化學品體外生物合成途徑設計、元件組裝和應用

萬逸塵 ，許孔亮 ，鄭仁朝 ，鄭裕國

（1 浙江工業大學生物工程學院，生物有機合成技術研究浙江省重點實驗室，浙江 杭州 310014；2 浙江工業大學生物工程學院，生物轉化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310014）

化學工業是國民經濟的支柱產業之一。隨著社會進步和人民生活水平的提高，對化學品精細化、高端化、多樣化的需求日益旺盛。作為傳統化學合成技術的補充，環境友好的生物合成技術正引起普遍關注，成為實現社會可持續發展的重要突破口［1-3］。近年來，隨著合成生物學和蛋白質工程等現代生物技術的進步，國內外研究人員開發了一系列高性能的工業菌種和細胞工廠，滿足對醫藥化學品、日用化學品、食品和飼料添加劑、農藥及其中間體等多種化學品生產的需要［4-5］。然而，由于細胞代謝高度網絡化、生長偶聯依賴等瓶頸問題，體內生物合成（全細胞生物合成）的物質與能量轉化效率往往難以滿足高效生產化學品的需求［6-10］。

體外生物合成（無細胞生物合成）是指以純化的酶或細胞提取物為催化劑，制備所需化學品的一種合成方法。由于避開了胞內復雜環境的影響，體外生物合成展現了催化效率高、物質轉化率高等顯著優勢［11-13］，能夠有效滿足化學品工業生產的需要。此外，通過酶元件的設計與組裝調控構建新的人工合成途徑，使其具有途徑設計多樣、可控性強和酶元件來源豐富等特點。近年來，國內外眾多研究團隊通過構建化學品體外生物合成系統，實現了多種化學品的體外生物合成，如糖類化學品［14］、有機酸類化學品［15］和醇類化學品［16］等。本文分析總結了體外生物合成途徑設計的兩個重要原則，包括原子經濟性原則和能量最優原則；介紹了體外生物合成中用于酶元件組裝的3類常見的生物大分子，包括連接肽、蛋白支架和DNA 等；并介紹了近年來生物體外合成在化學品生產中的應用案例，包括氨基葡萄糖［14］、甘油葡萄糖 苷［17］、α-酮戊二酸［15］、丙酮 酸［18］、 乙醇［16］、丙二醇［19］、Islatravir［20］和氮霉素［21］等。通過對體外生物合成的途徑設計、酶元件的組裝方式以及具體應用案例的綜述，本文最后對化學品體外生物合成的發展趨勢進行了展望。

1 體外生物合成途徑設計

途徑設計是構建整個體外生物合成系統的關鍵所在。然而，面對結構和性質不同的化學品，很難設計出一條體外生物合成的“通用”途徑［22］。只有不斷積累前人的經驗，解決途徑設計中存在的每一個困難，體外生物合成系統的構建才能取得進展［22］。體外生物合成的途徑設計可以參考兩個重要的原則，即原子經濟性原則和能量最優原則。

1.1 原子經濟性原則

作為“綠色化學”的重要概念之一，原子經濟性是指在化學品合成過程中，合成方法和工藝應被設計成能將原料盡可能多地轉化到最終產物中［23］。在化學品體外生物合成途徑設計中，可以考慮以下幾點以滿足原子經濟性的需要：①選擇與產物結構類似的起始原料以提高原料利用效率；②設計理論轉化率高的合成途徑以提高原料的轉化率；③選用合適的酶元件以提高反應的催化效率［24］。

圖1 參考原子經濟性原則構建的體外生物合成途徑Fig.1 Designing in vitro biosynthetic pathways via principle atom economy

