Vinculin促小鼠肝星型細胞活化作用

鄒韻涵 崔慧情 丘穎琛 李筱迪 龍子昕 曹智銘 馬寧芳 劉珊珊

病毒、寄生蟲、酒精等均可對肝臟造成損傷并引起肝纖維化，其表現為細胞外基質過量沉積，匯管區纖維異常增生，繼而假小葉和再生結節形成，是各種慢性肝病向肝硬化發展所共有的病理改變和必經途徑[1-2]。肝星形細胞(hepatic stellate cells，HSC)活化是肝纖維化發生發展的關鍵環節[3-4]。HSC圍繞在肝竇周圍，正常狀態下，HSC在肝內處于靜息狀態；在肝損傷因子刺激后，HSC活化為肌成纖維樣或成纖維樣細胞，活化的HSC增生并向損傷區域遷移，表達各種細胞外信號轉導通路蛋白，并產生大量以膠原纖維為主的ECM，進而導致肝纖維化形成[4]。及時采取有效措施干預其活化過程對阻斷肝纖維化進展至關重要。

細胞骨架蛋白紐蛋白(Vinculin)是一種黏著連接相關蛋白，存在于細胞-細胞及細胞-細胞外基質間的黏著部位，其作用是將纖維狀肌動蛋白錨定于連接點胞膜上，通過與多種細胞骨架蛋白、黏著斑蛋白的相互作用，在細胞黏附、遷移、增殖等過程中發揮關鍵作用[5-6]。有研究發現在肺纖維化區域的肺泡上皮細胞及間質細胞中Vinculin表達增強[7]，提示Vinculin蛋白可能參與了纖維化過程，但具體機制不清。本研究探討Vinculin與HSC活化是否有關，深入解讀肝纖維化分子機制，為優化臨床治療策略提供新思路。

材料與方法

一、實驗材料

Vinculin-siRNA(廣州市銳博生物科技公司)，一抗稀釋液(上海市碧云天生物技術有限公司)，兔抗Vinculin單克隆抗體(英國abcom公司)，兔抗α抗com多克隆抗體(中國BOSTER公司)，鼠抗Desmin單克隆抗體(中國BOSTER公司)，兔抗GAPDH 單克隆抗體(美國CST公司)，羊抗兔二抗(美國Pierce公司)，羊抗鼠二抗(美國Pierce公司)。

二、實驗方法

(一)細胞培養及siRNA瞬時轉染 人源性肝星形細胞株LX-2在10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的1640培養基37 ℃、體積分數為0.05的CO2、條件下培養。Vinculin siRNA序列如下，siRNA1：GCACAGCGGTGGATTGATA，siRNA2：CTCGTA-TCTTACTTAGGAA，Scramble：Vinculin無關序列。

(二)RT-qPCR檢測 根據NCBI上Vinculin已知序列，用premier5設計引物，所用引物序列如下：Vinculin Forward AACCAGTATTGCTCGTCGGG，Vinculin Reverse GAGGCGGCGGGAAGTC；desmin Forward AGCCAACAAGAACAACGACG，desmin Reverse TTCCCGCATCTGCCTCAT；α-SMA Forward GGGGTGATGGTGGGAATG，α-SMA Reverse GCAG-GGTGGGATGCTCTT。

(三)蛋白質印跡檢測 一抗稀釋液稀釋兔抗Vinculin 124 kDa(1∶10 000), 鼠抗DESMIN 50-55 kDa(1∶50)，兔抗α-SMA 50-55kDa(1∶50)，兔抗GAPDH 37 kDa(1∶2000)，獲取圖片后以目標蛋白與內參蛋白GADPH的灰度比作為目標蛋白的相對表達值。

(四)ELISA檢測 按照ELISA試劑盒操作說明書檢測上清液人Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)含量。以所測標準品A值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，用相關軟件繪制曲線，并取得直線回歸方程，將樣品的A值代入方程，計算出樣品待測指標濃度。

(五)小鼠肝纖維化模型 清潔級健康成年雄性昆明小鼠30只，體質量25～28 g，購于廣東省動物中心。小鼠隨機分為對照組(n=5)和實驗組(n=15)。實驗組皮下注射四氯化碳-粟米油混合液(6 mL/kg)，2次/周，對照組皮下注射同等劑量的粟米油。于造模8周后取小鼠中葉肝組織，置預冷的4%多聚甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋，制備蠟塊、切片。

(六)DESMIN及Vinculin免疫組化檢測 石蠟切片經加熱融蠟、二甲苯脫蠟、常規梯度酒精水化、枸櫞酸抗原修復、過氧化物酶封閉，山羊血清封閉后加入一抗(抗Vinculin 1∶50，鼠抗DESMIN1∶100或兔抗α-SMA1∶100)孵育過夜，PBS溶液洗3遍，二抗(山羊抗兔1∶200，山羊抗鼠1∶200)孵育30 min，DAB染色，蘇木素復染，常規脫水透明，中性樹膠封片鏡檢。

