類有限，并且價格極其高昂。例如，當時從動物腺體提取的黃體酮，單價曾高達1000 美元/g，遠超黃金價格。

（2）起步階段（20 世紀40—60 年代） 天然甾體來源有限、價格高昂，嚴重限制了甾體藥物的臨床應用普及。隨著化學制藥工業的興起，人們開始嘗試通過化學合成生產此類物質。1940 年，賓夕法尼亞州立大學的Russel Marker 發現薯蕷屬植物中存在一種甾體皂苷元（俗稱薯蕷皂素），以此為原料經三步降解即可生成孕烯酮醇，再經氧化又可高效合成黃體酮（Marker三步降解）［21］。隨后，Marker 又在墨西哥找到了富含薯蕷皂素的小穗花薯蕷，解決了原料來源問題。此后利用薯蕷皂素為原料，經Marker 降解生產不同的甾體藥物得到了蓬勃發展，最終形成了沿用至今的“薯蕷皂素-雙烯”半合成體系（圖1）。本階段，黃體酮等甾體藥物的價格大幅下降，有力推動了甾體激素藥物在臨床上的廣泛應用。

（3）成熟階段（20 世紀60—80 年代） 盡管薯蕷皂素資源分布廣泛，但含量高且適合開發的品種卻十分有限。早期，甾體制藥工業依賴于墨西哥供應原料，甾體制藥技術則被歐美壟斷，隨后，三個標志性事件的發生，奠定了延續至今的甾體制藥工業格局。①1958 年，黃鳴龍教授以我國國產的薯蕷皂素為原料，開創了國際領先的可的松七步法合成，由此推動了腎上腺皮質激素類藥物生產技術的進步，地塞米松等先后在我國實現工業化生產［22］。②1960 年，美國 FDA 批準了一種由異炔諾酮和炔雌醇復配而成的口服避孕藥，極大刺激了社會對甾體藥物的需求［20］。在黃鳴龍教授的領導下，我國也在60年代陸續實現甲地孕酮、炔諾酮和氯地孕酮等口服避孕藥的合成，因此，黃鳴龍教授被譽為“中國甾體口服避孕藥之父”［22］。③隨著甾體制藥工業的快速發展，對原料的需求日益增加，而對野生薯蕷皂素資源的野蠻開采導致其日趨枯竭。為解決此問題，我國于1984年首先實現了對野生薯蕷屬植物黃姜的“野轉家”人工栽培，高峰時期僅我國的種植面積即高達4000 萬畝，年產薯蕷皂素約5000 t，可滿足全球的生產需求。至此，甾體制藥工業徹底擺脫了對野生資源的依賴，產業發展趨于健康平衡，基于Marker 降解的“薯蕷皂素-雙烯”工業體系也隨之走向成熟（圖1）［23］。

圖1 基于Marker降解的甾體半合成工藝體系［24］Fig.1 The semi-synthesis of steroids based on the Marker degradation technology

（4）轉型升級階段（20世紀90年代至今） 隨著野生薯蕷皂素資源趨于枯竭，人們還嘗試進行了替代性資源的開發工作。最成功的當屬以植物甾醇為原料，通過微生物轉化生產雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）、9α-羥基雄甾-4-烯-3，17-二酮（9α-OHAD）、21-羥基-23，24-二降膽-4-烯-3-酮（HBC）等中間體，再經化學修飾生產目標甾體藥物工藝的建立（圖2）。相較之前的“薯蕷皂素-雙烯”體系，依賴微生物轉化的新體系具有原料來源穩定、反應路線短、收率高、生產成本低且更環保等顯著優勢。實際上早在1944 年，即已發現微生物具有轉化甾醇生成有用代謝產物的能力，然而直到80 年代末，該技術才在德國先令制藥公司等得到應用，我國則是在2010 年左右取得突破，并迅速完成了對“薯蕷皂素-雙烯”體系的取代。在此期間，基于合成生物學開發甾體藥物的微生物全合成技術也已開始萌芽 。 在 1998 年 和 2003 年 ，Pompon 及 Dumas 課 題組通過在酵母引入異源基因，改變內源的麥角甾醇合成路線，實現了黃體酮和氫化可的松等甾體激素的微生物全合成［25-26］。雖然從產量來看，這種策略還僅僅是一種創新性的概念，但此工作有力證實了利用人工生物合成甾體藥物的可行性，自此甾體制藥技術迎來一個全新階段。

圖2 基于甾醇微生物轉化的甾體半合成工藝體系［24］Fig.2 The semi-synthesis of steroids based on the microbial transformation of sterols

2 甾體生物催化轉化酶的挖掘及改造

甾體大都具有相同的母核結構，取代基的位置和構型，是決定藥物功效的關鍵。例如，氫化可的松與表氫化可的松僅存在11 位羥基構型的不同，但前者可與糖皮質激素受體結合發揮功能，后者則無法正常結合此類受體［27］，導致二者的藥用價值差異巨大。在甾體藥物的生產中，通常需對母核的部分惰性位點進行特定取代基的構建。鑒于化學合成法存在選擇性差、反應復雜、產物得率低等問題，常需借助生物催化轉化，以實現功能化修飾反應。當前，甾體制藥工業具有重要應用價值的生物催化反應主要有三類，分別是立體選擇性羥基化、區域選擇性脫氫和酮基不對稱還原［28-30］。由于均為氧化還原反應，涉及復雜的電子傳遞系統，異源高效表達難度較大，因此長久以來工業多采用微生物活細胞轉化的方式，實現上述的功能化反應。近幾年，隨著基因組挖礦和編輯技術的成熟，高催化活性和高選擇性的新工程菌得以不斷開發，具有反應時間短、副產物少、產品易精制等突出優勢的酶法催化，也得到越來越多的應用。

2.1 甾體羥化酶的挖掘及改造

通過向母核引入特定構型的羥基化基團，可賦予甾體不同的應用價值，其中尤以11β、11α、9α、7β位的羥基化產物價值最為突出。甾體羥基化多由P450 單氧化酶催化，該酶多以跨膜或細胞膜錨定的形式存在，需要復雜的電子傳遞系統［31］，因此很難在微生物細胞高活性表達［32］。由于絲狀真菌具有復雜的次級代謝，并且通常含百余個甚至幾百個P450 氧化酶，因此工業上常使用絲狀真菌來執行甾體的羥基化反應。

