人工代謝途徑合成有機醇有機酸的研究進展

曹晨凱，李佳隆，張科春

（西湖大學工學院，浙江省海岸帶環境與資源研究重點實驗室，浙江 杭州 310024）

合成生物學的一個重要目標是優化、重構微生物的遺傳元件，使其能夠滿足人們對目標產物合成的需求。通過基因調控，可將微生物轉變為高效的生物工廠［1］。20 世紀80 年代初，隨著重組DNA 技術的出現，以及人們認識到微生物可以通過基因工程從本質上成為生產燃料和化學品的小化工廠，代謝工程科學因此誕生［1］。代謝工程利用多基因重組技術對細胞代謝途徑進行改造，構建新的代謝途徑生產特定產物。

1 一碳化合物同化途徑

數百年來，通用的石化原料主要為石油與天然氣。如今，全球每年因使用化石燃料產生的二氧化碳的排放量約為70 億噸，過量的溫室氣體排放會引發許多環境問題，例如，海平面上升、熱鹽環流減弱與珊瑚礁系統滅絕等［2-3］。因此，社會各界一直在尋找新綠色原料替代傳統化石原料。其中，以甲醇和甲酸為代表的一碳化合物（C1化合物）具有較大潛力，傳統的甲醇生產工藝是以煤為原料制備合成氣，而甲酸主要由二氧化碳通過高溫高壓、電解與水熱反應轉化而來［4-5］。C1化合物也可以通過綠色低成本的方法制備，例如，在農業、畜牧業與食品加工產業中，產生的有機物廢料經過生物精煉后可轉變為生物甲醇和甲酸［6-8］。然而，目前面臨的主要困難之一是缺少相應的以C1化合物作為原料的生產技術。因此，相比于改造傳統石油化學工藝限制碳排放，合成生物學可以提供一種使用C1原料的思路：改造代謝途徑使微生物能夠同化C1原料，從而以C1化合物作為碳源進行相應目標產物的生產［9-10］。

傳統微生物發酵方法主要以葡萄糖、淀粉等為碳源。要以C1化合物為碳源，主要難點在于絕大部分常見野生型微生物無法大量同化C1化合物，以及甲醛等C1化合物對微生物的毒性會影響其生長。根據近期的發現，異源表達RuMP循環與絲氨酸循環的基因可以使細菌有能力代謝并同化C1化合物及其氧化物［11］。

1.1 核酮糖單磷酸循環

盡管甲基營養菌中用于吸收甲醇的核酮糖單磷酸（ribulose monophosphate，RuMP）循環與典型的磷酸戊糖途徑（HMP pathway）僅3 個酶不同［甲醇脫氫酶（Mdh）、6-磷酸己糖合酶（Hps）和6-磷酸-3-己糖異構酶（Phi）］［12］，但構建一個能有效利用甲醇作為唯一碳源的菌株卻是一個很大的挑戰。1961 年，Quayle 等完成了對于扭脫甲基桿菌AM1（Methylobacterium extorquensAM1）的分離和表征［13］，發現了C1化合物可以通過核酮糖單磷酸循環（RuMP cycle）的方式被吸收利用［14］。圖1（a）描述了RuMP、ED 與EMP 循環同化以甲醇為代表的C1化合物的途徑。在RuMP 循環中，甲醛通過與5-磷酸核酮糖（Ru5P）縮合進入該循環，最終被轉化為6-磷酸果糖（F6P）。隨后F6P 通過Embden-Meyerhof-Parnas 途徑（EMP pathway）和Entner-Doudoroff 途徑（ED pathway）轉化為乙酰輔酶A，進而用于脂肪酸、膽固醇和酮體的合成以支持微生物的生長。近年來，許多在大腸桿菌中重構核酮糖單磷酸循環途徑的相關研究被報道。例如，2016 年，Whitaker 等［15］將來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的NAD+依賴性的Mdh 酶和來自甲醇雙歧桿菌的RuMP 途徑的酶導入大腸桿菌中從而同化甲醇，實驗使用13C 標記（13C-labeling）證實了大腸桿菌菌株可以將甲醇轉化為生物質。同時，Kalyuzhnaya 等［16］發現 RuMP 循環可有效支持微生物生長，這時需要消耗ATP 并在丙酮酸脫羧時生成乙酰輔酶A，從而導致一份C1以二氧化碳的形式損失。因此，當RuMP循環中一份磷酸二羥丙酮磷酸酯生成乙酰輔酶A 時，一份碳單元會損失，導致過程中碳流回收率下降三分之一。對于克隆RuMP循環的微生物來說，僅依靠C1化合物無法有效補充損失的碳流，因此，Kalyuzhnaya 等提出需要進一步重構碳代謝流來保證其高效生長。2018 年，Meyer 等［17］通過計算引導的多重敲除方法來設計可吸收甲醇的大腸桿菌菌株，并實驗證明了在經改造和進化后，菌株在指數增長過程中，甲醇顯著參與到核心代謝中（24%轉化為6-磷酸己糖）。Woolston等［18］實驗發現在大腸桿菌中再生的5-磷酸核糖不足以維持甲醇的同化過程，他們通過表達突變的核糖單磷酸途徑的景天酮糖雙磷酸酶（sedoheptulose bisphosphatase）解決了該問題。2020年，Chen 等［11］以代謝穩健性為標準對大腸桿菌基因進行了重排，經人工進化后得到了可有效利用甲醇作為唯一碳源的菌株，該甲基營養型大腸桿菌可以8 h的倍增時間生長，得到較高OD。通過RuMP循環，改良后的工程菌可脫離傳統的葡萄糖碳源生長模式，單一使用以甲醇為代表的C1化合物，在合成醇類等高附加值的有機物方向上，展現出一定的潛力。

