BMP-4對甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學行為的影響及其分子機制

孟曉梅，巴茂文，王紹光，于歲，李寧，唐與曉

青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院，山東煙臺264000

甲狀腺癌是最常見的內分泌器官來源的惡性腫瘤，近年來其發病率呈逐漸上升趨勢。甲狀腺乳頭狀癌（PTC）是甲狀腺癌中最常見的類型，部分PTC具有較高的侵襲性，導致生存率及生存質量下降。研究顯示，上皮—間質轉化（EMT）在甲狀腺癌細胞侵襲轉移中起重要作用［1］。細胞通過EMT獲得轉移和侵襲能力，多個因子如Snail、Slug、Twist 等參與調節EMT［2］。骨形態發生蛋白4（BMP-4）是骨形態發生蛋白（BMPs）家族成員之一，其在多種類型的腫瘤中有表達，對腫瘤細胞生長的影響呈現多樣性，可促進神經膠質瘤、前列腺癌及肝癌細胞增殖［3-5］，抑制乳腺癌和肺癌細胞生長［6-7］，對惡性黑色素瘤和卵巢癌細胞生長則沒有影響［8-9］。研究發現，BMP-4 與腫瘤細胞發生EMT 有關，BMP-4能夠通過誘導EMT 促進肝癌細胞侵襲和轉移，沉默BMP-4 基因可阻止EMT 的發生及腫瘤轉移［10］。BMP-4 可通過Smad 依賴性信號通路發揮促進腫瘤侵襲和轉移的作用［11］，其中Smad1參與BMPs信號轉導，在信號由細胞膜傳遞至細胞核的過程中起關鍵性作用。目前關于BMP-4 在PTC 中作用的研究尚未見報道。2018 年11月—2019年10月，我們通過觀察BMP-4對PTC細胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響，并探討其與Smad1信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 PTC 細胞株TPC-1、K1、B-CPAP 購自中國科學院上海細胞庫。凋亡試劑盒購自eBioscience 公司，侵襲試劑盒及RMPI1640 購自Corning 公司，ECL 檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司。胎牛血清購自Ausbian 公司，反轉錄試劑盒購自Promega 公司，聚丙烯酰胺購自Bio-Rad 公司。兔抗人GAPDH 多克隆抗體、兔抗人E-Cadherin多克隆抗體、兔抗人Vimentin 單克隆抗體及兔抗人Smad1 單克隆抗體均購自Chemicon Millipore 公司。過表達及干擾BMP-4 重組慢病毒、引物由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。

1.2 BMP-4 mRNA 高表達和低表達PTC 細胞的篩選 取B-CPAP、TPC-1、K1 細胞，加入含10%FBS 的RMPI1640 培養液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的密度、形態以及貼壁情況，當細胞融合度達到80%～90%時用于實驗。采用qPCR 法檢測細胞中BMP-4 mRNA表達水平。TRIzol 法提取細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA，以此為模板進行qPCR 擴增。引物序列：BMP-4 上 游5"-CCTGGGCACCTCATCACA-3"，下 游5"-CATAGTTTGGCTGCTTCTC-3"。反應條件：95 ℃預熱30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環。以GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCt法計算BMP-4 mRNA 的相對表達量。結果顯示，B-CPAP 細胞BMP-4 mRNA表達量最低，TPC-1細胞BMP-4 mRNA表達量最高。

1.3 細胞分組與病毒感染 取B-CPAP、TPC-1 細胞，加入胰酶消化，用完全培養基制成（3～5）×104/mL的細胞懸液，接種到培養板中。培養至鋪板量達到15%～30%后，將B-CPAP 細胞分為陰性對照組和過表達組，分別感染陰性片段、過表達BMP-4 重組慢病毒；TPC-1 細胞分為陰性對照組和干擾組，分別感染無效干擾片段和干擾BMP-4 重組慢病毒。病毒滴度：B-CPAP陰性對照組為1×109TU/mL，過表達組為5×108TU/mL；TPC-1 陰性對照組為6×108TU/mL，干擾組為8×108TU/mL。加入病毒后10 h 換為常規培養基培養。感染后72 h，熒光顯微鏡觀察感染率達到70%以上，表明感染有效，可進行下一步實驗。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用MTT 法。感染5 d后收集各組細胞，加入胰酶消化。加入含10% FBS的DMEM 培養液并中和、離心收集，重懸后獲得細胞懸液，調整細胞密度為5×104/mL，接種于96 孔板中培養5 d。從鋪板后次日開始，培養終止前4 h 加入20 μL 5 mg/mL MTT，作用4 h 后吸去培養液，加100 μL DMSO 溶解甲瓚顆粒，振蕩2～5 min。上酶標儀，于490 nm波長處檢測光密度（OD）值。