11β位羥基是氫化可的松、地塞米松、倍他米松等糖皮質激素藥物的關鍵基團，可由絲狀真菌新月彎孢霉（Curvularia lunata，有性態Cochliobolus lunatus）或藍色犁頭霉（Absidia coerulea）催化實現，然而此步驟的整體效率低，立體選擇性也較差。2019 年，Beatriz Galán 等首次在C. lunatus中鑒定了一個11β-羥基化酶CYP103168 及其還原酶CPR64795，并成功在谷氨酸棒桿菌實現了異源表達，使副產物的生成顯著降低，產品得率相應得到提升［33］。隨后，張學禮課題組從犁頭霉A.orchidis獲得了另一種11β-羥基化酶CYP5311B2 及其氧化還原酶。由于該酶在催化11β-羥化的過程中，會伴隨生成20%的11α-羥化副產物，通過蛋白質工程改造，使突變體的活性提升了約3倍，結合對菌體的優化改造，最終獲得一株可高效轉化11-脫氧皮質醇，生成氫化可的松的基因工程菌，培養48 h的產量達1060 mg/L，最高產率為667 mg（/L·d）［34］。

11α位羥基是依普利酮、脫氧孕烯等藥物的重要基團［30，35］，通常由黑根霉（Rhizopus nigricans）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）等絲狀真菌發酵轉化而來。針對該酶的挖掘，天津科技大學路福平教授課題組做出了突出貢獻，近幾年陸續完成了對工業用11α羥化菌株關鍵酶的鑒定。2016年，該課題組在黑根霉TCCC 41047中篩選鑒定出3個可以轉化16，17α-環氧孕酮的11α羥化酶［36］。2017年，又從藍色犁頭霉AS3.65 中鑒定出新的11α羥化酶CYP5311B1，然而表征結果顯示，該酶僅限于催化 16，17α-環氧孕酮底物［37］。隨后在 2020 年，該課題組進一步從赭曲霉TCCC41060 分離得到了兩個受甾體化合物強烈誘導表達的P450 酶CYP68L8和CYP68J5，其中CYP68J5能特異性地針對16，17α-環氧孕酮進行11α羥化［38］，這一系列的工作為改良現用工業菌種，或開發高效的11α羥化酶基因工程菌奠定了堅實基礎（表1）。

表1 甾體化合物羥基化反應的類型Tab.1 Types of steroidal hydroxylation

借助9α羥基化酶的催化在9α位引入氟等鹵素，可用于制造地塞米松、倍他米松等高端甾體。以此為基礎，結合化學轉化引入9（11）雙鍵，或在 11 位引入酮基、11β或 11α羥基等，通常可獲得更理想的上羥收率。9α羥化酶多源于分枝桿菌、紅球菌等放線菌，該酶是一種雙組分ⅠA 型單加氧酶，包括Rieske 型單加氧酶（KshA）和鐵氧還蛋白還原酶（KshB）。由于KshA 發揮功能需與還原伴侶KshB共表達，導致9α羥化酶系的異源活性表達難度較大。為解決此問題，天津科技大學路福平教授課題組在大腸桿菌中構建了一種高活性的人工9α羥化酶系統。通過重構NADH 的再生系統，利用來自普提達假單胞菌F117 的甲苯2，3-氧化還原酶TDO-R 代替KshB，與一個Rieske［2Fe-2S］鐵氧還蛋白TDO-F的融合表達后，使電子轉移效率提高176.3%，在以雄甾-4-烯-3，17-二酮為底物時，最終可產5.24 g/L的9-OHAD［36］。

7β羥化產物及其衍生物，具有良好的神經保護和抗炎活性，可用于治療慢性神經元損傷等。然而微生物對7β羥化的選擇性較低，同時因副產物較多等，工業酶的開發難度較大。2020 年，通過對巨大芽孢桿菌源的單加氧酶P450-BM3 活性中心15 個氨基酸位點的突變，湖北大學李愛濤課題組篩選獲得了一種對C19甾體分子具有高區域和立體選擇性的突變體［39］。此外，7β羥基也是膽酸類甾體藥物的關鍵基團，2021年，德國的Bornscheuer教授課題組篩選獲得了一種可以廉價的石膽酸為底物進行7β羥基化直接生成熊去氧膽酸的鏈霉菌源CYP107D1，隨后通過半理性設計，成功獲得了區域和立體選擇性接近完美的突變體，為熊去氧膽酸等膽酸類藥物合成路線的革新提供了可能［40］。

除在甾核上的羥化反應之外，在甾體側鏈或角甲基等位置的羥化反應，也具有極重要的工業價值。例如，維生素D 是一類甾體型維生素，其側鏈25 位羥基基團是發揮功能的關鍵，而在已鑒定的25-羥化酶中，來自Streptomyces griseolus的CYP105A1和放線菌Pseudonocardia autotrophica的CYP107-Vdh 均具有良好的催化表現［41］。2013 年 ，Tamura 課題組通過蛋白質工程獲得了一個Vdh 的突變體VdhT107A，隨后通過在Rhodococcus erythropolis的異源表達、NADH 重生和細胞壁合成抑制等優化手段，最終獲得一種可在2 h 內實現催化轉化573 mg/L 產物的高效催化劑［42］。又如甾體的 19 位羥基化反應，可用于米非司酮、炔諾酮和雌激素等藥物的生產。2018 年，朱敦明課題組報道了一種來源于Thanatephorus cucumerisNBRC 6298 的P450 酶STH10，通過在畢赤酵母的異源重構表達，實現了對脫氧可的松C19 位和C11 位的羥基化反應，這也是首次報道能夠在C19 位甲基上羥的P450 酶［43］。隨后，武漢大學瞿旭東課題組利用此酶進行了系統的優化重建，通過發酵條件優化及底物的結構修飾，實現了利用可托多松高選擇性催化合成19-羥化可托多松，由此出發借助化學合成獲得了多種19-羥甾體藥物［44］，為開發合成甾體19位羥基化的高效細胞工廠提供了新的候選途徑。