圖1 RuMP途徑、ED途徑、EMP途徑（a）和絲氨酸循環（b）［19］Fig.1 C1 compound assimilation through ribulose-5-phosphate(RuMP),ED(Entner-Doudoroff),EMP(Embden-Meyerhof-Parnas)pathway(a)and serine cycle(b)[19]

1.2 絲氨酸循環

絲氨酸循環（serine cycle）是一條經自然進化形成、對氧氣供應不敏感的代謝途徑，如圖1（b）所示。絲氨酸循環通過絲氨酸羥甲基轉移酶固定由5，10-亞甲基四氫葉酸攜帶的C1化合物；其碳同化過程經歷二碳、三碳、四碳代謝過程最終生成乙酰輔酶A。其中，二碳代謝過程為乙醛酸通過轉氨過程轉化為甘氨酸；三碳代謝過程為甘氨酸轉化為絲氨酸并進一步脫水轉化為磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）；四碳代謝過程為PEP 進一步羥化生成草酰乙酸（OAA），隨后分裂為兩個二碳單元完成循環并輸出最終產物乙酰輔酶A。因此，絲氨酸循環可以從多組C1化合物合成乙酰輔酶A 而不會造成碳損失。2018 年，Yu 等［19］發現僅構建 RuMP 循環很難支持微生物在只有C1化合物的環境下生長，為了補充碳流，他們在大腸桿菌中表達了改進的扭脫甲基桿菌AM1 中的絲氨酸循環，使得改良后的工程菌能夠同化C1化合物，從而提高了乙酰輔酶A 的產量。然而，對于絲氨酸循環循環系統，每生產一份乙酰輔酶A 需要消耗3個ATP分子。這降低了生物質和產量，因為大部分C1底物需要被氧化以產生所需的ATP 而不是被同化為生物質。因此，對于使用絲氨酸循環同化C1化合物的微生物來說，仍需要關注優化ATP 補充從而達到高效生長與生產。

1.3 其他同化一碳化合物的天然途徑

除了RuMP 循環及絲氨酸循環外，一些甲酸、甲烷營養菌中還存在著同化一碳化合物的其他天然途徑［20］。例如Methanococcus maripaludis在利用二氧化碳或甲酸生產甲烷的過程中存在一個中間體甲基THMPT，甲基THMPT 會在一氧化碳脫羧酶/乙酰輔酶A合酶復合物的幫助下結合一個CO和一個 CoA 直接合成乙酰輔酶 A［21］。又比如Cupriavidus necator可以利用 1，5-二磷酸核酮糖（ribulose-1，5-bisphosphate，RuBP）結合二氧化碳，在1，5-二磷酸核酮糖羧/加氧酶的作用下轉化成磷酸甘油醛［22］。由于提供的能量和還原力的不足，想要利用這些途徑同化一碳化合物進行生產難度很大。

1.4 以C1化合物作為底物進行生產

通過RuMP 或絲氨酸循環，可以形成一個C1化合物為底物的同化平臺，從而改進傳統的化學合成工藝。例如，甲基營養型大腸桿菌在生物燃料方面可成為一個有潛力的工程菌株。通?；瘜W合成方法需要復雜的反應條件，使用C1化合物建立碳碳鍵的化學方法需要高溫和高壓［23］，建立這樣的反應條件往往伴隨著巨大的投資，反應時使用的物料也通常為具有高碳排放量的化石燃料。相反，生物合成的反應條件則更溫和，改良后的工程菌利用絲氨酸循環、RuMP 循環及甲醇縮合循環將C1化合物導向其他代謝途徑并最終轉化為相應產物，例如，碳鏈更長的化合物、氨基酸、代謝中間產物等。采用重新設計代謝系統的方法來改造微生物，可以提高產量和生產率，從而大幅度降低對原材料需求、工廠規模與運營成本［24］；相較于傳統方法，這種新的碳循環在使用成本與環境保護方面更具潛在優勢。目前通過甲基營養型大腸桿菌合成特定化合物仍然是一個挑戰，表1總結了目前由甲基營養性菌發酵生產的特定有機醇與有機酸的產量與方法，例如丁醇、甲羥戊酸（MEV）、γ-氨基丁酸（GABA）、2-羥基異丁酸、3-羥基異丁酸、D-乳酸等。其中，甲羥戊酸是萜類化合物的重要平臺化合物［29］；其中，GABA 在哺乳動物中充當主要的抑制性神經遞質，并參與控制神經元的生長和成熟。是作為調節GABA-谷氨酸平衡紊亂的重要治療藥物［31］。然而，目前可同化甲醇的天然微生物的代謝途徑同樣涉及二氧化碳的損失或ATP 的消耗［32］。因此，當克隆RuMP和絲氨酸循環時仍然需持續優化碳流以提高效率。實驗發現雖然大腸桿菌通過基因克隆的方法能以C1化合物作為唯一碳源生長，但一些氧化型的C1化合物如甲醇、甲醛等對于微生物存在一定毒性。當微生物生長進入平臺期時，過量存在的C1化合物會引起DNA-蛋白質交聯（DNA protein crosslinking）［11］。若使用這類甲基營養性大腸桿菌進行工業化生產，仍需提高其對C1化合物的耐受性。2018 年，Cui 等［29］通過對 α-變形桿菌甲基桿 菌 AM1 （α-proteobacteriumMethylobacterium extorquensAM1）使用自適應實驗室進化（ALE，adaptive laboratory evolution）的方法提高了甲基營養性菌對甲醇的耐受性，同時得到了2.27 g/L 甲羥戊酸（MEV）的產量。同樣，微生物對發酵產物的耐受性也可以嘗試通過類似ALE的方法提高［26］。雖然利用C1化合物平臺生產有機醇與有機酸仍然具有挑戰性，但這項工作為微生物固碳提供了思路與可能性。

