HER-2基因表達對乳腺癌前哨淋巴結轉移性質的影響分析

郭日昌，梅 林，陳鳳如，黃彬華

(廣東醫科大學附屬東莞厚街醫院胸外甲狀腺乳腺科，廣東 東莞 523000)

乳腺癌是指人乳腺組織細胞，尤其是乳腺上皮組織細胞，發生大面積癌變的一種惡性腫瘤疾病。其發病率與致殘率在女性惡性腫瘤中位居榜首，但也發生在男性中，且近幾年患者發病年齡持續呈現低齡化的趨勢[1-2]。乳腺癌不僅嚴重威脅患者的身體健康并帶來焦慮、煩躁、厭世等不良心理問題，而且可能會切除患者乳房，從而為患者隨后的日常生活帶來不便并進一步加深患者負面情緒。在惡性腫瘤中，由于外部和內部因素的共同作用，淋巴結轉移是一種常見的現象[3]。

前哨淋巴結是指原發腫瘤出現淋巴結轉移時所經的首個淋巴結。作為乳腺癌細胞最容易轉移的位置，其對判斷該疾病的實際變化有著至關重要的作用[4-5]。同時確定前哨淋巴結無轉移可以使患者避免腋窩淋巴結清掃手術(axillary lymph node dissection, ALND)，進而規避其帶來的一系列手術并發癥[6]。

人表皮生長因子2(human epidermal growth factor receptor 2, Her-2) 可以通過調控多條信號通路，促進細胞的生長分裂，調控細胞的生長與分化[7]。研究表明, HER-2的表達水平與腫瘤的分級、大小,淋巴結轉移及藥物敏感性和預后密切相關[7-8]。HER-2受體陽性乳腺癌患者占全體乳腺癌患者的25%，表現出更強的浸潤性和更短的生存期。這些都提示HER-2表達水平與乳腺癌的發病和轉移可能具有強相關性。

本研究通過檢測2014年4月～2019年5月我院收治的乳腺癌患者原發病灶和前哨淋巴結轉移灶的HER-2基因表達水平與前哨淋巴結轉移水平，探究于乳腺癌前ER-2基因表達對哨淋巴結轉移性質的影響情況。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2014年4月～2019年5月我院收治的乳腺癌患者96例。納入標準：①年齡20～70歲；②首次發病，具有完整的乳腺和前哨淋巴結結構；③由主治以上級別專科醫師，通過病理檢查確診為乳腺癌；④患者臨床和病理資料齊全；⑤患者均為漢族女性；⑥根據《惡性腫瘤TNM分類法》和美國癌癥協會 (American Joint Committee on Cancer, AJCC) 第7版乳腺癌分期標準判斷腫瘤處于Ⅱ期；⑦患者意識清楚并可以通過語言或者文字表達;⑧事先告知患者檢測方案并獲得患者及其家屬的書面同意； 排除標準:①存在嚴重意識障礙和嚴重并發癥癥狀；②患有除乳腺癌、纖維癌和脂肪癌以外的癌癥；③病理資料不全或病理分型不明確者；④根據《惡性腫瘤TNM分類法》和AJCC第7版乳腺癌分期標準判斷腫瘤處于Ⅲ期或Ⅳ期；⑤患者曾被確診為乳腺癌且接受過ALND等相應治療，為二次或多次發病者；⑥患者具有少數民族或其他國家的血統；⑦處于妊娠或哺乳狀態的患者；⑧患有嚴重精神疾病的患者；⑨具有嚴重的血液病和肝腎功能障礙者；⑩任何其他診斷治療禁忌者；檢測未獲得患者及其家屬的書面同意或其中途退出。

根據臨床及影像學檢查顯示的前哨淋巴結轉移情況，將患者分為三組，無轉移組48例，低轉移組28例，高轉移組20例。無轉移組、低轉移組和高轉移組年齡、腫瘤直徑、絕經比例和平均體重等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。詳見表1。