2.2 甾體脫氫酶的挖掘及改造

雙鍵是大部分甾體藥物的必需官能團，如4（5）雙鍵、5（6）雙鍵、1（2）雙鍵、7（8）雙鍵和9（11）雙鍵等。在甾體的半合成中，選用薯蕷皂素或甾醇為原料，原因之一在于這類分子具有5（6）位雙鍵，而此雙鍵很容易易位到4（5）位，可省去在 4（5）或 5（6）位引入雙鍵的復雜步驟。工業上常借助生物催化實現向甾核引入雙鍵的反應，其中以C1，2位的轉化脫氫最為重要。在自然界，以分枝桿菌和節桿菌為代表的放線菌等，均可催化實現C1，2位脫氫，但此類微生物對甾體的降解能力較強，因此只有個別喪失此能力的菌株才可用于工業生產。此過程中，發揮核心催化功能的是一種FAD依賴型黃素酶，即3-酮基甾體-Δ1-脫氫酶（KstD）。近些年，隨著對KstD的不斷挖掘和異源高效表達研究，采用酶催化實現脫氫正在逐步替代微生物發酵轉化的脫氫技術。2018年，天津科技大學路福平教授課題組對來自簡單節桿菌的KstD3進行分子對接和定點飽和突變，有效擴大了酶與底物的結合口袋，減輕了空間干擾，使突變體對AD等底物的催化效率提高近3倍，而采用酶催化和靜息細胞轉化的方式可分別獲得71%和95%的ADD得率，相比對照菌則分別提高了33%和20%［45］。同年，張保國課題組從新金分枝桿菌DSM 1381 中篩選了3種KstD，其中酶活力最高的KstD2工程菌可在15 h 內以高達99%的轉化率將8 g/L AD 轉化為ADD［46］。2020年，王敏教授課題組從簡單節桿菌中鑒定出了通用性更高的KstD5，該酶不僅底物譜寬，還可催化多種重要的甾體藥物，同時具有良好的有機溶劑耐受性，因此可通過在反應體系添加有機溶劑助溶甾體底物，大幅提高底物的投料濃度［47］。

此外，7（8）位雙鍵是蛻皮激素等甾體的重要基團，也是維生素D3前體7-脫氫膽固醇的關鍵結構。然而，對甾體進行7（8）脫氫十分困難，往往需經過曲折復雜的化學轉化才能實現。2011 年，Yoshiyama-Yanagawa 等［48］在解析蛻皮激素合成路線的過程中，發現了一種在無脊椎動物高度保守的Rieske 型7（8）位脫氫酶，該酶在昆蟲中被稱為Neverland，在線蟲中被稱為DAF-36，在還原伴侶蛋白的作用下，Neverland/DAF-36（簡稱NVD）可直接催化膽固醇生成7-脫氫膽固醇，這與脊椎動物體內的合成路線完全不同，這意味著如能在微生物中實現該酶的異源表達，將極大地提高維生素D3等相關化合物的生產效率。近幾年，路福平教授課題組通過深入的異源表達研究，于2019年在昆蟲卵巢細胞Sf9 中成功實現果蠅來源NVD 的異源表達。此后，為實現工業應用目的，該課題組又測試了利用大腸桿菌異源活性表達NVD 的可能性，然而由于該酶發揮功能所需的還原伴侶蛋白尚未得到鑒定，NVD在大腸桿菌的表達主要以包涵體形式存在。隨后，通過在N末端嘗試添加麥芽糖結合蛋白（MBP）可溶性標簽，該課題組最終成功獲得了純度為95.4%的可溶性NVD蛋白［49］。2020年，通過對融合蛋白特性的進一步研究發現，使用MBP標簽可增加NVD的熱穩定性［50］，由此為推動NVD重組工程菌的開發奠定了重要基礎。

2.3 甾體酮基還原酶的挖掘

在甾體制藥體系中，常常還會涉及在甾核C3、C11、C17 等位置進行酮基與羥基的轉換反應。由于甾核羥基具有特定的立體構型，因此酮基與羥基間的轉換往往需保持高度的區域和立體選擇性。在自然界中分布廣泛的酮基還原酶，多為短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）、中鏈脫氫酶/還原酶（MDR）或醛糖酮還原酶（AKR）蛋白超家族成員，可專一性催化實現甾體的酮基立體還原。 1956 年Marcus 等最早介紹了一種睪丸梭菌來源的3α-羥基甾體脫氫酶/羰基還原，該酶不僅具有氧化還原3α-羥基甾體底物的功能，而且可催化一些非甾體醛或非甾體酮的還原反應［51］。由于酮基還原酶在醫藥中間體生產領域具有廣泛而深入的研究基礎，在此不再過多贅述。

3 微生物代謝轉化甾醇機制的解析及轉化細胞工廠的開發

甾醇等甾體分子在動植物和真菌中普遍存在，而大多數原核生物因缺乏角鯊烯單加氧酶和角鯊烯環化酶等關鍵酶，無法自主合成甾醇分子。然而有意思的是，自然界卻存在許多可徹底降解甾醇，為自體生長和生理代謝提供碳源和能量的原核微生物，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、短桿菌屬（Brevibacterium）、細桿菌屬（Microbacterium）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、 諾卡氏菌屬（Nocardia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）以及鏈霉菌屬（Streptomyces）等［11，52-60］，其中以分枝桿菌屬和紅球菌屬的甾醇代謝能力最強?；诖?，通過對微生物甾醇降解途徑的代謝工程改造，可獲得一系列具有積累甾體醫藥中間體能力的微生物細胞工廠（圖2、圖3），如C19型甾體［61-62］、C22型甾體［63］和A環降解物等。從這些分子出發，結合化學或微生物修飾衍生，可完全代替基于Marker 降解的“薯蕷皂素-雙烯”工業體系，用于腎上腺皮質激素、孕激素、性激素等幾乎所有臨床用甾體激素藥物的生產。

3.1 甾醇微生物代謝途徑解析與途徑工程改造

微生物對甾醇的降解途徑可分為兩類，即好氧代謝和厭氧代謝［64］。由于厭氧代謝效率低，工業常利用好氧代謝轉化甾醇生產甾體醫藥中間體。2007 年，van der Geize 等［65］在紅球菌和結核分枝桿菌中首次發現了甾醇降解基因簇。該基因簇由223個基因組成，其間散布著51個與降解高度相關的基因，這為理解微生物對甾醇的氧化代謝機制，以及通過理性的代謝工程改造開發高效轉化甾醇的細胞工廠鋪平了道路［66-67］。此外，研究表明在分枝桿菌中除上述基因簇之外，還有一些小的基因簇同樣也參與了甾醇的降解，這些小簇通常負責編碼限速步驟的同工酶，可對這些步驟起強化作用。由于這些同工酶在微生物間差別較大，從而可賦予菌株差異明顯的降解能力［61，68］。以膽固醇為例，微生物對甾醇的降解，大致分為母核裂解和 C17 位側鏈的β-氧化［66-67］，這兩部分混雜進行［69-70］，為了更清晰地闡述甾醇的代謝機制，我們將按圖3這種簡化方式進行描述。