1.5 細胞凋亡檢測 采用Annexin V-APC 單染法。感染5 d 后收集各組細胞，胰酶消化，完全培養基重懸成細胞懸液，接種于6 孔板中，每組設3 個復孔（為保證上機細胞數足夠，細胞數目≥5×105/L）。1 300 r/min 離心5 min，棄上清，4 ℃預冷的D-Hanks（pH=7.2～7.4）洗滌細胞沉淀，1×binding buffer 洗滌細胞沉淀，1 300 r/min 離心3 min，收集細胞，200 μL 1×binding buffer 重懸細胞沉淀，加入10 μL Annexin V-APC 染色，室溫避光10～15 min，根據細胞量，補加400～800 μL 1×binding buffer，上機檢測。使用流式細胞儀分析軟件Guava InCyte進行分析。

1.6 細胞侵襲能力觀察 采用Corning 實驗。上室中培養基加入500 μL細胞懸液，下室內加入750 μL 30% FBS 培養基，同時使用該細胞懸液鋪一塊MTS 96 孔板，每孔接種5×103個細胞，接種后即測定OD570，作為侵襲參照。37 ℃培養箱培養B-CPAP 細胞18 h，培養TPC-1 細胞48 h，移去小室內非侵襲細胞，染色轉移細胞3～5 min 后，將小室浸泡沖洗數次，晾干，顯微鏡拍照計數。

1.7 細 胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA 檢測 感染后72 h 采用qPCR 法進行檢測，實驗步驟同“1.2.2”。引物序列：E-Cadherin 上游：5"-AACGCATTGCCACATACA-3"，下游：5"-CGGGCTTGTTGTCATTC-3"；Vimentin 上 游 ：5"-AATGGCTCGTCACCTTCG-3"，下游：5"-CTAGTTTCAACCGTCTTAATCAG-3"；Smad1 上 游：5"-ATGCCGAATGCCTTAGTG-3"，下 游：5"-ACATCCTGGCGGTGGTA-3"；GAPDH 上游：5"-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3"，下游：5"-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3"。

1.8 細胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1蛋白檢測 采用Western blotting法。感染72 h 后收集細胞，提取蛋白，每孔道上40 μg 蛋白樣品，聚丙稀酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育（兔抗人E-Cadherin 多抗、兔抗人Vimentin 單抗，兔抗人Smad1 單 抗，兔抗人GAPDH 多 抗，均1∶1 000 稀釋），4 ℃過夜共孵育，次日洗膜，二抗孵育（辣根過氧化物酶標記的相應二抗，1∶5 000 稀釋），洗膜，顯像。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標蛋白與內參灰度值比值表示目標蛋白的相對表達量。

1.9 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以±s 表示，兩組間比較采用配對t 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 B-CPAP 細胞中，過表達組和陰性對照組OD 值分別為2.96 ± 0.05、2.55±0.01，過表達組高于陰性對照組；TPC-1 細胞中，干擾組和陰性對照組OD 值分別為2.26±0.10、4.04±0.06，干擾組低于陰性對照組（P均＜0.01）。

2.2 各組細胞凋亡率比較 B-CPAP細胞中，過表達組和陰性對照組的細胞凋亡率分別為1.63%±0.10%、3.60% ± 0.21%，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；TPC-1細胞中，干擾組和陰性對照組的細胞凋亡率分別為16.29%±0.78%、4.52%±0.19%，干擾組高于陰性對照組（P＜0.01）。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 B-CPAP 細胞中，過表達組和陰性對照組細胞轉移數分別為（58 ± 5）、（53±3）個，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；TPC-1 細胞中，干擾組和陰性對照組的細胞轉移數分別為（14 ± 1）、（21 ± 3）個，干擾組少于陰性對照組（P＜0.05）。

2.4 各組E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA 及蛋白表達比較 B-CPAP細胞中，過表達組和陰性對照組E-Cadherin、Vimenin、Smad1 mRNA 及蛋白表達比較差異均無統計學意義（P 均＞0.05），見表1；TPC-1細胞中，干擾組和陰性對照組E-Cadherin、Smad1 mRNA 及蛋白表達量比較差異無統計學意義（P 均＞0.05），Vimenin mRNA 及蛋白表達量干擾組低于陰性對照組（P＜0.01），見表2。

表1 兩組B-CPAP細胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表達比較（±s）

表1 兩組B-CPAP細胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表達比較（±s）

注：與陰性對照組比較，P均＞0.05。

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表2 兩組TPC-1細胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表達比較（±s）

表2 兩組TPC-1細胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表達比較（±s）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.01。

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3 討論

大部分PTC患者經過有效合理的治療后預后良好，但部分PTC 具有較高的侵襲性，出現腫瘤進展、轉移和術后復發等，導致患者的生存率及生存質量下降。因此，研究PTC 細胞的生長、浸潤和轉移過程，尋找PTC 中差異性表達、預測腫瘤侵犯、轉移的生物學標記和干預治療的分子，對于進一步改善患者預后具有重要意義。BMP-4 是骨形態發生蛋白BMPs 家族成員之一，表達于多種類型的腫瘤，且對不同腫瘤細胞生長的影響不同。我們前期對PTC患者的研究顯示，BMP-4蛋白在腫瘤直徑＞1 cm患者中的高表達率高于腫瘤直徑≤1 cm 者，在有包膜浸潤患者中的高表達率高于無包膜浸潤者，在TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期患者中的高表達率高于Ⅰ+Ⅱ期者。這提示高表達BMP-4的PTC患者更容易發生腫瘤侵襲轉移，BMP-4 可能在PTC 的侵襲和轉移中起重要作用［12］。