除了代謝合成，生物體內還存在將復雜的化學品代謝分解成簡單分子的途徑。通過逆向構建目標化學品的分解途徑，篩選合適的酶元件，可實現由簡單分子合成目標化學品，該方法被稱為生物逆向合成（bioretrosynthesis）（圖 1 中）［29-30］。以2，3-二脫氧肌苷（去羥肌苷）的合成為例，Bachmann等［31］通過借鑒生物中肌苷分解成核糖的代謝路徑，在體外逆向構建了以2，3-二脫氧核糖為底物，核糖激酶、磷酸戊糖變位酶和嘌呤核苷磷酸化酶為催化劑，設計了2，3-二脫氧肌苷的合成途徑。并通過對核糖激酶、磷酸戊糖變位酶和嘌呤核苷磷酸化酶的改造，提高了對非天然底物及中間體（2，3-二脫氧核糖）的選擇性并增加了底物周轉率，對2，3-二脫氧核糖的選擇性相較于改造前提升了9500 倍，同時2，3-二脫氧肌苷的產量也提升了50 倍。此外，Islatravir［20］、莫能菌素A（monension A）［32］等化學品的體外生物合成也借鑒了生物逆向合成的設計思路。

對于一些不改變起始原料的化學品合成路線，還可以重新設計其合成途徑，選擇合適的酶元件進行催化，提高底物的轉化率以滿足原子經濟性的需求（圖1 右）。以果糖的生產為例，目前工業上以淀粉為原料，通過淀粉水解酶和葡萄糖異構酶兩種酶催化生產果糖，由于中間產物葡萄糖與終產物果糖的化學勢相近，導致該方法果糖的轉化率最高僅能達到50%左右。Moradian 等［22］重新設計了一條以淀粉為原料體外生物合成果糖的途徑，該路徑以淀粉磷酸化酶、葡萄糖變位酶、轉醛縮酶和3-磷酸甘油醛磷酸酶為催化劑，由于其中間體產物的化學勢都均高于果糖，且反應均為可逆反應，理論上其轉化率可達100%。由于未篩選到對果糖-6-磷酸選擇性高的3-磷酸甘油醛磷酸酶，在最后一步選擇了對果糖-6-磷酸選擇性高的轉醛縮酶，并設計了基于3-磷酸甘油醛磷酸酶的甘油醛再生系統，使該體外生物合成系統的果糖∶葡萄糖比值達到了92∶8，遠遠高于商用的果糖生產途徑。Meng 等［33］通過借鑒前人的工作，將篩選到的對果糖-6-磷酸選擇性較好的熱穩定性磷酸酶，與α-糖苷磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構酶3種酶聯用，最終使該淀粉磷酸化合成果糖的體外途徑的果糖∶葡萄糖比值達到2∶1。

此外，在化學品體外生物合成中，將多個酶組裝串聯在一起也是提高產物產率的方法之一［34］，能夠滿足體外生物合成的途徑設計中原子經濟性的要求。酶催化串聯反應源于大自然中生命有機體為了維持生命過程而進化出的各種代謝通路，多酶催化串聯策略在復雜天然產物合成中的應用已有相關綜述報道［35］。

1.2 能量最優原則

作為生物體內最主要的能量來源，化學品體外生物合成中常需要三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的參與。能量最優原則是指在途徑設計中，合成方法和工藝應被設計成不需要額外添加ATP或盡可能少地使用ATP［22］。

目前已開發了許多非ATP 依賴型的化學品體外生物合成的路徑，降低了原有路徑的成本。以磷酸二羥基丙酮合成為例，原有的合成路線以二羥基丙酮為原料，在二羥基丙酮激酶的催化下合成磷酸二羥基丙酮，該方法會消耗大量ATP。Wang 等［36］設計了一個非ATP-依賴型的體外生物合成系統，用以合成磷酸二羥基丙酮［圖2（a）］。該系統以淀粉作為原料，通過α-葡聚糖磷酸化酶將其磷酸化為葡萄糖-1-磷酸，再通過磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構酶、焦磷酸磷酸果糖激酶以及D-果糖-1，6-二磷酸醛縮酶合成磷酸二羥基丙酮。該體外生物合成途徑無需額外添加ATP 及輔酶，具有一定優勢。

圖2 參考能量最優原則構建體外生物合成途徑Fig.2 Designing in vitro biosynthetic pathways via principle energy optimization