3.1.1 甾體母核降解途徑及改造

微生物對甾醇的降解，始于膽固醇氧化酶（ChO）催化3 位的β羥基生成膽甾-4-烯-3-酮，此為甾醇分解代謝的限速步驟［71-73］。隨后，在KstD和3-甾酮-9α-羥基化酶Ksh 的共同作用下，甾體母核B 環開裂，所產生的開裂物最終被降解為丙酰CoA 和丙酸鹽等短鏈分子［66，74］。在不干擾 C17 位側鏈降解的前提下，對母核降解途徑的改造，可獲得兩類重要的甾體醫藥中間體（圖3）：C19型甾體，如 AD、ADD、9α-OHAD 等；A 環降解物，如谷內酯（HIL）等。C19型甾體是甾醇微生物轉化體系的主要部分，可用于腎上腺皮質激素和性激素的生產。為開發高效的C19型甾體微生物細胞工廠，通常需集中改造母核降解途徑中由ChO、KstD 和Ksh催化的三步關鍵反應［75］。

圖3 甾醇的微生物分解途徑Fig.3 The catabolic pathway of sterols in microorganisms

ChO 是一類界面酶，通常定位于細胞膜，需FAD 輔基的參與才能發揮催化活性，根據二者結合方式的不同，ChO 可分為FAD 非共價結合型（Ⅰ型）［76-78］和 FAD 共價結合型（Ⅱ型）。2013 年，通過挖掘Mycolicibacterium neoaurumATCC 25795的基因組信息，兩個分別定位于胞內和胞外的ChO 同工酶ChoM1 和ChoM2 被發現，這種定位模式使位于細胞外膜的甾醇可被高效地氧化為膽甾-4-烯-3-酮，實現從不溶性甾醇顆粒上的快速解離；此外，已進入膜內的甾醇分子，在內膜ChO 的催化下迅速脫離細胞膜的束縛，可更快地進入胞質啟動后續的氧化降解。因此，ChO 的活性是決定甾醇轉化的第一個限速因素。在構建AD 等生產菌種時，通過代謝強化ChoM1 和ChoM2 的表達，可使工程菌的生產能力提高約50%［68］。值得一提的是，在分枝桿菌等微生物中，除了ChO 之外，3β-羥基甾體脫氫酶（3β-HSD）也能氧化甾醇生成膽甾-4-烯-3-酮，并且在結核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌等微生物中，3β-HSD 甚至可取代ChO 發揮主要的催化功能［71-73］。

KstD 和Ksh 則是決定C19型甾體能否生成和產物選擇性的關鍵酶，C19型甾體具有完整的母核結構，為阻止母核發生降解，KstD 和Ksh 不可共存，至少需選擇性地阻斷其中之一的活性，同時還需根據目標產物有針對地強化KstD 或Ksh 活性，以減少副產物的生成。具體來說，為獲得特定的C19型甾體產物，需對KstD和Ksh進行如下改造：①對于AD 生產菌種的開發，需同時失活KstD、Ksh 及其同工酶；②對于9α-OHAD 生產菌種的開發，則需在保留Ksh 的同時，使KstD 及其同工酶徹底失活，此外根據副產物AD 的積累情況，還需強化Ksh的表達，以保證AD能夠完全轉化為9α-OHAD；③而對于ADD 生產菌種的開發，則需在保留KstD的同時，使Ksh及其同工酶徹底失活，根據副產物AD 的積累情況，視情況強化Ksh 的表達，以保證AD能完全轉化為ADD［62］。

在甾醇降解過程中，KstD 是催化3-酮-4-烯類甾體生成 3-酮-1，4-二烯型甾體的關鍵酶［46，61］。通常微生物源KstD 會有3 個以上的同工酶，這種特征很可能賦予菌株作用于多種底物，以及更強的甾醇降解能力［79-81］。然而此情況也導致在開發AD和9α-OHAD 等工程菌的過程中，需挖掘并采用同源重組等方法敲除所有的KstD 功能酶基因，以降低副產物的生成，確保整體收率［61］。Ksh 是負責催化3-酮基生成9α-羥基化產物的關鍵酶，可單獨用于甾體藥物的催化轉化［82］。Ksh 酶活性的不足也是目前9α-OHAD 生產菌存在的重要問題之一，會導致AD 等副產物的生成。與KstD 類似，Ksh在微生物中也會存在多達2～5 個同工酶［83］，因此在涉及AD 和ADD 等菌株的開發中，需對其進行徹底敲除；而針對9α-OHAD 生產菌種的開發，則需強化多種KshA 酶的活性。谷內酯是在母核降解過程的另外一種重要代謝產物，可用于米菲司酮和雌激素等19-去甲甾體藥物的合成。該物質由母核A 環降解后轉化生成，失活?；?CoA 脫氫酶FadE30-33 等，可阻斷其下游的降解步驟（圖3），實現谷內酯的積累生產［84］。

3.1.2 甾醇側鏈的降解途徑及改造

在好氧微生物中，甾醇C17側鏈的氧化降解始于 P450 酶對膽甾-3-酮-4-烯 C17 側鏈末端 C26 或C27 位的羥基化和連續氧化，在生成膽甾-4-烯-3-酮-26-羧酸后，經?；?CoA連接酶（如FadD19［85］）的催化酯化，生成膽甾-4-烯-3-酮-26-羧酸CoA，隨后進入一種類似于脂肪酸β-氧化降解的過程［66］。在厭氧微生物中，甾醇側鏈的代謝則明顯不同，其降解始于C25 位的羥化［86］，再轉移為 C26 位羥基，隨后才以一種類似于好氧代謝的過程進行［69］。