表1 由甲基營養性菌發酵生產特定有機醇與有機酸實例Tab.1 Summary of methylotrophic production data

2 木糖代謝途徑為代表的非磷酸化途徑

2.1 木糖的代謝途徑

木質組織中的半纖維素是地球上最豐富的生物質資源之一，與生產第一代生物燃料的原料玉米、甘蔗相比，半纖維素可以很好地緩和“糧食與燃料沖突”的問題［33-34］，因此，由可再生半纖維素生物質生產的第二代生物燃料有希望作為常規化石燃料的可持續替代品［35-38］。半纖維素水解的主要產物是葡萄糖和木糖，雖然木糖是植物細胞壁中含量第二高的糖，占木質生物質總碳水化合物的35%，但是由于存在葡萄糖的代謝阻遏，在利用葡萄糖和木糖同時發酵時，即使使用高濃度的木糖，其利用率仍然很低。而木質纖維素水解液中往往是混合糖體系，這種低效發酵的問題限制了木質生物燃料的商業生產，是利用木糖作為發酵原料需要面臨的重大挑戰。木質纖維素水解體系中還常帶有弱酸、呋喃、苯酚和醛等副產物，對菌株生長有明顯的抑制作用［39］，因此開發對抑制劑有高耐受性的菌株也是一個很有潛力的方向。最近，Li 等［40］利用適應性進化的方法提高了菌株對抑制劑的耐受性，并且進一步提高了木糖的利用率；Liu 等［41］則通過雜交的方法使木糖發酵菌株獲得了對抑制劑的耐受性。

自然界中至少存在以下5 種木糖的代謝途徑（圖2）。在大腸桿菌（Escherichia coli）中［42-43］，木糖首先被木糖異構酶（XylA）異構化成為木酮糖，通過木酮糖激酶（XylB）磷酸化成為5-磷酸木酮糖（X5P）后進入磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway），其下游的6-磷酸果糖（F6P）和3-磷酸甘油醛（G3P）均可通過糖酵解途徑（glycolysis）進入三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）。在丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中還存在磷酸轉酮酶途徑（phosphoketolase pathway）［44-45］，能將5-磷酸木酮糖裂解為乙酰磷酸（acetyl-P）和3-磷酸甘油醛。在釀酒酵母及某些真菌中［46］，木糖的異構化分為兩步，首先由木糖還原酶還原成為木糖醇（xylitol），再經過木糖醇脫氫酶氧化生成木酮糖，最后由磷酸化途徑進入磷酸戊糖途徑。以三羧酸循環的關鍵中間產體α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，2-KG）作為衡量標準，以上的木糖磷酸化途徑均需要10個以上的酶促反應，且最終2-KG 的理論摩爾產率也僅有83%。第4種途徑是Weimberg途徑，這是一種非磷酸化的途徑，最早由Weimberg［47］于1961年在脆弱假單胞菌（Pseudomonas fragi）中發現。木糖首先由木糖脫氫酶（XylB）脫氫生成木糖醇內酯，再由木糖醇內酯酶（XylC）開環生成木糖酸，木糖酸被木糖酸脫水酶（XylD）脫水生成2-氧代3-脫氧木糖酸，后者經過2-氧代-3脫氧木糖酸脫水酶（XylX）進一步脫水生成2-酮戊二酸半醛，最后經過2-酮戊二酸半醛脫氫酶（XylA）脫氫生成2-KG。該途徑僅通過5 個酶促步驟就能將木糖以100%的理論產率生成2-KG。第5 種途徑是 Dahms 途徑，1974 年，Dahms［48］在一種未分類的假單胞菌中發現其包含了D-木糖脫氫酶、D-木糖醛酸脫水酶和一種新的醛縮酶（YghH/YagE），該酶可以將2-氧代-3脫氧木糖酸裂解為丙酮酸和乙醇醛。該途徑在2-氧代-3-脫氧木糖酸處與Weimberg途徑分開，經脫羧酶裂解后生成丙酮酸，丙酮酸脫羧后生成乙酰輔酶A 進入TCA 循環。對比這5種途徑，非磷酸化途徑顯然較磷酸化途徑步驟更少，理論內源代謝中間體2-KG 的產率更高，因此，開發非磷酸化途徑在生物生產中具有可觀的潛力［49］。

圖2 不同微生物的木糖代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways of xylose in different microorganisms