對于一些需要ATP 參與的體外生物合成系統，可以通過構建ATP 的循環再生系統或者重新設計合成途徑以減少ATP 用量，降低生產成本［37-38］。Zhang 等［39］在設計由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸合成谷胱甘肽的體外生物合成路線中，加入了一個由聚磷酸激酶和聚磷酸組成的ATP 循環再生系統 ［圖 2（b）］［40］，可以使生成的二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）重新轉變為ATP。相較于昂貴的ATP，體外反應進程中消耗的僅僅是低成本的聚磷酸。此外，還可以重新設計合成途徑來減少ATP 用量，以L-乳酸的合成為例，傳統體外合成生產L-乳酸的反應路徑為Embden-Meyerhof 路線［41］，該路線第 1 步需將葡萄糖磷酸化，而該步驟需要消耗ATP。Okano 等［42］重新設計從葡萄糖生產L-乳酸的體外生物合成路線，新設計的路線不再磷酸化葡萄糖，而是使用葡萄糖脫氫酶、葡萄糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧葡萄糖酸醛縮酶、甘油酸激酶和乳酸脫氫酶進行催化，該路徑ATP 使用量比原路徑少50%，從而降低了成本。

2 體外生物合成元件組裝

作為體外生物合成的重要催化元件，酶具有催化效率高、底物專一性強、環境溫和等優點。眾所周知，生物體的代謝過程由多種酶協同完成，胞內酶可以形成復雜的多酶復合體，其催化反應高度有序，從而提高其催化效率［43］。因此，在化學品體外生物合成中，可以利用生物大分子將酶元件組裝構建成多酶復合體，以起到提高整體反應速率、避免副反應、提高產品轉化率、消除中間產物抑制等作用［44-45］。目前比較常見的用于多酶組裝的生物大分子主要有連接肽、蛋白支架和DNA等（圖3）。

由于數據的前一半數據受循環卷積影響,所有有效數據為后一半數據。此時,用近端值減去濾波輸出,便可得到第p塊的誤差信號e(p),用一塊內的累加值對濾波器系數進行更新,如式(8)所示:

圖3 用于多酶組裝的生物大分子Fig.3 Biomolecules for multi-enzyme assembly

2.1 基于連接肽的元件組裝

在自然界發現的一些多酶復合體中，酶與酶之間是由一小段多肽（連接肽）進行連接的［46-47］。連接肽可將異源酶連接起來，使酶元件之間緊密貼近（圖3 左上）［45］，這種方式構建的多酶系統可避免因多酶直接融合而產生的蛋白錯誤折疊、活性降低甚至失活等問題［48］。Fan 等［49］在甲醇合成果糖-6-磷酸的體外合成系統中，使用柔性連接肽（GGGGS）3和（GGGGS）6將甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase，Mdh）、6-磷酸己糖合酶（hexulose-6-phosphate synthase，Hps）和 6-磷酸-3-己糖異構酶（6-phospho-3-hexuloisomerase，Phi）順序連接，構建了Mdh-Hps-Phi三酶組裝體。連接肽使酶與酶之間產生協同作用，提高了該體外合成系統的分子動力學優勢，其甲醇氧化速率是游離酶混合物的5.8 倍，總反應速率提升了 1.6 倍。Lerchner 等［50］使用較短的連接肽將2，2，6-三甲基環己烷二酮還原酶和ω-氨基轉移酶進行組裝構建多酶系統，用以催化異山梨醇（300 mmol/L）合成山梨醇二胺，其轉化率是游離酶混合物的2倍。