以谷甾醇為例（圖3），除側鍵末端的氧化反應外，主要由?；?CoA 脫氫、烯酰-CoA 水合、β-羥酰-CoA 脫氫、β-酮酰-CoA 硫解等β-氧化反應組成，經四輪β-氧化，共產生2 分子丙酰CoA 和2 分子乙酰CoA［87］。此外，由于受母核結構的影響，甾醇側鏈β-氧化最后一輪的特異性要顯著高于前幾輪［88-89］。美國石溪大學的Sampson課題組對催化此過程的關鍵酶鑒定和表征做出了重要貢獻［90-92］，由該課題組首先鑒定的操縱子igr，包含了多個影響側鏈最后一輪β-氧化的重要基因，為更好地理解最后一輪β-氧化機制奠定了基礎［93-94］。甾醇C17位側鏈經完全降解生成C17位酮基，該步驟是通過阻斷母核降解生產C19型甾體和A 環降解物等有用產物的重要前提，也是活化后續降解的關鍵步驟。在分枝桿菌和紅球菌中此步反應主要由CYP142 和CYP125 催化完成，二者在側鏈末端上羥后均能繼續氧化生成膽甾-4-烯-3-酮-26-羧酸［95-96］，其中以CYP125 更為關鍵，在該酶發生功能缺失時，菌體可經膽甾-4-烯-3-酮誘導，上調CYP142 的表達，以提高相應的催化能力［96］。鑒于CYP125對側鏈降解的重要性，通過強化表達可提高轉化甾醇生產有用代謝產物的效率［97］。

在阻斷母核降解的同時，針對側鏈降解基因的改造，也可獲得一系列有用的側鏈不完全降解產物，如 4-HBC、1，4-HBC 等 C22型甾體［63］，可用于孕激素、腎上腺皮質激素等甾體藥物的生產。2016 年，在對C22型甾體轉化機制的研究中，一個具有雙功能的短鏈脫氫酶Hsd4A得以鑒定，該酶既具有17β-羥基甾體脫氫酶活性，可轉化AD 生成睪酮，又具有β-羥酰-CoA脫氫酶功能，是側鏈降解第3輪的關鍵酶（圖3）。隨后，通過失活該酶，有效阻斷了側鏈的β-氧化，使甾醇降解被導向“HBC 代謝支路”。先前，HBC 是源于AD 等生產過程的一種副產物，純化難度大，生產成本高。通過對Hsd4A、KstD以及Ksh 基因的組合改造，可分別獲得積累4-HBC、1，4-HBC和9α-OHHBC等代謝產物的工程菌株，有效用于黃體酮等甾體藥物的生產過程。

3.2 甾醇轉化微生物細胞工廠的優化改造

在自然界，分枝桿菌等之所以能有效降解甾醇，一方面是因其內含甾醇降解途徑，另一方面則是得益于菌株的特殊被膜結構［91-92，98-99］。該結構的核心是一層由分枝酰-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖復合體組成的不對稱共價結構，在此之外還分布著一層極性的脂質被膜，包括海藻糖單霉菌酸酯（TMM）、海藻糖雙霉菌酸酯（TDM）及多聚糖等［92］。這種結構既賦予了細胞表面的親脂性，有利于對疏水甾體顆粒的捕捉黏附，但同時也造就了細胞被膜的高度致密性，不利于甾醇分子向胞內的轉運，特別是在AD 等產物過量積累的情況下，分枝桿菌等常通過調整細胞壁的厚度增加致密性，導致甾醇向胞內的轉運效率降低［6，100］。鑒于在甾醇轉化的過程中，通過添加細胞被膜合成相關的抑制劑，可顯著提高細胞對甾醇的攝取效率［52，101-103］。受此啟發，針對性優化改造細胞被膜結構，可開發高效攝取轉化甾醇的微生物細胞工廠。研究表明，膜轉運蛋白MmpL3 參與了分枝桿菌細胞被膜結構的組裝合成［92，104］，通過敲除對應的編碼基因mmpL3，可明顯提高細胞的通透性，增加菌體對甾醇底物的轉化速率［97］。隨后的多項研究表明，破壞分枝菌酸合成的關鍵基因kasB［8］，以及阿拉伯半乳聚糖合成的關鍵基因embC［105］，均可在一定程度上抑制細胞被膜的合成，有效增強分枝桿菌對甾醇類底物的轉化效率，9α-OHAD的產率可增加11.2%～34.5%。

甾醇代謝機制十分復雜，涉及中心代謝、細胞被膜合成和能量代謝等多方面的適應性變化，通過多組學的系統比對，更清晰地了解細胞的生理代謝變化，可為優化甾醇轉化細胞工廠的性能提供更多備選靶點［83，106-107］?；谵D錄組分析發現，SigD 因子的轉錄與分枝桿菌代謝甾醇的過程具有一定的相關性，刪除該基因可顯著提升9α-OHAD 等中間體的生產效率［108］。隨后，通過失活SigD 級聯調控通路上游的調控因子Rip1，獲得了更明顯的產量提升效果［109］。經進一步的分析顯示，此類轉錄因子的失活，影響了菌體被膜合成及代謝相關基因的轉錄，鑒于其對甾醇轉化的促進可能是一種綜合性的表現，相關的代謝機制仍有待深入研究。此外，由于甾醇降解是一個產能過程，以谷甾醇為底物轉化生產9α-OHAD 為例，1 mol 的谷甾醇可產生約 10 mol 的 FADH2和 16～18 mol 的NADH［74］。天津科技大學王敏教授課題組經研究證實，NAD+/NADH 的比率是影響分枝桿菌轉化甾醇的重要因素，通過表達強化NADH 氧化酶等輔因子的手段提高NAD+/NADH比率，維持細胞的氧化還原平衡，可大幅提高菌體對甾醇的轉化［32］。此外，由于甾醇代謝所涉及的輔因子氧化再生等過程，會產生大量的氧自由基ROS，造成嚴重的細胞毒性，降低菌體細胞的生存能力，進而嚴重制約甾醇向甾體藥物中間體的轉化。為此，通過組合強化過氧化氫酶、分支硫醇和麥角硫因這三種抗氧化劑的表達，有效猝滅甾醇降解過程所產生的ROS、維持胞內ROS 水平的穩定，最終使分枝桿菌細胞的存活率提高54.2%，甾醇轉化生成4-HBC的能力提高達47.5%［110］。

綜上，在甾醇途徑改造工程的基礎上，通過對代謝過程中細胞生理的綜合改造，可使微生物細胞工廠具備更好的應用性能。雖然從多角度出發的優化方案，已取得了一定的效果，但這些改造方案的集成和協同機制復雜，有待進行更深入的探索研究，以期能進一步提高工業菌種的生產性能。