1.2檢測方法

1.2.1免疫組化法檢測原病灶的HER-2基因表達：采用免疫組織化學法對乳腺癌原病灶和前哨淋巴結轉移灶中的HER-2的表達狀態進行檢測。針吸法獲得活檢的乳腺癌原病灶組織標本。使用4%中性 (磷酸緩沖) 福爾馬林固定液固定標本6 h后，將其石蠟包埋進行切片處理，每份切片厚度<5 μm。引用專用乳腺癌HER-2檢測試劑盒(免疫組化法)，而此次研究所引用的試劑盒由廣州安必平醫藥科技有限公司提供，并定性檢測所有被選對象原病灶HER-2蛋白水平情況。其中含有抗HER-2蛋白鼠單克隆抗體、二抗I試劑、二抗II試劑、DAB色原、底物緩沖液和質控片，原理為En Vision法。步驟如下：①用二甲苯沖洗石蠟切片脫蠟2次，每次間隔30 min。100%、95%、90%、85%、80%、70%的乙醇濃度自高至低依次對組織進行復水，每次間隔5 min，隨后將切片置于蒸餾水中5 min進行洗片，共進行3次。②用高壓對修復組織抗原。③切片滴加PBS 沖洗3次后滴加抗HER-2蛋白鼠單克隆抗體，4℃過夜。PBS 沖洗 3 次后滴加二抗Ⅰ試劑，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次后滴加二抗Ⅱ試劑，室溫下孵育10 min， PBS 沖洗3次。④切片滴加 DAB 色原溶液顯色，顯色后用自來水沖洗，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封固。⑤使用質控片設置陽性對照片和陰性對照片。

表1 三組患者的一般情況資料比較

1.2.2免疫組化法檢測前哨淋巴結轉移灶的HER-2基因表達:采用免疫組織化學法對乳腺癌前哨淋巴結轉移灶中的HER-2的表達狀態進行檢測。用前哨淋巴結活檢法獲得的乳腺癌前哨淋巴結轉移灶組織標本。采取與原病灶處同樣的方法對低轉移組和高轉移組的前哨淋巴結轉移灶處的HER-2蛋白進行定性檢測。

1.2.3熒光原位雜交法能對移速陽性標本進行檢測:根據下文提及的檢測標準，對存疑的標本取其他切片使用熒光原位雜交法進行進一步檢測。

1.2.3.1操作前準備:將4 μm切片于65℃下過夜烤片。 隨后與免疫組化法一樣將組織切片脫蠟和復水，于 50℃下用 30%[w/v]酸性亞硫酸鈉(購于美國Sigma公司)處理組織切片，30 min后使用2xSSC溶液(購于天津生化制品有限公司)對切片進行漂洗。向40 ml中性2xSSC加入美國Sigma公司提供的0.4 ml蛋白酶K儲存液，得到蛋白酶K工作液；在蛋白酶K工作液內浸泡組織切片，在37℃環境下孵育20～30 min。然后將切片玻片依次置于-20℃預冷的70%乙醇、85%乙醇和 100%乙醇中脫水，自然干燥玻片后置于56℃烤箱中預熱待用。

1.2.3.2標本的準備：標記玻片背面的雜交區域。用2xSSC稀釋為75%的甲酰胺變性液于73℃水浴箱中預熱30 min后，將玻片浸泡于該變性液中5 min，充分變性。隨后在零下20℃預冷的70%濃度乙醇、85%濃度乙醇和100%濃度乙醇內分別置入玻片后梯度脫水。待自然干燥后，將其置于溫度在45℃的烤片機上進行預熱。

1.2.3.3探針配置：將2 μl的GLP HER-2/CSP17 探針(北京金菩嘉醫療科技公司)與1 μl的去離子水和7 μl的雜交緩沖液混勻，先置于73℃水浴箱中變性5 min，再移交至45℃水浴箱中備用。