2.2 釀酒酵母及運動發酵單胞菌在木糖發酵方面的研究進展

釀酒酵母具有耐酸、穩健性好的優點，適合工業化發酵，是一種重要的真核模式生物［50］。酵母利用木糖發酵的研究主要集中在酵母自身的還原-脫氫酶途徑，以及外源表達的異構酶途徑這兩個方面［51］。前者由于木糖還原酶需要輔因子NADPH 而木糖醇脫氫酶需要輔因子NAD+，該途徑的過表達會導致輔因子失衡。為解決這個問題，改變木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的輔因子偏好，調整它們的表達水平，操作內源性氧化還原酶的途徑和引入異源NADH 依賴的反應等方式都是可行的策略［52-53］。Zha 等［54］通過進化工程，提高了利用還原-脫氫酶途徑從木糖發酵生產乙醇的產量。后者的木糖異構酶在催化反應時具有一步轉化、不依賴輔因子的優點，而且不會積累木糖醇，在生產乙醇時更有優勢。然而只有少數異源木糖異構酶可以在釀酒酵母中功能性表達，而且酶的活性普遍偏低，篩選出高活性的木糖異構酶是該途徑面臨的一個瓶頸問題。最近，Hou 等［55］及Katahira 等［56］在牛瘤胃和昆蟲腸道內容物的基因組文庫中鑒定出了具有高體內活性的木糖異構酶。在近幾十年中，一些工程菌株在纖維素水解物中的發酵性能通過各種工程方法得到顯著增強［57-59］。然而，低效的木糖轉運、葡萄糖的代謝阻遏、下游途徑效率低等都是限制木糖發酵的因素，因此設計沒有葡萄糖抑制的木糖轉運蛋白或者克服葡萄糖的代謝阻遏進一步提高葡萄糖和木糖共同發酵時的利用率是開發釀酒酵母轉化木糖的一個重要方向［60-62］。Zha 等［63］在釀酒酵母中外源表達了來自的Neurospora crassa的編碼纖維糊精轉運蛋白的CDT-1基因，細胞內β-葡萄糖苷酶的GH1-1基因和來自Scheffersomyces stipitis的編碼木糖還原酶的XYL1基因，減輕了葡萄糖的抑制。

運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）比釀酒酵母有更高的乙醇耐受性，而且發酵時的碳源轉化率很高，也是發酵乙醇的常用菌種。雖然運動發酵單胞菌本身沒有木糖代謝通路，但是可以通過異源表達木糖代謝途徑的方式來克服。運動發酵單胞菌以木糖和葡萄糖的混合物作為原料發酵時，木糖代謝途徑同樣會受到葡萄糖的抑制。為解決葡萄糖的抑制問題，Dunn等［64］構建了減輕葡萄糖代謝阻遏的工程菌株，減少了木糖醇的產量從而改善木糖的發酵效率。除了抑制問題，木糖的運輸也是阻礙運動發酵單胞菌有效利用木糖的瓶頸問題。據報道，野生運動發酵單胞菌運輸木糖用的是GLF（葡萄糖促進擴散蛋白），該蛋白對葡萄糖具有更高的親和力而導致葡萄糖對木糖的競爭性抑制［65］。Dunn 等［65］高表達異源的木糖轉運蛋白，Young 等［66］改造己糖轉運蛋白以增加該蛋白對木糖的親和力，從木糖轉運的角度入手，分別提高了木糖在運動發酵單胞菌和酵母中的利用率。最近，Sarkar 等［67］利用ALE 方法得到了比親本利用率高1.65 倍的進化菌株，并且在此基礎上引入木糖轉運蛋白，得到了在用雙糖發酵的條件下，木糖比利用率［2.04 g/（g·h）］與葡萄糖［2.49 g/（g·h）］相當的菌株，產物乙醇滴度也達到了47.4 g/L［68］。

2.3 木糖非磷酸化代謝途徑的研究進展

Tai等［69］利用木糖非磷酸化途徑在大腸桿菌內構建了阿拉伯糖和半乳糖醛酸的非磷酸化途徑。通過敲除編碼異檸檬酸脫氫酶的基因（ICD）以切斷2-KG 的供應，從而構建α-酮戊二酸營養缺陷型的菌種作為篩選平臺，在該菌中轉入Weimberg 途徑相關的酶可以篩選對D-木糖、L-阿拉伯糖和D-半乳糖醛酸利用率更高的菌株。同時利用該平臺從Burkholderia xenovorans菌中鑒定出了一個活性更強的非磷酸化木糖操縱子。這是首次在大腸桿菌內通過完全非磷酸化途徑將D-木糖、L-阿拉伯糖和D-半乳糖醛酸同化為生物燃料的報道。Liu等［70］也通過6 個酶促反應實現了從木糖到1，4-丁二醇的生產途徑。Wang等［71］在此基礎上引入二醇脫水酶來優化2-KG 下游生成1，4-丁二醇的途徑，從木糖出發從頭合成了209 mg/L的1，4-丁二醇。Wang等［72］在大腸桿菌中利用該途徑最終實現了3，4-二羥基丁酸的生產。盡管這些非磷酸化代謝途徑僅僅經過不到6個酶促步驟，且理論摩爾產率都高達100%，但非磷酸化代謝途徑的生物合成效率仍然不是很理想。