4 微生物從頭合成甾體人工路線的創建

當前，普遍使用的甾體藥物，多以天然甾體分子為骨架，經人工半合成而來。因此，如能以微生物為底盤，全合成相關甾體型天然產物，或實現進一步的轉化衍生，則很可能顛覆當前復雜的生產體系，真正實現甾體藥物的綠色生物制造。相對于半合成體系，甾體的生物合成有以下優勢：①無需從動植物提取甾體分子，可徹底解決原料來源不足等問題；②減少重金屬催化劑和易燃易爆有機溶劑的使用，降低反應過程的危險性和污染物排放；③簡化甾體的半合成路線，減少生產步驟，縮短生產周期。以氫化可的松的生產為例，如采用半合成模式，從原料到產品一般需8～10步的轉化步驟，而經人工體系理論上只需1步即可實現氫化可的松的合成［26］。

4.1 甾體的生物合成途徑

在自然界，天然甾體的合成路線大致相同。以三萜合成途徑為基礎，利用環氧角鯊烯為關鍵前體合成甾醇類化合物（圖4），再經氧化、糖化等后修飾，最終生成各種甾型天然產物。在動物體內，甾體由環氧角鯊烯出發經羊毛甾醇、酵母甾醇等中間體轉化合成，并在不同的器官根據機體需要，合成各種內分泌甾體激素（圖5）。在植物體內，往往也能經此途徑合成甾醇，并進一步生成皂苷等甾體次生代謝產物，但除此之外，在植物體內還有一條更為重要的植物甾醇合成途徑，即從環氧角鯊烯出發，經環阿屯醇生成菜油甾醇、谷甾醇和豆甾醇等多種植物甾醇，再生成蕓苔素內酯等植物激素。在真核微生物中，從環氧角鯊烯出發，可通過類似于膽固醇的代謝途徑生成麥角甾醇，再經轉化修飾生成一系列的甾型次級代謝產物［111-112］。具體而言，甾體的生物合成途徑可分為三個模塊：角鯊烯合成模塊、甾醇合成模塊和甾體轉化修飾模塊。

圖4 不同生物體內的甾醇合成路線Fig.4 The biosynthetic pathway of sterols in organisms

圖5 甾體激素生物合成途徑Fig.5 The biosynthesis pathway of steroidal hormones

（1）角鯊烯合成模塊［圖4（a）］［113-114］角鯊烯是一個典型的三萜化合物，其合成過程可細分為兩部分：①異戊烯焦磷酸（IPP，C5）的合成。IPP 是萜類化合物的基本單元，可從乙酰輔酶A 出發由甲羥戊酸途徑（MVA 途徑）合成，或從丙酮酸和甘油醛-3-磷酸出發，通過5-磷酸-D-脫氫木酮糖/2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸酯途徑（DOXP/MEP途徑）合成。②從IPP 至角鯊烯（C30）的合成。IPP在異戊烯基焦磷酸異構酶（IDI）的催化下，可轉化為同分異構體甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP），二者經法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）的催化縮合，可依次形成牻牛兒基焦磷酸（GPP，C10）和法尼基焦磷酸（FPP，C15），隨后2 分子FPP 在鯊烯合成酶的催化下，形成1分子的鯊烯。近期，利用釀酒酵母為底盤，本課題組采用過氧化物酶體區室化策略，結合多酶組裝表達技術，成功構建了一株可高產角鯊烯的酵母平臺，在5 L 生物反應器分批補料的培養條件下，角鯊烯的最高產量可達11.0 g/L［115］。進一步地，通過結合線粒體區室化策略，目前的產量已突破25 g/L，干細胞的角鯊烯含量最高達50%（結果尚未發表）。

（2）甾醇合成代謝模塊［圖（4b）～（e）］［116-118］從角鯊烯出發，經角鯊烯環氧化酶催化生成2，3-環氧角鯊烯，再經環氧角鯊烯環化酶催化，生成三萜甾醇化合物（C30）（一般來說，在動物和真菌中為羊毛甾醇，經修飾轉化為膽固醇或麥角甾醇；在植物中為環阿屯醇，再經衍生為植物甾醇）。由于麥角甾醇、膽固醇和植物甾醇等，在結構和合成路線上的高度相似性，因此可利用含有麥角甾醇合成路線的酵母等真核底盤，對甾醇合成模塊進行改造重建，從而獲得可生產一系列甾醇分子的基因工程菌。2011年，Riezman等在釀酒酵母中通過功能性失活C24位甲基化和C22位脫氫的關鍵酶ERG5 和ERG6，徹底阻斷麥角甾醇的合成，隨后通過引入C7位還原酶基因DHCR7，獲得了可穩定生產菜油甾醇的基因工程菌株。進一步通過繼續引入DHCR24 基因，該課題組成功創建了可穩定合成膽固醇的工程化釀酒酵母［119］。

（3）甾體轉化修飾模塊 從特定的甾醇分子出發，經不同生物差異化的修飾衍生，從而產生了天然甾體的多樣性［120］。例如，在哺乳動物體內，膽固醇可由CYP11A1經三步連續的羥化氧化，使C20—C22 鍵發生斷裂形成孕烯醇酮［121］，此時如再經3β-HSD 的催化，即可生成黃體酮，而孕烯醇酮和黃體酮被運輸至不同腺體后，經C11β、C17α羥基化、C17β酮基還原、C21 側鏈裂解等，又可形成不同類型的甾體激素（圖5）。顯而易見的是，這些修飾酶的工業應用價值巨大，如能高效地實現異源活性表達，則可有效用于甾體藥物的轉化。另外，如利用此類酶組裝級聯反應，對接甾醇合成模塊，即可構建直接合成甾體藥物的細胞工廠。值得一提的是，在動物體內，從膽固醇出發除能轉化合成甾體激素外，還有兩類重要的非激素甾體功能分子，即維生素D3和膽酸。維生素D3是由膽固醇經7位脫氫生成7-脫氫膽固醇再經紫外線照射轉化生成，需經25-羥化酶（CYP2R1或CYO27A1） 以及 1α-羥化酶 （CYP27B1） 的催化，生成其活性形式，即25-羥維生素D3和1，25-二羥維生素 D3［122-123］。 此 外， 維 生素 D3經CYP11A1 的催化，可啟動另一條非典型的活化途徑［123-124］，即在 7-脫氫膽固醇和維生素 D3的 C20 或C22 位發生羥基化，再經CYP27A1、CYP24A1、CYP2R1 或CYP3A4 的選擇性羥基化，從而形成結構多樣的活性維生素D3衍生物［125-126］。膽酸的合成也是由P450 酶所主導，在CYP7B1、CYP8B1和CYP27A1 等的聯合作用下，最終生成膽酸及其衍生物等［127-128］。