2.2 基于蛋白支架的元件組裝

在自然界中，蛋白支架（scaffoldin）是組成纖維小體結構的多肽，其上的粘連蛋白（cohesin）可與錨定蛋白（dockerin）產生特異性親和結合［51-52］。通過在酶元件上設計連接錨定蛋白，在蛋白支架上設計與其對應的粘連蛋白，可以構建具有級聯順序的多酶系統，并通過底物通道效應提高酶催化效率［53-54］。You 等［54］在 3-磷酸甘油醛合成果糖-6-磷酸的體外生物合成系統中，基于蛋白支架設計了磷酸丙糖異構酶、醛縮酶、果糖-1，6-雙磷酸酶的多酶催化系統，其對果糖-6-磷酸的合成速率約是游離酶的10 倍，轉化率約為8 倍。Jeong 等［55］將β-瓊脂酶、脫水半乳糖苷酶和 L-阿拉伯糖異構酶通過設計的蛋白支架組裝成三酶復合結構，并以D-半乳糖為原料合成D-塔格糖，D-塔格糖的濃度可高達4.2 g/L，與游離酶混合物相比，其產量增加了1.4倍。

2.3 基于DDNNAA的元件組裝

利用DNA 堿基之間的特異性結合，對其序列進行設計可以自組裝成多種結構，如DNA 支架［56］、DNA 折紙或 DNA 水凝膠［57］等。在體外生物合成中，利用酶表面具有的活性殘基與DNA 寡核苷酸序列間的生物結合，可以使不同酶組裝成多酶復合結構，并控制其相對位置［58］。相較于上述兩種酶元件組裝方式，使用DNA 組裝多酶系統可以精準控制酶的空間位置和酶之間的距離，降低傳質阻力以達到最理想的催化效率［59］。Xin等［60］成功開發了一種新的DNA組裝策略，通過組裝葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶，催化葡萄糖高效轉化為葡萄糖酸。這兩種酶被組裝在一個帶有支撐臂結構的DNA 中，通過改變支撐臂的長度控制中間產物的擴散距離，使酶活相較于游離酶提高了88%。Fu等［61］在果糖-6-磷酸合成蘋果酸的體外合成系統中，將果糖-6-磷酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶組裝在一個DNA 支架上，并在酶之間設計了一個帶有輔助因子的擺動DNA 臂。這種人工構建的DNA 搖臂可以促進底物在兩種偶聯的脫氫酶之間轉移，其酶活相比游離酶提高了25倍［62］。

3 體外生物合成的應用前景

利用上述合成途徑和組裝策略，國內外研究人員構建了一系列的化學品體外生物合成系統，實現了多種大宗化學品的綠色合成。本文將對糖類、有機酸、醇類及其他化學品的體外生物合成的應用作舉例介紹，主要包括氨基葡萄糖、甘油葡萄糖苷、丙酮酸、α-酮戊二酸、丙二醇、乙醇、Islatravir和氮霉素等。

3.1 糖類化學品

氨基葡萄糖被廣泛應用于食品、化妝品和制藥工業中［63］。目前用于生產氨基葡萄糖的方法主要有化學法和微生物發酵法。化學法需要強酸水解且操作步驟繁雜，并伴有毒副產物產生［63］；微生物發酵法產生的氨基葡萄糖易被微生物代謝消耗，且產物積累會抑制微生物生長而致產量降低［63］。Meng 等［14］設計了一條氨基葡萄糖的體外生物合成路徑（圖4），該方法以淀粉/麥芽糊精和氨水為原料，α-糖苷磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構酶、氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶、氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸酶為催化劑，當麥芽糊精濃度為10 g/L 時，其氨基葡萄糖的產量可達7.9 g/L，對應的摩爾轉化率為75.8%。為探究該體外生物合成路徑的工業應用潛力，作者對該體系進行了放大，當麥芽糊精濃度為50 g/L時，其氨基葡萄糖的產量可達23.7 g/L。雖然該產量與目前微生物發酵法的最高水平（120 g/L 左右）還存在一定差距［64］，但是該氨基葡萄糖的體外合成路線具有催化效率高、原子經濟性好和可控性強等優點，展現出了一定的工業應用前景。此外，Lv等［65］構建了一條以蘑菇及植物中的幾丁質為原料合成氨基葡萄糖的體外合成路線，通過甲殼素酶和脫乙酰酶（來源于Cyclobacterium marinum）兩步合成氨基葡萄糖，該方法以廢棄的植物資源為原料，具有一定的環保效益，同時可被甲殼類過敏的消費者食用。