為解決木糖低效發酵的問題，Wang等［73］研究了其中3 種木糖代謝途徑，發現異構酶途徑和Weimberg 途徑之間存在協同作用。前者雖然生產2-KG 效率低下但是能夠提供足量的乙酰輔酶A，而后者恰恰相反。他們證明兩種途徑在前體供應中是相互補充的。以戊二酸作為終產物，發現單獨使用異構酶途徑和Weimberg 途徑時戊二酸的產量僅104 mg/L 和209 mg/L，而結合使用兩種途徑時戊二酸的產量達到了602 mg/L，甚至超過了從葡萄糖代謝途徑獲得的戊二酸產量（420 mg/L），該項工作提供了一種提高木糖代謝效率的新穎策略。Bai 等［74］針對 D-木糖和 L-阿拉伯糖篩選了最有效的轉運蛋白，合成了高效的木糖操縱子，利用非磷酸化途徑實現了中康酸的高產合成，該工作表明運輸系統可能是非磷酸化代謝途徑利用過程中的限速步驟之一。

自20 世紀中葉以來，非磷酸化代謝一直未見廣泛應用。得益于新平臺的開發，更多的非磷酸化基因簇得以確定，這也擴大了可利用代謝途徑的數量。并且，這些酶中的許多酶尚未經過蛋白質工程研究或選擇性進化，因此在未來有很大的發展空間。使用半纖維素等生物質作為發酵原料，實際上為微生物提供了一種混雜多種糖的發酵體系。在該體系中，理想狀態下葡萄糖主要用于細胞生長，而木糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸則直接用于產品生產。引入非磷酸化代謝是提高糖利用效率的一種方法，但是需要將這些屬性與菌株工程結合起來，以提高菌株對半纖維素生物質水解產物中存在的抑制物（例如乙酸）的適應性［75］。

3 酮酸/氨基酸途徑

3.1 Ehrlich 途徑

酵母和乳酸菌在食品發酵中除了生成乙醇，還常常伴隨著脂肪醇和芳香醇的形成，這些物質被稱為雜醇，發酵食品獨特的風味和香氣正是由此而來［76］。這些雜醇的代謝途徑由Ehrlich 首次提出［77］：最開始氨基酸在轉氨酶的作用下生成α-酮酸，由于這些α-酮酸不能重新定向到中心代謝中去，在被排除體外之前經由Ehrlich 途徑的脫羧酶脫去CO2成為對應的醛，而后經還原成為雜醇或進一步氧化得到相應的雜酸。

上述步驟中的脫羧不可逆，是該途徑的決速步驟。釀酒酵母中的5 個脫羧酶基因（PDC1、PDC5、PDC6、ARO10和THI3）中，前 3 個編碼丙酮酸脫羧酶［78-80］。Vuralhan 等［81］發現在釀酒酵母中ARO10是唯一的適用于Ehrlich 途徑的脫羧酶基因，其轉錄譜與培養物中的β-酮酸脫羧酶活性密切相關；他們運用遺傳、生理和生化方法對Arop10p 進行全面表征，證實其是一種具有廣泛底物特異性的脫羧酶［82］。Iraqui 等［83］發現ARO80的36bp 上游激活序列對于促進芳香族氨基酸轉錄誘導是必要且充分的，證明Aro80p 是介導芳香族氨基酸轉氨酶和脫羧酶的轉錄激活因子。Mojzita等［84］證明Thi3p 參與釀酒酵母中硫胺素穩態的調節，而且與 Pdc1p、Pdc5p、Pdc6p 和 Aro10p 定位在細胞質內不同，Nosaka 等［85］觀察到 Thi3p 定位在細胞質和細胞核中，證明Thi3p 可能起調節作用而非催化作用。在乳酸菌中KCDA編碼一種β-酮酸脫羧酶，被證明也具有廣泛的底物特異性，且對支鏈α-酮酸表現出的活性最高［86］。

3.2 酮酸途徑

然而，天然的Ehrlich 途徑合成的雜醇濃度較低，不適用于生產。為了探究該途徑用于生產的潛力，Atsumi等［87］在2008年開發了一種通過酶的組合和優化來生產C3～C5醇類的策略。該策略合成醇的路徑首先是將2-酮酸通過2-酮酸脫羧酶（KDC）脫羧轉化為少一個碳原子的醛，然后通過醇脫氫酶（ADH）還原為醇（圖3）。由于脫羧酶在植物、酵母和真菌中常見，而細菌中很少見［88］，他們篩選了來自釀酒酵母、乳酸菌和丙酮酸梭菌內的5 種KDC，結果證明來自釀酒酵母的ARO10和來自乳酸菌的KIVD 具有較好的脫羧活性和較寬的底物范圍，且KIVD 的催化活性更高。通過KIVD，合成了1-丙醇、1-丁醇、異丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和 2-苯基乙醇。3-甲基-1-丁醇［89］、異丁醇［90］和 2-甲基-1-丁醇［91］的生產也在此基礎上進行了優化。

圖3 酮酸/氨基酸途徑合成醇、二醇Fig.3 Ketoacid/amino acid pathway for production of alcohol and diol

Zhang 等［92］通過設計 2-異丙基蘋果酸合酶的鏈延伸活性，從而合成碳鏈更長的酮酸，這個鏈延長的反應來自于亮氨酸的生物合成，其作用是將酮異戊酸轉化為酮異己酸。這項研究發現僅僅突變反應的第1 個酶2-異丙基蘋果酸合酶是必需的，隨后的酶由于其非特異性催化的特點可以接受更大的底物，然后再基于上述的酮酸途徑，構建了生產C5～C8的長鏈醇的代謝通路。

除了醇之外，酮酸途徑還能用來生產羧酸。Xiong 等［93］通過對2-酮酸脫羧酶的工程選擇性和對雜合醛脫氫酶的篩選，構建了同時產生C5和C6酸的合成途徑。特別地，異戊酸的產量達到32 g/L（0.22 g/g的葡萄糖產率），達到了理論產率的58%。

