甘藍型油菜早熟性狀QTL定位及候選基因篩選

李書宇 黃 楊 熊 潔 丁 戈 陳倫林 宋來強

甘藍型油菜早熟性狀QTL定位及候選基因篩選

李書宇 黃 楊 熊 潔 丁 戈 陳倫林*宋來強

江西省農業科學院作物研究所, 江西南昌 330200

目前對于油菜早熟的研究主要圍繞開花期性狀進行, 雖然開花期與生育期呈顯著正相關, 但卻并不完全一致。對于油菜開花后一系列生長發育進程相關性狀的遺傳研究和QTL定位鮮有報道。本研究以成熟期差異較大的2個油菜品種‘花前早’和‘Global’構建的DH群體為材料, 對影響油菜全生育期的各個發育階段(開花期、花期持續時間、角果期持續時間和全生育期等)進行表型調查和QTL定位分析。共檢測到30個早熟相關性狀QTL位點, 其中開花期、花期持續時間、角果期持續時間和全生育期等分別檢測到12、5、4和9個QTL位點, 解釋了5.8%~22.4%的表型方差。發現4、2和1個全生育期QTL置信區間分別與開花期、花期持續時間、角果期持續時間位點置信區間完全或部分重疊。篩選到29個可能與油菜早熟性狀相關的候選基因, 它們通過調控花期或籽粒發育等生長發育進程影響油菜早熟。因此, 在早熟性狀的研究中, 可以同時從開花期和籽粒發育過程入手, 不但有利于使熟期進一步提前, 也可減緩早熟油菜品種過早開花導致的冬前低溫寒潮天氣的不利影響。

甘藍型油菜; 早熟; QTL作圖; 候選基因

油菜是我國重要的油料作物, 菜籽油是城鄉居民主要的食用植物油[1-2]。在當前我國植物油自給率持續下降的形勢下, 穩定甚至增加國內油菜生產對保障我國食用植物油供給安全具有重要的戰略性意義[3]。油菜不與糧食爭地, 發展南方700萬公頃冬閑田種植油菜是解決這一問題的有效方法[4-5]。早熟對于大多數農作物來說是一個重要的農藝性狀, 一方面可解決作物復種中的茬口緊張問題, 提高復種指數, 增加全年作物總產; 另一方面, 在高緯度、高海拔、無霜期短的高寒地區不僅可以充分利用高寒地區的光溫資源, 還可避免生育前期低溫冷害和生育后期的早霜危害, 從而保證作物的產量和品質, 對作物安全生產具有十分重要的意義[6-7]。油菜早熟性狀的遺傳解析, 對于早熟油菜品種的選育具有重要的理論與現實意義[8]。

對于油菜早熟性狀的研究, 前人主要通過QTL連鎖分析或GWAS手段解析其遺傳基礎[9-12]。Ferreira等[13]首次利用DH群體和含有132個RFLP標記的遺傳圖譜, 在A9、C2和C6染色體上檢測到3個開花期主效QTL, 其中位于A9染色體上的位點表型貢獻率達到28%。Long等[14]利用甘藍型油菜品種TN-DH及其衍生群體, 在11個環境中共檢測到42個開花期QTL位點, 其中最大表型貢獻率達到52%, 并證實主效區間內基因是油菜開花調控的關鍵基因。Zhou等利用300份油菜資源和201,817個SNP標記, 對早熟相關性狀進行GWAS分析, 檢測到131個顯著關聯的SNP位點, 解釋了表型方差的3.27%~13.17%, 此外, 通過單倍型分析和擬南芥同源比對, 篩選得到57個油菜開花期調控基因。Mei等[15]利用早、晚花油菜親本構建的F2:3家系為材料, 通過2年田間表型考察, 共檢測到6個開花期QTL, 解釋了表型方差的8.1%~ 30.4%。Xu等[9]利用523份油菜種質資源, 在8個環境下對開花期性狀進行全基因組關聯分析, 檢測到41個顯著關聯位點, 其表型方差為5.28%~15.75%。截至目前, 在所有19條油菜染色體中均檢測到早熟相關性狀QTL, 這表明油菜早熟性狀具有復雜的遺傳基礎[16-17]。

