人工合成的亞硝基化合物MNNG 致人胃黏膜上皮細胞惡性轉化模型的建立及機制分析

王霞，葉景鴻，許尤琪

南京中醫藥大學第二附屬醫院（江蘇省第二中醫院），南京210017

胃癌的病因復雜，其中飲食習慣是一個相當重要的影響因素。在中國人偏愛的腌制食品中含有大量亞硝胺類化合物，而亞硝胺類化合物是胃癌發生的高危因素。N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）是人工合成的亞硝基化合物，常作為典型的模式化學誘變劑和致癌劑用于研究N-亞硝基類致癌物的致癌機制。我們前期的研究證實，MNNG 能誘導大鼠胃癌前病變的發生，是研究天然植物預防胃癌的最常用致癌劑［1］。人胃黏膜上皮細胞GES-1 具有正常人胃上皮細胞的特性和功能，可以在體外穩定傳代，常被用于研究胃上皮細胞惡性轉化以及胃癌的發生。2017 年7 月—2018 年7 月，我們采用MNNG誘導GES-1 細胞惡性轉化，觀察其對GES-1 細胞形態及細胞增殖、凋亡、遷移能力的影響，探討MNNG構建胃黏膜上皮細胞惡性轉化模型的可行性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人胃黏膜上皮細胞GSE-1由酶聯生物公司提供。MNNG（士鋒生物），RNA 提取試劑（康為世紀），RIPA 細胞裂解液（北京普利萊基因技術有限公司），PVDF 膜（Millipore），超敏發光液（賽默飛），小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體、辣根酶標記山羊抗鼠IgG（中杉金橋，1∶2 000），兔抗人LC3Ⅱ多克隆抗體（博奧森生物，1∶1 000），兔抗人Beclin1 多克隆抗體（Abcam 公司，1∶2 000）。顯微鏡（OLYMPUS），CO2培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），熒光PCR 儀、超高靈敏度化學發光成像系統［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］，蛋白垂直電泳儀（北京市六一儀器廠），倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電有限公司）。

1.2 細胞培養 取GES-1 細胞，加入DMEM 培養液，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱中培養。當細胞密度達到80%時，PBS沖洗，加入0.25%胰酶消化。收集細胞懸液，1 000 r/min 離心3 min，棄上清液，加入培養基重懸細胞，放入培養箱中繼續培養。取對數生長期細胞，加入6孔板中，加入10%DMEM調整細胞密度為5×105/孔，放置培養箱中培養。

1.3 細胞分組與處理 待細胞完全貼壁后，將細胞分為空白對照組、溶劑對照組和MNNG 誘導組。MNNG 加入適量DMSO 溶解，配成0.17 mmol/L 的MNNG溶液，用含10%FBS的RPMI1640培養液稀釋成2 μmol/L 的MNNG 溶液。空白對照組正常培養，MNNG 誘導組用含2 μmol/L MNNG 的培養液培養，溶劑對照組加入等體積的DMSO［2］。持續4 周，其間正常傳代培養；第5周觀察細胞惡性轉化情況。

1.4 細胞形態學觀察 采用伊紅染色。向細胞中加入細胞固定液固定15 min，PBS浸洗3次。蘇木精染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，返藍液返藍15 s，流水沖洗。伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，超凈高級封片膠，200倍顯微鏡下觀察。

1.5 細胞增殖能力觀察 采用平板克隆實驗。取細胞培養至對數生長期，加入0.25%胰蛋白酶消化，離心，制成細胞懸液，按3×102/孔接種于6 孔板中。加入20% DMEM 培養10 d，待集落形成后，棄培養液，PBS浸洗，加入甲醇—醋酸固定液（甲醇∶醋酸=3∶1）固定15 min。棄固定液，加入Giemsa 染液染色10～30 min，流水洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置，疊加一張帶網格的透明膠片，在倒置顯微鏡（×100）下計數大于10個細胞的克隆數，計算克隆形成率。克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.6 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。取細胞加入6 孔板，培養至細胞密度達到90%以上。使用無菌10 μL槍頭沿6孔板底部做“一”形劃痕，保證每孔寬度盡量一致。棄培養基，PBS 清洗3 次，換成無血清培養基后拍照。將細胞放入培養箱中繼續培養，于24、48 h 時再次拍照。根據0、24、48 h 的劃痕寬度計算24 h 和48 h 的細胞遷移速度，細胞遷移速度=遷移距離/遷移時間。