圖4 使用淀粉生產氨基葡萄糖的體外生物合成途徑Fig.4 In vitro biosynthesis pathway for conversion of starch and inorganic ammonia to glucosamine

甘油葡萄糖苷（α-glucosylglycerol）是由一分子甘油和一分子葡萄糖通過糖苷鍵形成的一種糖苷型化合物，可作為化妝品中的保濕劑［66-67］。Zhang 等［17］構建了兩條甘油葡萄糖苷的體外生物合成路線。其中一條以蔗糖為原料，經蔗糖磷酸酶、葡萄糖基甘油磷酸酶催化合成；另一條以麥芽糖為原料，經麥芽糖磷酸酶、葡萄糖基甘油磷酸酶催化合成。通過對反應條件的優化，兩條途徑的轉化率均可高達97%，甘油葡萄糖苷產量高達452 g/L。

此外，果糖、2-脫氧-5-核糖、甘露糖等糖類化學品也可以通過體外生物合成方法進行生產（表1）。

表1 糖類化學品的體外生物合成Tab.1 In vitro biosynthesis of carbohydrates and its derivatives,including glucosamine,N-acetyl glucosamine,glycerol glucoside,glucose-6-phosphate,fructose,fructose-6-phosphate,fructose-1,6-diphosphate,2-deoxy-5-ribose,d-tagatose,mannose and xylulose-5-phosphate.

3.2 有機酸類化學品

α-酮戊二酸是三羧酸循環和氨基酸合成的重要中間體，可作為膳食補充劑、傷口愈合類化合物的原料以及雜環化學合成的基礎原料［75］。目前，α-酮戊二酸一般使用琥珀酸和草酸二乙酯與氰醇進行化學合成，其產率約為75%，但由于使用有毒的原料，該方法會產生有毒的廢物（如氰化物）［76］。環境友好的生物合成可作為化學法的替代方式，但體內生物合成需要精確控制其培養條件［77］（如硫胺素和氮濃度、pH和通氣量等），且產生的丙酮酸和其他有機酸等副產物會抑制細胞的生長。因此，Beer 等［15］設計了類糖醛酸的氧化途徑，該方法以葡萄糖醛酸為底物，使用尿酸鹽脫氫酶、草酸鹽脫水酶、5-酮-4-脫氧葡萄糖酸脫水酶和α-酮戊二酸半醛脫氫酶催化合成α-酮戊二酸（圖5）。這種體外生物合成方式所需酶級聯步驟較短，并且單次反應只消耗兩個單位的NAD+。由于最后一步由α-酮戊二酸半醛脫氫酶催化的氧化反應為不可逆反應，因此總反應的熱力學平衡強烈傾向于產物。在添加輔酶循環再生系統后，10 g/L 的D-葡萄糖醛酸可生產2.8 g/L的α-酮戊二酸。

圖5 使用D-葡萄糖醛酸生產α-酮戊二酸的體外生物合成途徑Fig.5 In vitro biosynthesis pathway for conversion of D-glucuronic acid to α-ketoglutarate

丙酮酸是一種酸性較弱的有機酸，作為生物細胞糖代謝及體內多種物質相互轉化的重要中間體，在藥品、食品、農業、醫療等行業有重要的作用。Honda等［18］利用甲殼素為原料構建了丙酮酸的體外生物合成系統，使用了12種嗜熱酶，其中包括3-磷酸甘油醛脫氫酶、不依賴輔因子的磷酸甘油酸突變酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶等。在添加了輔酶再生系統、ATP再生系統與腺苷酸激酶后，丙酮酸產量提高到了2.1 mmol/L（底物濃度為0.5 mg/mL）。

此外，乳酸［41］、D-2-氨基丁酸［78］、半胱氨酸［28］、葡糖二酸［79］等有機酸類化學品也可以通過體外生物合成方法進行生產（表2）。

表2 有機酸類化學品的體外生物合成Tab.2 In vitro biosynthesis for organic acid chemicals,including α-ketoglutarate,pyruvate,lactic acid,D-2-aminobutyric acid,cysteine and glucaric acid