3.3 氨基酸途徑

氨基酸生產方法主要有蛋白質水解、化學合成及微生物發酵。隨著技術不斷革新，氨基酸的市場份額也逐年增長。Wendisch 等［94］預計全球氨基酸需求在2017—2022 年期間將以5.6%的年增長率增長，到2022 年將達到256 億美元，其中動物飼料氨基酸為增長最快的市場。各種氨基酸中年產量最高的谷氨酸在2020 年的年產量高達321萬噸。

由于酮酸途徑本身建立在氨基酸合成途徑上，而氨基酸作為蛋白質的基本組成單位，也是幾乎所有微生物的主要內源性代謝產物之一，故氨基酸途徑具有很好的生物體相容性，利用氨基酸途徑在諸如酵母/枯草芽孢桿菌和熱纖梭狀芽孢桿菌內的工作也都有報道［95-97］。

基于氨基酸的代謝，類似3.2 節中的酮酸途徑，Wang 等［98］于 2020 年提出了一種合成 C3～C5ω-二醇的策略：首先將帶電氨基酸α位的羧基由脫羧酶脫去得到ω-氨基酸或者ω-二胺，然后通過氧化還原反應將氨基和羧基轉化為ω-羥酸，最后經過一步酶促反應還原ω-羥酸生成ω-二醇（圖3）。這項工作中不僅提供了直接從7種氨基酸合成C3～C5ω-二醇的平臺，也驗證了從糖到二醇途徑的可行性。由于CAR 對ω-羥酸的高效催化，使得上游氨基酸到ω-羥酸的步驟是這一途徑的瓶頸，為進一步改善該平臺的實用性，需對上游通路進行優化?？尚械氖侄沃饕校和ㄟ^進行其他遺傳操作提高微生物宿主中的氨基酸通量；或者直接將宿主替換為成熟的氨基酸高產菌株（如谷氨酸棒狀桿菌）實現；篩選更加高效的代謝酶來消除瓶頸。

除此之外，帶電氨基酸作為原料也被報道用于生產ω-羥酸、二羧酸、二胺和內酰胺等［99-100］。例如，Yu 等［101］過量表達來源于共生梭菌（Clostridium symbiosm）的2-羥基戊二酸脫氫酶基因（HGDH）、2-羥基戊二酰輔酶A 脫水酶基因（HGDAB）、谷氨酸輔酶A 轉移酶基因（GCTAB）和酸性氨基球菌（Acidaminococcus fermentans）的2-羥基戊二酰輔酶A 脫水酶基因（HGDC）構建了谷氨酸生物合成途徑，通過表達來自密螺旋體（Treponema denticola）的混雜反式雙鍵-CoA 還原酶基因（TER）和大腸桿菌的硫酯酶基因（TESA）成功生產了戊二酸。值得注意的是，與之前的酮酸途徑、氨基酸途徑不同，該途徑中沒有CO2損失，具有100%的碳效率。然而，該途徑的一個缺點是由于2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶的氧敏感性，其僅在厭氧條件下有生物活性。為了解決這個問題，厭氧誘導的NAR的啟動子被選用于表達編碼2-羥基戊二酰輔酶A 脫水酶及其激活因子的HGDABC基因，通過好氧-厭氧兩階段法生長得到的菌株可產生0.0116 g/L的戊二酸［102］。

4 β-氧化逆循環途徑

4.1 β-氧化途徑

β-氧化（β-oxidation，BOX）是生物體內代謝脂肪酸的常見代謝途徑［103-104］。首先脂肪酸由?；o酶A合成酶活化生成?；o酶A硫酯；然后，酰基輔酶A 脫氫酶使用FAD 將?；o酶A 硫酯氧化為β-反式烯酰基輔酶A；接著通過烯?；o酶A 水合酶將其加成為3-羥基酰基輔酶A；3-羥基?；o酶A 經由其脫氫酶氧化為3-氧代?；o酶A；最后經由相應的硫解酶分解成乙酰輔酶A 和碳原子減少2的?；o酶A。

4.2 β-氧化逆循環

利用β-氧化循環的逆途徑可以構建許多生產特定產物的平臺［105-109］。Dellomonaco 等［110］證明BOX 的逆循環途徑（reversal ofβ-oxidation pathway，RBO）可用作合成直鏈醇、脂肪酸、1，3-二醇、3-羥基羧酸、3-氧代醇、3-氧代酸、反式-2-烯醇、反式-2 烯酸的代謝平臺（圖4）。他們首先敲除編碼分解代謝物阻遏因子Crp、全局調節蛋白ArcA 的基因，解除了其對β-氧化作用的調控，再通過引入乙酰乙酸代謝調劑蛋白AtoC 和脂肪酸代謝調節蛋白FadR 的突變體，實現了編碼大腸桿菌β-氧化循環的Fad 和Ato 調節子的組成型表達。另外，敲除了消耗乙酰輔酶A 并產生乙酸、乙醇和琥珀酸的競爭途徑。由于天然的3-氧代?；?CoA硫解酶是限速步驟，過表達編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶（途徑起始）和L-1，2，2-丙二醇氧化還原酶（用于將丁醛轉化為正丁醇）的天然YQEF和FUCO基因。由此生產了14 g/L 的正丁醇，每克葡萄糖的產量為0.33 g 的正丁醇。基因敲除和基因互補實驗表明，YqeF（乙酰乙酰輔酶A 硫解酶）、FadB（3-羥?；o酶A 脫氫酶/烯酰輔酶A水合酶）和YdiO（潛在的輔酶?；o酶A 脫氫酶）主要催化反向β-氧化循環的反應。因為起始碳鏈和增長單元都由乙酰輔酶A 提供，故Dellomonaco 等檢測到的直鏈醇和長鏈脂肪酸都含有偶數個數的碳原子。在補充丙酸作為碳鏈的起始分子時，則可以檢測到碳鏈數為奇數的脂肪酸。