基于上述三個模塊的特點，利用微生物底盤創建甾體藥物合成細胞工廠的思路即已非常清晰。①選擇合適的底盤。盡管“角鯊烯合成模塊”普遍存在，但“甾醇合成代謝模塊”通常只存在于酵母和絲狀真菌等微生物中，加之合成的甾體分子為真核來源，因此酵母或絲狀真菌等均可作為候選底盤。②途徑的整體設計與改造。需根據目標甾體分子，選擇具體的甾醇前體，通過對底盤菌麥角甾醇途徑的改造，創建可合成特定甾醇分子的工程菌。③構建“甾體轉化修飾模塊”。該模塊所涉及的P450 氧化酶等，通常難以在微生物細胞高效表達，這也是限制甾體微生物全合成細胞工廠開發的關鍵瓶頸之一。針對此問題，除需加強對已知動植物源P450 酶的工程化表達和優化改造，提出更行之有效的改造策略和方法之外，還可通過加強對微生物源P450 酶元件的挖掘，以取代這些難以表達的真核來源P450酶。

4.2 甾體微生物全合成的進展

隨著合成生物學技術的快速發展，甾體的微生物全合成研究已經取得了多項重要進展。由于釀酒酵母自體擁有麥角甾醇的合成能力，因此可作為從頭全合成甾體的良好底盤。早在1998 年，Pompon 課題組即利用該菌，通過破壞甾醇C22 位脫氫酶ERG5，阻斷麥角甾醇的合成，同時利用引入的擬南芥源C7-脫氫酶、牛源膽固醇側鏈降解酶系統（P450scc、ADR和ADX）等，成功實現了孕烯醇酮的微生物全合成。隨后，借助人源3β-HSD酶的催化，又進一步創建了從簡單碳源到孕酮的人工從頭合成途徑，開創了利用微生物直接合成甾體藥物活性成分的研究［25］。2003 年，在Sanofi-Aventis 公司的資助下，Dumas 等［26］通過向酵母引入多達十余個基因，改變內源的麥角甾醇合成路線，實現了氫化可的松的人工微生物全合成。這兩項工作有力證實了利用微生物從頭全合成甾體藥物的可行性，開啟了甾體綠色生物制造研究的新局面。此后十余年，利用人工生物系統陸續在萜類［129-130］、 糖 苷 類［131-132］、黃酮類［133-134］及有機酸［135-136］等天然產物的合成方面取得了一系列的重要成果，但在利用微生物一步發酵合成甾體藥物（中間體）等領域，突破性進展卻十分有限，一直未見成功的產業化案例，關鍵原因可能在于甾體的合成路線過于復雜，且涉及多步難以有效異源表達重建的P450 酶氧化反應。值得一提的是，2018年，Corinne等基于Dumas的工作，對P450scc、ADX、P450c11 和3β-HSD 等功能基因進行了多拷貝基因整合表達，成功將氫化可的松的產量提升到了120 mg/L［137］，這也是目前歐洲生產氫化可的松的主要路線。

在國內，天津大學的元英進院士課題組，在利用甾醇途徑向下游延伸合成的領域深耕數年，也取得了多項重要進展。2015 年，通過阻斷內源性麥角固醇合成途徑，引入異源24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24，該課題組首次在釀酒酵母實現了從葡萄糖到7-DHC（合成維生素D3的重要前體）的從頭合成［138］。隨后，在先行失活C22 位脫氫酶ERG5 的前提下，通過挖掘鑒定非洲爪蟾等不同來源高活性DHCR7，該課題組利用解脂耶氏酵母底盤建立了菜油甾醇的合成途徑，在以葵花籽油作為碳源時，目標產物菜油甾醇的最高產量可達（453±24.7）mg/L［139］。緊接著，通過進一步強化上游途徑的過氧物酶體?；鵆oA 氧化酶2，同時以具有更高活性的斑馬魚來源DHCR7 替換先前使用的爪蟾DHCR7，使得菜油甾醇的產量被提升至942 mg/L［140］。2019 年，利用上述平臺菌株為基礎，通過引入由CYP11A1、皮質鐵氧還蛋白Adx以及相應的皮質鐵氧還蛋白還原酶AdR 組成一個細胞色素P450 側鏈裂解酶系統，同時結合元器件的適配優化等策略，元英進院士課題組成功創建了一株孕烯醇酮產量為78.0 mg/L 的解脂耶氏酵母工程菌［141］。除此之外，通過失活釀酒酵母的ERG5，使底盤菌積累麥角素-5，7-二烯醇-3β-醇，由此產物出發，借助引入的C24位還原酶DHCR24的催化，鄭裕國院士課題組也于2018 年實現了7-DHC 的微生物全合成［142］。由此可見，近些年國內在甾體活性成分的人工微生物全合成領域，也取得了一系列具有投產潛力的重要進展。然而相比之下，歐美發達國家早在20 多年前即已成功構建了孕酮、氫化可的松等代表性甾體藥物的微生物全合成平臺。因此，作為甾體藥物工業化生產技術的發展趨勢，亟待加強針對甾體藥物人工微生物菌株創建的基礎研發投入，以確保未來我國在此領域激烈的國際競爭中不落下風。