3.3 醇類化學品

乙醇是一種常用的化學品，在化工、醫療、食品、農業生產中都有廣泛的用途［80］。在乙醇的微生物發酵生產中，菌體對溫度和溶劑條件的低耐受性是導致其轉化效率低下的主要原因。Guterl等［16］構建了以葡萄糖為原料合成乙醇的體外生物合成系統，該系統首先以葡萄糖脫氫酶、二羥酸脫水酶、2-酮-3-脫氧葡萄糖酸醛縮酶、甘油醛脫氫酶為催化劑構建了葡萄糖合成丙酮酸的高效中間體平臺，再利用丙酮酸脫羧酶與乙醇脫氫酶催化丙酮酸催化合成乙醇（圖6）。當葡萄糖濃度為25 mmol/L時，乙醇的濃度經19 h 可達到28.7 mmol/L。此外，基于丙酮酸的中間體平臺，該路徑還可用于異丁醇的生產，經23 h 的酶催化，19.1 mmol/L 的葡萄糖可轉化為10.3 mmol/L的異丁醇。

圖6 使用葡萄糖生產乙醇的體外生物合成途徑Fig.6 In vitro biosynthesis pathway for conversion of glucose to ethanol

1，3-丙二醇是生產不飽和聚酯、多種藥物及中間體、表面活性劑和乳化劑的原料［81］。傳統上以甘油為原料發酵生產1，3-丙二醇的方法由于體內復雜的 代 謝 路 徑 ， 僅 能 達 到 60% 的 產 率［81-82］。Rieckenberg 等［19］構建了由甘油生產 1，3-丙二醇的體外生物合成路徑，以甘油脫水酶、丙二醇氧化還原酶同工酶和氫化酶為催化劑，構建了兩步級聯反應，其中氫化酶作為輔因子再生模塊可消耗氧氣為體外生物合成系統供給NADPH，該體外生物合成途徑有著很高的原子經濟性（轉化率接近100%）。同時，通過添加輔酶維生素B12、ATP和鎂，延長了甘油脫氫酶的耐久性，相比于發酵過程，該路徑可簡化在工業化生產中下游的分離步驟。

此外，正丁醇、異丁醇、肌醇、二氨基山梨醇等醇類化學品也可以通過體外生物合成方法進行生產（表3）。

3.4 其他化學品

除了上述3 類大宗化學品，體外生物合成系統還可用于合成其他具有不同結構和功能的化學品，包括一些復雜的天然產物和藥物，如Islatravir、氮霉素、異戊二烯、間苯三酚和柚皮素等（表4）。

表4 其他化學品的體外生物合成Tab.4 In vitro biosynthesis for other chemicals,including isoprene,phloroglucinol,islatravir,naringenin,deoxyinosine,cytidine-5-monophosphate,azomycin,3-hydroxybutyryl limonene,pinene,hinokene and L-glutathione

核苷型類似物Islatravir 是一種人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）逆轉錄酶易位抑制劑，目前正在進行臨床試驗研究，有望用于HIV 暴露前的預防感染，以及降低治療的給藥頻率［89］。由于需要構建多個保護基以保護Islatravir 的活性基團和2-脫氧核糖核苷的立體選擇性，目前多種化學合成路線均需要長達 12～18 步的合成步驟［90］。默克公司的Huffman 等［20］在細菌核苷補救途徑的啟發下，采用逆向合成思路（圖1），設計了一條無需保護基步驟的Islatravir 的體外生物合成路線，該方法以脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶、磷酸突變酶、嘌呤核苷磷酸化酶等酶為催化劑，以2-乙炔基甘油為原料，經過三步催化步驟合成Islatravir（圖7）。通過優化酶催化的各個路徑，首次實現了Islatravir 的體外規模化合成，其總產量高達51%，純度高達95%。

圖7 Islatravir的體外生物合成途徑Fig.7 In vitro biosynthesis pathway for conversion of ethynyl glycerol,acetaldehyde and guanine to islatravir