1.7 細胞自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1 表達檢測采用Western blotting 法。取細胞加入裂解液，冰上裂解30 min 后，4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，獲得總蛋白。BCA 法測定總蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸使蛋白變性。取總蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉至PVDF 膜上，4%脫脂奶粉封閉。加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入相應的二抗，室溫孵育1～2 h。滴加ECL曝光液，凝膠成像系統中曝光。采用Quantity One 軟件分析抗體條帶灰度值。以目標條帶與內參的灰度比值表示目標蛋白的相對表達量。

1.8 細胞LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR 法。提取細胞RNA，逆轉錄合成cDNA。以cDNA 為模板，在熒光定量PCR 儀上進行擴增。擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下：LC3 Ⅱ上游引物5"-AGCAGCATCCAACCAAAAT-3"，下游引物5"-CGTCTCCTGGGAGGCATA-3"，產物長度281 bp；Beclin1 上游引物5"-AAAACCAGATGCGTTATGCC-3"，下游引物5"-CAGCCTGAAGTTATTGATTGTG-3"，產 物 長 度 為119 bp。PCR 反應體系（25 μL）：RNase Free dH2O 9.5 μL，cDNA/DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×ULtra SYBR Mixture 12.5 μL。反應條件：預變性95 ℃10 min，變性95 ℃10 s，退火57 ℃30 s，延伸72 ℃30 s；循環40 次。以GAPDH 為內參，計算目的基因的相對表達量。

1.9 裸鼠成瘤情況觀察 取4～6 周齡裸鼠15 只，隨機分成3 組，每組各5 只。取空白對照組、溶劑對照組和MNNG 誘導組細胞株，加入0.25%胰酶消化，PBS離心洗滌，配制成細胞密度為5×106/mL的細胞懸液。取0.2 mL 細胞液（約1×106個細胞），接種于裸鼠右前肢皮下。繼續飼養4周，每隔4 d測量裸鼠體質量，觀察瘤體生長情況。4 周末處死裸鼠，取出瘤體，觀察瘤體情況；行HE 染色，200 倍光鏡下觀察瘤體病理變化。

1.10 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料以±s 表示，組間兩兩比較采用t 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組細胞形態改變情況 空白對照組、溶劑對照組細胞形態規則，排列有序，多成單層生長，形狀以多邊形為主，MNNG誘導組細胞體積增大，形態不規則，排列紊亂，部分細胞呈團塊狀生長，部分細胞呈梭形。HE 染色后，MNNG 誘導組可見核分裂像，多數細胞具有單核，也出現多核巨大細胞，胞質內可見空泡，細胞周邊毛刺狀。

2.2 三組細胞增殖能力比較 空白對照組、溶劑對照組、MNNG 誘導組細胞克隆形成率分別為7.44%± 0.12%、10.12% ± 1.45%、18.61% ± 2.01%，MMNG 誘導組細胞克隆形成率高于其他兩組（P 均＜0.05）。

2.3 三組細胞遷移能力比較 24 h時空白對照組、溶劑對照組、MNNG 誘導組細胞遷移速度分別為（4.84 ± 1.12）、（5.09 ± 1.22）、（5.70 ± 0.27）μm/h；48 h 時三組細胞遷移速度分別為（6.57 ± 0.93）、（6.21±0.51）、（8.35±0.50）μm/h。MNNG誘導組細胞遷移率高于空白對照組、溶劑對照組（P均＜0.05）。

2.4 三組細胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表達水平比較 與空白對照組、溶劑對照組比較，MNNG誘導組LC3Ⅱ、Beclin1 蛋白及mRNA 表達水平均降低（P均＜0.05）。見表1。

2.5 三組細胞成瘤情況 三組裸鼠均存活，攝食、活動量、精神狀態正常，體質量無明顯變化。空白對照組、溶劑對照組未成瘤，MNNG 組成瘤4 只。MNNG 組接種1 周后注射局部可觸及腫物，呈局限膨脹性生長，3 周左右瘤體不再繼續增大，未觀察到明顯的浸潤或轉移灶。瘤體剝離后見完整包膜，血供豐富，表面光滑，邊界清楚。HE染色顯示，腫瘤組織炎性細胞浸潤，細胞結構紊亂，排列不規整。