圖 4 β-氧化逆循環［110］Fig.4 Reversal of β-oxidation[110]

Clomburg 等［111］利用硫解酶（BktB）和硫酯酶（YdiI）結合其他β-氧化逆循環相關的酶構建了RBS，并構建了基于cumate 誘導的表達雙鍵還原酶的體系，從而建立了能夠生成C6～C10羧酸的平臺。在此基礎上額外表達不動桿菌SE19 的ChnD、ChnE 以及AlkBGT 對產物進一步氧化，也為合成ω官能化羧酸如羥基酸、二元酸等提供了途徑，使產品進一步多元化。例如，Clomburg等［111］通過過量表達Cupriavidus necator的硫解酶（BktB）大腸桿菌的雙功能3-羥?；?CoA 脫氫酶/脫水酶（FadB）和反式雙鍵-CoA 還原酶（Ter）在大腸桿菌內構建了β-氧化逆循環。在此基礎上，通過異源表達烷烴單加氧酶、醇脫氫酶和醛脫氫酶實現了ω-氧化，在大腸桿菌中從甘油生產了0.17 g/L的1，6-己二酸。

Cheong等［112］發現，除了乙酰輔酶A以外，丙?；o酶A和乙醇酰輔酶A均能夠用作鏈增長單元參與β-氧化逆循環，他們將這些單元與不同的底物結合使用，從該途徑中生產了高達18 種不同的化合物。這也為該途徑用于合成特定非天然產物提供了生產策略。

相較于脂肪酸合成途徑［113-114］，β-氧化逆循環途徑在合成正構醇時更有效率。前者低效率的原因在于合成丙二酰-ACP，2個碳原子供體用于鏈延長以及酰基-ACP 中間體使用時，均需要轉化為游離酸并且再?；?，然后才能還原為醇，這些步驟都是ATP 消耗的步驟，所以前者能量的利用效率不高。

5 聚酮化合物合酶途徑

5.1 PKS的種類及Ⅰ型PKS的反應機理

PKS 是聚酮化合物合酶（polyketide synthase pathway），一共分為3 種類型，Ⅰ型PKS 是具有催化能力的結構域構成模塊組合成的大合酶［115］。典型的Ⅰ型PKS最少包含一個負責建立單體選擇和負載的?；D移酶（AT）域，一個帶有40 個磷酸鳥嘌呤臂來攜帶新生聚酮鏈的?；d體蛋白（ACP）域和一個酮合酶（KS）催化脫羧克萊森縮合反應以延長碳鏈的結構域。PKS巨合酶也可能包含幾個可選的催化結構域，例如酮還原酶（KR）、脫水酶（DH）、烯酰還原酶（ER）和甲基轉移酶（CMT）。這些模塊順序組合在一起，可以單向或者迭代地連接各種?；o酶A的鏈增長單元。Ⅱ型PKS最少包含兩個酮合酶異二聚體（KS的α-亞基和β-亞基）和一個ACP結構域，主要催化芳香聚酮化合物的生物合成［116］。Ⅲ型PKS 結構簡單，是一種能夠重復使用的酮合酶（KS），該單一的KS域可以執行Ⅰ型和Ⅱ型PKS基本域的所有功能［117］。

3 種 PKS 中對Ⅰ型 PKS 研究最為深入［118］。類似于脂肪酸的生物合成，PKS 在負載了?；?ACP中間體和?；o酶A 單元之間進行克萊森縮合反應，然后通過輔助結構改變β-羰基的還原度，聚酮化合物通過KS 的巰基接受上游的ACP 的硫酯，進行的硫酯交換反應從上一個模塊轉移到下一個模塊，最后通過硫酯酶（TE）結構域將聚酮化合物從裝配線中釋放出來，隨后通過下游的酶進行后修飾，從而可以生產具有復雜結構的多種產品（圖5、圖6）［119-122］。