三、統計學處理

每個實驗至少重復3次，采用 SPSS16.0軟件進行統計學分析，數據均以均數±標準差表示。配對樣本均數間的比較采用配對樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、小鼠肝臟組織病理學

HE染色結果顯示對照組小鼠肝小葉內肝細胞形態正常，無壞死，炎癥浸潤等其他病理狀態(圖1A)，CCL4處理組小鼠肝細胞出現空泡狀，肝小葉周圍出現大量炎性細胞浸潤及纖維組織增生(圖1B)。Masson染色結果顯示對照組僅在中央靜脈壁周圍可見少量綠色纖維(圖1C)，CCL4組小鼠肝組織內及肝小葉間出現大量纖維增生，部分切片有纖維包繞分割肝小葉的趨勢(圖1D)。

A.對照組小鼠肝組織HE染色；B.CCl4誘導8周小鼠肝組織HE染色；C.對照組小鼠肝組織Masson 染色；D.CCl4誘導8周組小鼠肝組織Masson 染色

二、Vinculin、DESMIN 及α-SMA免疫組化

對照組肝組織內可見散在的Vinculin陽性細胞，定位于肝星型細胞胞膜下，CCL4組Vinculin陽性細胞數明顯高于對照組(圖2A,2B)。免疫組化顯示對照組DESMIN散在表達于肝血竇周圍的肝星型細胞，CCL4組陽性表達細胞明顯增多(圖2C,2D)。對照組α-SMA為陰性表達，CCL4組陽性表達明顯增加，彌漫于胞質(圖2E,2F)。

A、C、E：對照組小鼠肝組織；B、D、F：CCl4誘導8周小鼠肝組織

三、肝星形細胞系LX-2 desmin 及 α-SMA表達

人源性肝星形細胞系LX-2瞬轉si Vinculin 48 h后提取細胞RNA，反轉錄cDNA后qPCR檢測Vinculin、desmin 及 α-SMA，結果顯示下調Vinculin后desmin與α-SMA mRNA表達隨之下調(表1)，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。蛋白質印跡檢測結果顯示，siRNA干擾Vinculin后其蛋白水平明顯下調，DESMIN 與α-SMA表達水平也隨之下降(圖3)。

表1 qPCR法檢測LX-2細胞Desmin 及α-SMA基因表達(2-CT，±s)

圖3 肝星形細胞系LX-2 Desmin 及 α-SMA蛋白表達檢測

四、ELISA檢測Ⅰ型膠原蛋白

收集Vinculin及對照siRNA瞬轉細胞培養上清液，ELISA檢測Ⅰ型膠原蛋白含量，結果顯示下調Vinculin后Ⅰ型膠原蛋白的分泌量[Vinculin siRNA1組(3.59±0.006)ng/mL，Vinculin siRNA2組(3.67±0.009)ng/mL]與對照組(3.48±0.03)ng/mL相比差異無統計學意義(P>0.05)。

討 論

HSC激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞時，可發現門脈區域的擴增以及Vinculin的強陽性表達，也被證明可以作為門脈區域成纖維細胞被活化的標記[8]。本研究通過肝組織HE染色及Masson染色、HSC的標志性分子Desmin及HSC活化標記分子α-SMA免疫組化染色等方法證實腹腔注射CCl48周后成功誘導小鼠肝纖維化[9]。免疫組織化學染色發現纖維化肝組織中Vinculin表達量明顯增高，定位于HSC細胞膜。用siRNA敲減小鼠HSC細胞株內Vinculin可導致Desmin與α-SMA的表達下調，表明Vinculin與HSC的活化有關。肝纖維化的病理機制是活化的HSC產生過量的膠原纖維。有研究表明，隨著肝纖維化的進程至晚期，正常含非纖維形成膠原的低密度基底膜膠原(Ⅳ、Ⅴ型)轉換為富含纖維形成膠原的高密度間質膠原(Ⅰ、Ⅲ型)，Ⅰ型不溶性膠原纖維顯著增加，取代Ⅲ型膠原纖維合成為肝內主要膠原，導致纖維化加重[10]。由此猜測Vinculin可能抑制Ⅰ型膠原纖維的生成，從而阻斷肝纖維化進程。采用ELISA方法檢測敲除Vinculin后細胞上清中Ⅰ型膠原纖維和Ⅳ型膠原纖維量，結果顯示兩種膠原纖維的表達量比值未產生明顯改變，提示Vinculin介導的肝纖維化可能存在新機制。有研究發現Vinculin在神經元早期分化過程中高表達，與其他細胞骨架協同通過改變神經元形態而使其向不同方向分化[11-13]。在肝纖維化過程中，肝星形細胞的活化同樣伴隨著細胞形態發生變化，損傷刺激誘導的過表達Vinculin可能通過細胞形態變化介導肝星形細胞活化過程，但其分子機制需進一步探明。本研究結果表明Vinculin過表達與肝纖維化有關，下調Vinculin有望抑制肝纖維化進程。