表1 三組細胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表達（±s）

表1 三組細胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表達（±s）

注：與MNNG誘導組比較，*P＜0.05。

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3 討論

胃癌發病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者就診時已發生局部或遠處轉移，預后不佳，晚期胃癌的5年生存率僅為15%左右［3］。研究胃癌發病的影響因素，對早期預防胃癌、減少腫瘤相關死亡具有重要意義。流行病學資料顯示，亞硝基化合物與胃癌的發生密切相關。人體中的亞硝基化合物主要通過亞硝胺腌制和加工的肉制品、其他食物和乙醇飲料以及體內細菌還原硝酸鹽而產生［4］。MNNG 是人工合成的亞硝基化合物，常作為典型的模式化學誘變劑和致癌劑用于研究N-亞硝基類致癌物的致癌機制［5-7］。本研究結果顯示，GES-1 細胞在MNNG 的刺激下，細胞形態逐漸發生變化，細胞無序化生長，大小不一，排列紊亂，可見多核巨細胞，成團塊狀生長。細胞體積增大，周邊可見毛刺狀，胞質內空泡增多。細胞集落形成數增加，克隆形成率增加，證實細胞的增殖活性增加。細胞愈合面積變大，表明其遷移能力增強。細胞形態向畸形和不規則改變，細胞增殖和遷移能力明顯增強，提示其轉化為具有惡性增殖和轉移特征的細胞。

自噬是細胞維持自身內環境穩定以進行正常增殖和分化的重要方式，同時也能幫助細胞度過應激狀態而生存下來。細胞內自噬功能的異常可導致腫瘤等一系列疾病的發生。正常情況下，自噬有利于細胞保持自穩狀態；發生應激時，自噬防止有毒或致癌物損傷蛋白質及細胞器的積累，抑制細胞癌變［8］。如細胞自噬功能缺陷，損傷的細胞器和大分子物質可以在細胞內積聚，誘發氧化應激、DNA 損傷和染色體不穩定等，從而誘導原癌基因突變，增加癌變風險［9］。研究發現，肝癌前病變期肝細胞自噬活動降低至正常的50%，肝癌細胞中自噬降低至正常的20%，胰瘤向胰癌轉化過程中自噬活性明顯降低［10］。

微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3）是自噬體標記蛋白，可作為自噬的檢測標志物。細胞內新合成的LC3加工后成為胞質可溶形式的LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ經泛素化修飾和剪切后，結合自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺，形成自噬體形式的LC3-Ⅱ，細胞自噬過程進行到自噬泡即將形成閉合結構時，只有膜結合形式的LC3-Ⅱ定位于自噬泡膜上。因此可以根據Ⅱ型LC3 表達的水平或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值判斷細胞自噬水平［11］。Beclin-1 是自噬核心復合物中重要的組成部分，在調節自噬起始囊泡形成的過程中起關鍵作用，是自噬第一階段不可或缺的基因［12］，表達缺失使細胞自噬活性降低從而導致腫瘤細胞異常生長［13］。Beclin-1 表達缺陷能夠降低細胞的自噬水平，誘導乳腺癌、肝細胞癌等的癌前病變，更易誘發腫瘤［14］。實驗證實Beclin-1 在慢性非萎縮性胃炎、癌前病變、胃癌組織中的表達活性逐漸減弱［15-16］，可以通過促進細胞凋亡和減少細胞遷移來抑制胃癌的進展［17］。

裸鼠體內腫瘤生長與接種細胞的增殖、侵襲及轉移密切相關。MNNG誘導的胃黏膜上皮細胞不影響裸鼠的生活狀態，能促進瘤體的發生，組織學病理顯示腫瘤組織炎性細胞浸潤，細胞結構紊亂，排列不規整，這些都和胃癌前期的發展有相似之處。

本研究利用小劑量MNNG 持續刺激GES-1細胞模擬人類攝入亞硝酸鹽類食物，結果顯示GES-1 細胞的增殖和遷移能力明顯增強，發生惡性轉化；其作用機制可能與細胞自噬相關。本研究為后續研究中藥對胃黏膜細胞惡性轉化的作用機理建立了一個可行的細胞模型。