1.2.3.4樣品雜交：將探針混合物滴于雜交區域后馬上蓋片封片，將其放置于鋪有浸濕紙巾的濕盒中，密封后于42℃保溫箱中過夜。

1.2.3.5洗滌樣品：在恒溫狀態下，向3個考普林瓶內分別置入2xSSC稀釋為的 50%濃度的甲酰胺溶液，然后在46℃水浴箱內放置盛有洗滌液的3個瓶子，預熱30 min。將移去蓋玻片的組織玻片立即置于第1個考普林瓶中，晃動玻片1～3 s，10 min后取出轉至第2個考普林瓶中，相同方法洗滌后轉入第3個考普林瓶中，操作相同。取出后再分別以 50 ml 2xSSC 溶液和0.1%NP-40 洗液(北京金菩嘉醫療科技公司)洗滌玻片， 置于暗處自然干燥。

1.2.3.6利用顯微鏡觀察發現：將15 μl DAPI復染劑滴加在最終樣本的雜交區域后，馬上用蓋玻片蓋上，然后放置在陰涼地靜置20 min，然后利用熒光顯微鏡進行觀察，但在觀察時應對濾波片合理選擇。

1.3檢測標準:將染色完畢的標本置于光學顯微鏡10×物鏡下觀察，HER-2陽性癌細胞的細胞膜完全深著色。根據2014年發布的中國乳腺癌HER-2檢測指南[9]，將結果定義如下：①0：所有或>90%的腫瘤細胞完全不存在細胞膜著色；②1+為>10%的腫瘤細胞不完整淺著色；③2+為>10%的腫瘤細胞完整淺著色；④3+為>10%的腫瘤細胞完整強著色。3+可視為病灶處HER-2陽性，0～1+可視為病灶處HER-2陰性，2+需要通過熒光原位雜交法進行進一步判定。

17號染色體著絲粒顯示綠色熒光信號，HER-2基因顯示橘紅色熒光信號。若細胞核內同時呈現綠色與橘紅色熒光信號則該細胞被視為HER-2陽性細胞。調整視野，計數30個細胞中陽性細胞的比例。若比例>2.2為陽性，若比例<1.8為陰性，若處于1.8～2.2兩者之間則擴大計數細胞范圍，直至比例>2.2或<1.8。若此方法下陽性[2+(+)]，2+標本方可歸為病灶處HER-2陽性，反之歸為病灶處HER-2陰性[2+(-)]。

1.4統計學分析:所有數據運用SPSS21.0統計學軟件進行統計分析。計數資料用率(%)表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1原病灶的HER-2基因表達:各組原病灶的HER-2基因表達情況見表2。三組患者各檔人數比例均差異有統計學意義(P<0.05)。無轉移組的乳腺癌原病灶的HER-2基因陽性率(20.83%)顯著低于低轉移組(42.86%)與高轉移組(55.00%)，差異有統計學意義(P<0.05)，且低轉移組陽性率顯著低于高轉移組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 三組患者原病灶處的HER-2基因表達

2.2前哨淋巴結轉移灶的HER-2基因表達：低轉移組和高轉移組前哨淋巴結轉移灶的HER-2基因表達情況見表3。兩組患者除1+檔外，各檔人數比例均差異有統計學意義(P<0.05)。低轉移組患者的乳腺癌轉移灶處HER-2基因陽性率為39.28%，顯著低于高轉移組的55%，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 低轉移組和高轉移組患者前哨淋巴結轉移灶處的HER-2基因表達[例(%)]

2.3原病灶與前哨淋巴結轉移灶處HER-2基因表達對比：低轉移組與高轉移組患者的乳腺癌前哨淋巴結轉移灶處HER-2基因陽性率與其對應組的原病灶處陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，呈現較高的一致性。見表4。

表4 低轉移組和高轉移組患者原病灶與前哨淋巴結轉移灶處HER-2陽性率對比[例(%)]

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤死因的榜首，在全球范圍內占全部惡性腫瘤的22%，其高發病率、高致殘致死率、高復發率與低齡化發病和持續上升發病的趨勢使得其成為臨床研究的熱點。未育、未哺乳、月經初潮較早、乳腺增生、乳腺腺體致密、物理因素、化學因素和家族遺傳史等皆是罹患乳腺癌的高危因素[10]。盡管男性也可能患乳腺癌，但由于生理結構差異，其可能性遠小于女性。此外，由于相關觀點普及程度和社會觀念影響，男性本身察覺到患癌可能并就醫的可能性小。因此，男性患者人群過小，無法達到互相參照的樣本量，故本次實驗完全排除男性患者。研究顯示，不同民族乳腺癌患者HER-2陽性率和前哨淋巴結轉移率差異有統計學意義(P<0.05)[11]，考慮到患者樣本量的充足性，本次實驗只包含漢族患者。