圖5 Ⅰ型PKS裝配線Fig.5 Assembly line of type Ⅰpolyketide synthase

圖6 以合成己二酸為例的PKS途徑Fig.6 PKS pathway for production of adipic acid

5.2 PKS產物多樣性的探索

天然PKS產物的多樣性主要來自于不同的氧化過程、環化方式以及后續的PKS 修飾。天然的AT結構域的底物通常為丙二酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A，極少數情況下為乙基丙二酰輔酶A。Kalkreuter 等［123］對吡咯霉素 PKS 最后兩個模塊的AT結構域進行活性位點突變，改變了其對底物的選擇性，使其能夠特異性結合非天然的鏈增長單元（丙二酰類似物），首次合成了帶有兩個非天然鏈增長單元的全長聚酮化合物。Eng 等［124］使用含有混雜負載AT 的脂霉素合酶作為模型，在合成短鏈β-羥基酸的時候通過KR 交換將α-甲基的立體化學變化由反式變為反式。Zargar 等［125］重新設計了部分還原的PKS模塊，通過還原回路的交換產生飽和的β-碳，在這項工作中他們使用鏈霉菌J1074 產生了165 mg/L的短鏈脂肪酸（2，4-二甲基戊酸）。Lünne等［126］在Claviceps purpurea中過表達聚酮化合物合酶的基因PKS7，生產了檸檬酸、檸檬酸乙酯等產品。Hagen 等［127］提出了一種通過質譜監測的方式來對每個模塊執行的化學反應進行表征，從而能有效指導組裝PKS的功能系統。他們在一個PKS中的擴展模塊部分引入了多種PKS 簇的異源還原結構域，通過篩選的方式得到了一個能夠將琥珀酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 合成己二酸的PKS。這些工作很大程度上擴展了PKS平臺的綜合潛力。

6 總結與展望

本文描述了構建人工代謝途徑以實現生物合成有機醇和有機酸的一些進展。

雖然甲醇這類一碳有機物可從二氧化碳或者農業食品加工業的廢料之中制備，成本較低，在大腸桿菌內構建RuMP循環為異養微生物固碳、有機廢料再利用提供了一種新的策略。但由于除扭脫甲基桿菌以外的多數菌對甲醇不耐受，利用甲醇作碳源進行生物發酵仍然是一個巨大挑戰。

木糖廣泛存在于農林業廢棄物中，利用木糖作為發酵原料也是一直以來研究的熱點。木質纖維素水解產物用于發酵時混合糖對木糖利用率的抑制以及水解產物中對微生物的抑制物問題是該途徑面臨的一個挑戰。木糖的非磷酸化途徑酶促步驟少，碳原子的理論利用率高，將非磷酸化代謝引入宿主的代謝網絡有望提高木糖的代謝效率。

有機醇和有機酸是常見的生物燃料和重要的化工原料，其中乙醇是目前常見的生物燃料［128］，然而，隨著技術進步，生產具有更好的燃燒性能的長鏈醇及脂肪酸替代乙醇將是未來生物質能源的一個重要方向。近期報道中利用酮酸或氨基酸途徑生產醇、二醇和脂肪酸的平臺生產產率仍然較低，其商業化仍然面臨著酶催化活性低、代謝通量不足等挑戰。但這些平臺的出現擴大了產物的多樣性，并為有機酸和有機醇的工業化生產提供了新的思路。

近年來人們通過表達編碼?；?ACP 硫酯酶的異源基因，借由脂肪酸合成途徑來生產游離態脂肪酸。但是由于脂肪酸合成途徑遵循FAS 絡合物的重復循環催化，因此直接合成某個特定產物極具挑戰性。對比脂肪酸合成途徑，β-氧化逆循環途徑中由3-氧代?；o酶硫醇酶催化的用于鏈延長的非脫羧性克萊森縮合反應直接消耗了乙酰輔酶A作為延伸單元。因此，β-氧化逆循環途徑的應用規避了乙酰輔酶A 的耗能的羧化步驟，具有能量和還原當量利用率高的優點。目前為止，該途徑應用面臨的最大挑戰是反應產物產量不高。乙酰輔酶A在β-氧化逆循環途徑中作為鏈增長單元，而同時又是細胞碳代謝中的關鍵代謝產物。因此，未來宿主菌株的工程操作可能集中在作為該酶底物的?；o酶A和乙酰輔酶A的過量生產上，結合用下游的反應步驟快速除去產物3-氧代酰基輔酶A的措施以及釋放的輔酶A 的有效循環措施，將大大增加合成代謝方向的通量。

通過PKS 系統來實現生產特定產物在結構生物學和合成生物學方面都是巨大的機遇與挑戰。總的來說，由于其多模塊的特性，PKS 提供了一個通用的合成平臺。盡管全基因組測序的進展導致PKS 不斷地被發現，但是很多PKS 的產物仍然不為人所知。而且由于PKS 復合體具有異常大的空間尺寸和柔韌性，很難對完整的PKS 酶及其相關催化狀態進行結構分析。酶-底物的識別，模塊結構域之間的相互作用等都是制約PKS 下一步研究的難題。盡管如此，PKS 平臺仍然不失為合成特定有機酸的一個有效方法。

以上的多條代謝途徑多來源于微生物的內源代謝，因此可以探索廣泛的生物體作為生產宿主。這些合成途徑中的各項反應種類繁多，諸如鏈增長、氧化、還原、環化等，所以理論上以特定分子為目標建立新的代謝途徑是可行的。建立目標產品的人工代謝途徑，可以類比有機合成，根據化學合成的路線進行逆向分析，同時結合生物體內的天然分子，利用酶的催化將前體與產物連接，從而搭建合成途徑。其中前體與底物之間的催化過程通常不是天然的，需要引入新的酶來催化該過程。這些酶可以是從多種異源的蛋白質中篩選出來，也可以由催化類似反應的同工酶對底物的非特異性來實現，還可以通過蛋白質工程對酶進行設計得到。由此構建得到的人工代謝途徑再經過代謝工程技術的優化，從而得以提高產量和產率，實現目標產物的生物合成。

可以預期，隨著基因組學、蛋白質組學、代謝組學的進一步發展，元件庫的不斷擴充，各項技術的日漸成熟，人工代謝途徑的設計、構建和優化將更加便捷、合理、高效。這將為生物合成有機醇和有機酸領域帶來重大突破，推動產業可持續發展。