腫瘤共性的生物學特征是失控性生長，其主要分子機制是細胞周期紊亂導致細胞增殖過多和調亡過少。MA等［13］報道，BMP-4可通過加速G1/S細胞周期進展而促進肝癌細胞增殖。本研究結果顯示，PTC細胞系B-CPAP、TPC-1、K1 中均可檢測到BMP-4 表達，B-CPAP細胞感染過表達BMP-4慢病毒后增殖能力增加，TPC-1 細胞感染干擾BMP-4 慢病毒后增殖能力下降而凋亡率增加，表明BMP-4 可促進PTC 細胞增殖、抑制其凋亡。

上皮細胞喪失極性、黏附性下降，且細胞骨架重塑，轉化為具有活動能力的間質細胞，這個過程被稱為EMT。EMT 與腫瘤的侵襲、轉移密切相關。KNAUF 等［14］報道，PTC 進展至低分化癌過程中癌細胞發生了EMT。VASCO 等［15］研究顯示，與腫瘤中心區域比較，PTC 侵襲性區域中EMT 相關基因表達升高。BMP-4 對腫瘤細胞轉移及EMT 有調節作用，且在不同腫瘤中的表現不同。DENG等［16］報道，BMP-4通過誘導EMT 促進胃癌轉移；FEELEY 等［17］報道，BMP-4 對前列腺癌細胞系的細胞轉移沒有影響；ZHAO 等［18］報 道，BMP-4 可 促 進 膠 質 瘤 細 胞ECadherin 表達從而抑制腫瘤轉移；在乳腺癌細胞系MDA-MB-231 和MCF-7 中，BMP-4 高表達可抑制腫瘤細胞增殖、促進侵襲和轉移，具有抑制腫瘤及促進腫瘤的雙重作用［6，19］。KETOLAINEN 等［20］對9 個乳腺癌細胞系給予外源性BMP-4 后，所有細胞系都表現出細胞增殖能力下降，而細胞轉移的變化在不同的細胞系表現不同。MDA-361 細胞轉移能力顯著增加，T-47D細胞轉移能力下降，而HCC38、SK-BR-3、ZR-75-30 細胞轉移能力無明顯變化。以上研究表明，腫瘤細胞對BMP-4 作用的反應各異，存在細胞特異性。本研究結果顯示，B-CPAP細胞過表達組與陰性對照組的細胞侵襲能力無明顯差異，TPC-1 細胞干擾組的侵襲能力較陰性對照組下降，表明BMP-4可增加TPC-1細胞的侵襲能力，對B-CPAP細胞侵襲能力則沒有產生影響。兩個細胞系表現不同，可能是細胞系特異性所致。

E-Cadherin 是上皮細胞標志物，抑制E-Cadherin表達或阻斷其功能可致細胞間質形態改變，有利于細胞侵襲和轉移［21］。Vimentin 是間質細胞標志物，除了參與構成細胞支架、維持細胞的完整性外，還與腫瘤的侵襲、轉移關系密切［22］。RODRIGUEZ 等［23］報道，Vimentin 可能是EMT 的上游調節因子，沉默Vimentin 基因后，EMT 過程可出現逆轉。本研究結果顯示，雖然B-CPAP 細胞兩組間E-Cadherin 及Vimentin mRNA 及蛋白表達無明顯差異，但TPC-1細胞干擾組Vimentin 的表達低于陰性對照組，提示BMP-4在該細胞系與EMT的發生有關。

BMPs 發揮作用主要是通過Smad 依賴性及非Smad依賴性兩條信號通路［24］。Smad蛋白是Smad依賴性通路中細胞內信號傳導的樞紐［25］，其中Smad1參與BMPs 信號轉導，在信號由細胞膜傳遞至細胞核的過程中起到了關鍵性的作用。此外，BMPs還可通過其他信號通路來發揮作用，包括細胞外調節蛋白激酶、p38 絲裂原活化蛋白激酶通路［18］。研究發現，BMP-4可通過Smad依賴性信號通路發揮促進腫瘤侵襲轉移的作用，還可通過非Smad依賴性信號通路發揮作用［26］。本研究結果顯示，B-CPAP細胞過表達BMP-4 及TPC-1 細胞干擾BMP-4 表達后，與陰性對照組相比Smad1 均無明顯變化，提示在PTC 細胞系中BMP-4 發揮作用不是通過Smad1 通路，可能是通過其他通路。

綜上所述，BMP-4 在PTC 細胞中存在表達且具有促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用，干擾BMP-4 表達可抑制細胞發生EMT 及細胞轉移，提示BMP-4 可能成為預測PTC 侵襲轉移的生物學標記，但關于BMP-4 發揮作用經由的信號通路及調控機制還需要進一步的研究。