除甾體激素藥物之外，利用微生物合成高附加值的稀有甾體型植物天然產物也備受關注，并取得了十分理想的效果。例如，傳統中藥人參和三七的主要活性成分皂苷Rg1、Rh2及衍生物CK等，具有活血化瘀、預防心血管疾病和抗腫瘤等藥用活性。從人參或三七提取此類皂苷，不僅周期長，產物收率低，提取過程還伴隨產生大量的化學試劑污染等。鑒于此，利用微生物全合成生產甾體皂苷成為一個研究熱點，國內多個課題組在此領域做出了突出貢獻。例如，天津工業生物技術研究所的張學禮團隊在釀酒酵母成功合成了原人參二醇、原人參三醇等高端人參皂苷化合物［143］。天津大學盧文玉團隊利用解脂耶氏酵母為底盤，從木糖出發合成了原人參二醇等［144］。中國科學院分子植物研究中心的周志華課題組，則在甾體皂苷糖苷化修飾基因的挖掘和細胞工廠的優化改造等方面，開展了更為系統而深入的研究，最近該課題組以前期構建的原人參二醇工程酵母為底盤，結合酶工程和代謝工程優化了人參來源的細胞色素P450 酶CYP716A53v2 的活性和表達水平，獲得一株產量可達5 g/L 以上原人參三醇的酵母細胞工廠［145］。隨后，該課題組通過引入從人參和三七中鑒定表征的多功能UGT-糖苷轉移酶，以及擬南芥的UDP-木糖生物合成途徑，將PPT 高效轉化為皂苷Rg1、Ng1和Ng2，產量分別達1.95 g/L、1.62 g/L和1.25 g/L［146］。此外，基于對UDP-糖基轉移酶UGTPg1 的鑒定結果，該課題組于2014 年實現了從葡萄糖到CK 的人工途徑的構建［147］。為有效提高CK 的產量，通過優化UGTPg1 的表達水平，提高UDP-葡萄糖的生物合成，減少UDP-葡萄糖的消耗等，最終使CK 的產量達到了5.74 g/L。這些富有成效的工作，使這些稀有甾體皂苷的產量達到了世界領先水平，為通過微生物全合成法生產稀有的甾體皂苷奠定了基礎［148］。

5 總結與展望

甾體藥物的工業化生產，事關民眾健康等眾多國計民生的保障需求。然而因其獨特的結構和精巧的構型，導致甾體的生產高度依賴于步驟煩瑣、污染嚴重的半合成技術，此為甾體制造成本高居不下的重要原因之一。自1952 年發現微生物轉化可用于甾體的區域和立體選擇性羥基化起，經過近70 年的發展，生物催化轉化已在甾體制造業建立了無法取代的地位。然而現行的“甾醇微生物轉化”半合成工藝，仍嚴重依賴于化學合成，鑒于甾體工業的目標產物大多為自然界已有的天然產物，因此從理論上說，有望升級建立一種以生物轉化為主、化學反應為輔的綠色制造新體系。最近十年，“甾醇微生物轉化”工藝已迅猛顛覆了老舊的“薯蕷皂素-雙烯”體系，下一個十年，或許“甾體微生物全合成”技術又將再次革新甾體制藥行業。值得警惕的是，賽諾菲等制藥公司早在20 世紀90 年代即已開始圍繞“甾體的微生物全合成”布局相關知識產權，目前已擁有數十項專利，如US5635369、US6117649、US10400261B2等。我國在此領域才剛剛起步，大多仍處于跟跑階段，因此需更加積極地應對，以防少數公司在掌握關鍵技術后，對全球甾體制造業進行新一輪的控制，使我國再現“卡脖子”難題。

目前，國外對甾體人工生物合成的研究，多以酵母為底盤，通過改變麥角甾醇途徑生成膽固醇或植物甾醇，再引入動植物源的元器件“仿建天然甾體的合成途徑”。由于元器件數量有限，且缺乏行之有效的異源重構技術等原因，進展異常緩慢。例如，賽諾菲公司針對氫化可的松的從頭生物合成，雖已歷經20 多年的持續研究，最高產量也僅達到110 mg/L（US10400261B2）。作為甾體制造業的主體，清晰的轉化路線和酶催化機制，可為開發“甾體全合成”的微生物細胞工廠提供清晰的藍圖和功能元件。然而有關研究至今尚未取得重大突破，其中的關鍵瓶頸在于“甾體轉化修飾模塊”的創建難度較大，包括用于甾體激素轉化的酶元件，如P450氧化酶等，多來源于動物，數量有限，缺乏其他來源的有效替代品，難以在人工細胞內表達、組裝和優化。針對這些問題，如需推動“甾體微生物全合成”技術的快速發展，可考慮從以下三點開展系統研究：

①甾體轉化修飾途徑的解析和元器件挖掘。通過從植物、微生物和無脊椎動物等來源，分析鑒定更多樣化的甾體轉化元器件及代謝新途徑，改造關鍵元器件的結構與功能，揭示并利用甾體轉化的新機制，為甾體微生物從頭合成的設計與創建提供更多選擇。

②甾體生物合成模塊的設計與改造。依據“一條主途徑多產品衍生”的設計原則，在合適的底盤依次構建“角鯊烯合成”“甾醇合成”“甾體修飾轉化”三大模塊，開發不同甾體骨架的微生物細胞工廠。隨后，根據應用需求，構建即插即用型“甾體轉化衍生”模塊，實現多樣化的甾體生產。同時，還應設計構建與甾體合成相匹配的“能量供給”“代謝流分配”“代謝調控”等輔助模塊。此外，鑒于甾體合成過程的混雜性強、缺乏快速檢測評估的手段等，在途徑創建過程中，應重視多酶組裝、傳感器實時監控、代謝狀態精準分析、轉錄開關精細調控等使能技術，以保障各功能模塊的高效適配組裝。

③甾體從頭合成細胞工廠的創建與優化。酵母和米曲霉等具有較強的麥角甾醇合成能力，操作工具較成熟，可優先作為底盤菌株使用。然而麥角甾醇具有重要的生理功能，其在胞內的合成代謝往往處于一種穩態平衡，難以過量積累。針對此，需通過深入研究相關的調控機制，探索突破穩態調控的有效方法。另外，在“甾醇微生物轉化”體系使用的分枝桿菌內含萜類合成途徑，且具有強大的甾體耐受性和轉化修飾能力，一旦基于該菌構建“甾醇合成模塊”的研究取得突破，即可貫通甾體的生物合成通路。

總體來說，甾體藥物的合成路線較長，調控關系復雜，表達重構難度較大，需更多有效的異源表達新方式及策略支撐。通過創建甾體的微生物合成模式，采用一步發酵，實現從葡萄糖等廉價原料直接合成活性的甾體分子，這必將簡化生產過程、大幅降低三廢排放，真正實現甾體的高端綠色制造。當下，國際競爭加劇，如何通過體系革新，大幅降低生產成本，實現甾體的綠色制造，是行業面臨的共同挑戰，也是決定企業和國家競爭優勢的關鍵所在。我國甾體制藥從業人員應居安思危，致力于開發具有特色的“甾體微生物全合成”技術，以充分保障我國甾體制藥行業健康發展。