氮霉素（azomycin）是一種硝基咪唑類抗生素藥物，是目前治療厭氧細菌感染的最有效的藥物之一。Eguchi 等［91］發現在菌株Streptomyces eurocidicus中，L-精氨酸可通過2-氨基咪唑轉化為氮霉素。受前人工作的啟發，Hedges 和Ryan［21］以L-精氨酸為原料，吡哆醛-5-磷酸依賴型精氨酸氧化酶、二氫二吡啶甲酸合酶、胍基乙醛脫水酶、鐵氧化酶為催化劑，首次構建了氮霉素的體外生物合成系統，該工作為今后體外生物合成氮霉素或其他硝基咪唑類化學品提供了借鑒。

4 總結與展望

21 世紀以來，以合成生物學和蛋白質工程為代表的現代生物技術的迭代進步，為化學品體外生物合成的發展提供了強有力的保障。以美國和歐盟為代表的發達國家和地區在化學品體外生物合成領域的發展快速，我國在該領域內的自主創新也展現出強勁活力。然而，作為一種新興的綠色合成方式，化學品體外生物合成還處于技術發展的初期階段，目前還存在一定的挑戰，具體表現如下：

（1）化學品體外生物合成的途徑設計困難。化學品體外生物合成技術現有的發展多是基于自然界中已發現的生物合成途徑。然而，絕大部分化學品并沒有天然合成途徑，這給很多化學品體外生物合成的途徑設計帶來了一定困難。

（2）化學品體外生物合成的關鍵酶元件缺乏。酶元件是構建化學品體外生物合成途徑的關鍵，然而，很多理論轉化率很高的途徑，由于缺少合適的酶元件，難以達到預期的效果。

（3）化學品體外生物合成的成本較高。很多化學品體外生物合成需要ATP 及輔酶的參與，然而，昂貴的ATP 及輔酶原料極大增加了體外生物合成的成本。同時，酶在體外的穩定性和可重復使用率較差，也是造成體外生物合成的成本居高不下的重要原因之一。

針對上述化學品體外生物合成技術存在的挑戰，筆者分析總結了體外生物合成途徑設計的兩個重要原則，包括原子經濟性原則和能量最優原則；介紹了體外生物合成中用于酶元件組裝的3類常見生物大分子，包括連接肽、蛋白支架、DNA等；并對近年來體外生物合成在化學品生產中的應用案例作了介紹，包括氨基葡萄糖、甘油葡萄糖苷、丙酮酸、α-酮戊二酸、乙醇、1，3-丙二醇、Islatravir和氮霉素等。最后，筆者對化學品體外生物合成的發展趨勢進行展望，具體如下：

（1）隨著計算機技術的發展，可以使用人工智能技術對代謝路徑進行大數據分析和理論計算，以篩選出最優的途徑供體外生物合成使用。

（2）隨著非理性設計到理性設計的蛋白質改造技術以及新酶設計能力的不斷提高，希望可以快速獲得具有理想催化功能的關鍵酶元件供體外生物合成使用。此外，還可通過酶元件與綠色環保的化學催化劑串聯/并聯使用，實現化學品的體外綠色合成。

（3）開發輔因子再生系統或者人工仿生輔酶，降低輔因子的使用成本。同時，期望通過重構體外生物合成的途徑，設計出不需要ATP 或輔酶參與的路線，以降低化學品體外生物合成的成本。

（4）開發具備工業應用前景的酶固定化或自組裝技術，提高酶在體外生物合成系統中的穩定性，增加酶的回收和重復使用率，降低體外生物合成的成本。

總之，隨著體外生物合成設計能力的不斷提高，體外生物合成的途徑設計將朝著智能化、高效化發展，化學品體外合成的效率也將逐步提高，體外生物合成有望涵蓋所有化學品的生物合成。同時，也希望通過合成生物學技術的輔助，使化學品體外生物合成的成本不斷降低，并成為未來化學品合成的主要方式之一。