乳腺癌中前哨淋巴結轉移是常見現象，但并非所有的乳腺癌患者均出現轉移現象。事實上，50%～70%的乳腺癌患者不出現前哨淋巴結。對無轉移患者實施ALND不僅不必要，且會帶來上肢水腫和運動障礙等一系列術后并發癥，并破壞淋巴結的免疫檢測功能，從而促進隱匿癌灶向遠處轉移。因此，研究影響乳腺癌前哨淋巴結轉移的因素對于乳腺癌的控制病情和治愈有極高的臨床意義。前哨淋巴結活檢技術作為一種微創診斷技術，可以大幅避免ALND引起的相關并發癥。研究證明，僅接受前哨淋巴結活檢而不接受ALND的患者較接受ALND的患者而言，無病生存期和總生存期差異無統計學意義(P>0.05)，但前者具有更好的長期生活質量[12]，亦有研究證實前者具有更低的復發率。故本次實驗采用前哨淋巴結活檢法獲取前哨淋巴結組織進行HER-2基因表達檢驗。

免疫組化法測量HER-2表達操作簡便、成本低、得結果快，是廣泛應用的理想定性檢測方法。但是由于其本身操作中蛋白容易受到破話和污染，會對結果的準確性造成較高的干擾。因此對于2+的樣本需要采用原位雜交法進行進一步的測定。熒光原位雜交法測量主體為HER-2 基因而非HER-2蛋白，因此具有更高的穩定性，實驗操作的影響相對降低，同時，其還可用于定量檢測。但是熒光原位雜交法操作繁復、成本高昂、操作流程時間過長，因此在大多數相關研究中仍主要應用于對免疫組化法存疑樣本檢測的補充，而非直接應用。免疫組化法仍然是測量HER-2表達的首選。

乳腺癌的具體的發病機制目前尚不清晰，仍處于研究探索階段。但隨著現代生物學的發展尚,多項研究表明,多種細胞因子及基因在乳腺癌的發生、發展和轉移中起著重要作用。HER-2是坐落于17號染色體上的人類原癌基因，具有酪氨酸酶活性，可以作為多種腫瘤的調控因子，影響腫瘤的形態特點、生長方式、惡性程度、轉移、復發和對內分泌治療的敏感程度。它也被證實可以促進乳腺癌的發生和發展。HER-2陽性乳腺癌亦表現出更強的浸潤性、更短的生存期和更差的預后效果。本實驗顯示，乳腺癌原病灶和前哨淋巴結轉移灶的HER-2基因表達水平與乳腺癌前哨淋巴結轉移水平正相關，提示HER-2水平可以作為良好的前哨淋巴結轉移預測參數，預測其是否轉移以及轉移程度。國內外多項研究顯示，多項乳腺癌相關受體表達量在原病灶和前哨淋巴結轉移灶處的表達不一致[13]。但國內多項研究也展示了HER-2在原病灶和前哨淋巴結轉移灶處的表達具有較好的一致性[11,14,15]，這與本研究結果一致。低轉移組和高轉移組的患者原病灶和前哨淋巴結轉移灶處的表達均差異無統計學意義(P>0.05)。提示原病灶處的HER-2分子水平已經可以很好地反映前哨淋巴結轉移灶處的HER-2分子水平，這對于臨床研究和治療具有重要的參考意義。

總之，本實驗通過免疫組化法和熒光原位雜交法，測量不同轉移性質之下的初發女性乳腺癌患者原病灶和前哨淋巴結轉移灶處的HER-2水平，發現其具有良好的正相關性，且原病灶和前哨淋巴結轉移灶處的HER-2水平呈現較好的一致性。這提示建立以原病灶HER-2表達水平為基礎的乳腺癌前哨淋巴結轉移性質預測系統具有可行性，為乳腺癌分子靶向治療提高了較高的參考依據