目前報道的油菜早熟性狀QTL定位主要集中在開花期[18-22], 雖然開花期與生育期呈顯著正相關, 但卻并不完全一致。開花期可反映開花前生育進程的快慢, 但不能反映開花以后植株生長發育狀況。對于油菜開花后一系列生長發育進程相關性狀的遺傳研究和QTL定位鮮有報道。本研究對影響油菜全生育期的各個發育階段(開花期、花期持續時間、角果期持續時間)進行研究, 分析各個發育進程的特點及對于油菜早熟形成的影響, 以指導早熟油菜的新品種選育。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用成熟期差異較大的2個油菜品種‘花前早’和‘Global’為親本, 通過人工雜交獲得F1代種子。在初花期對F1植株取樣進行小孢子培養, 通過組織培養方法, 小孢子胚進行無菌繼代培養, 成苗后移栽至大田。在花期對小孢子苗套袋, 成熟期收獲自交種子后即獲得該DH群體種子。

1.2 田間試驗

2016年10月至2017年5月、2018年10月至2019年5月在江西省農業科學院試驗基地(2016南昌, 2018南昌), 2016年10月至2017年4月在韶關市農業科學研究所試驗基地(2016韶關), 2018年4月至2019年8月在西寧青海大學試驗基地(2018西寧)完成了DH群體種植和早熟性狀調查工作。該DH群體共包含184個株系及親本。田間試驗采用完全隨機區組設計, 2次重復。每小區種3行, 小區廂寬2.0 m, 行距33.3 cm, 小區面積2.0 m2, 單株間平均間距15 cm。田間管理按當地常規標準實施。

1.3 性狀考察和數據分析

參考《油菜種質資源描述規范和數據標準》調查早熟性狀, 其中, 全區25%植株開花為開花期標準, 全區75%以上花序完全謝花(花瓣變色, 開始枯萎)為終花期標準, 全區75%以上角果呈枇杷黃色, 或主軸中段角果內種子開始呈現成熟色為成熟期標準。開花期指從播種到初花期所需的天數。開花期至終花期的時間跨度為花期持續時間, 終花期至成熟期的時間跨度為角果期持續時間。

1.4 全基因組重測序

在苗期對DH群體所有株系及親本取樣, 取幼嫩葉片, 采用CTAB法提取DNA。基于Illumina HiSeq平臺進行雙末端(PE150)測序, 利用cutadapt和trimmomatic軟件對測序數據進行質控過濾, 采用BWA軟件將測序數據與參考基因組進行比對, 使用Samtools軟件和Picard工具進行格式轉換和reads排序, 最后使用GATK (v. 3.7)軟件進行變異檢測以獲得SNP變異位點。

1.5 遺傳圖譜構建與QTL定位

參考Xie等[23]提出的方法進行遺傳連鎖圖譜的構建, 首先, 根據子代群體內標記之間的連鎖關系推斷親本的基因型, 并根據親本基因型將子代基因型轉換為A和B, 同時也可以與實際獲得的親本基因型進行比較, 以判斷親本材料的真實性; 其次, 基于隱馬爾可夫模型(HMM)填補缺失的基因型, 并對部分錯誤基因型進行修正; 最后, 根據MSTMap軟件描述的方法評估標記之間的重組率, 然后使用Kosambi作圖函數計算標記之間的遺傳圖距。使用QTL Cartographer (v. 1.17)軟件進行QTL分析, 分析方法選擇的是復合區間作圖法, LOD閾值用1000次重復排列測驗確定(=0.05)。

1.6 候選基因的篩選

利用甘藍型油菜基因組ZS11-v20200127 (http:// cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/rape/download_ext), 在QTL置信區間內查詢相應的基因序列, 然后與擬南芥基因組序列(https://www.arabidopsis.org/Blast/index. jsp)進行BLAST (參數設置為: e-10), 參考其同源注釋, 篩選出與油菜早熟性狀相關的候選基因。

2 結果與分析

2.1 親本和群體表型

親本‘花前早’和‘Global’早熟各相關性狀差異較大,測驗結果表明, 所有環境中, 雙親在花期、花期持續時間、全生育期的差異均達到極顯著水平(表1)。雙親角果期持續時間的差異在不同環境中表現不同(表1)。DH群體各早熟相關性狀在不同年份均呈現廣泛的變異, 且在各個環境下都呈正態或近似正態分布(圖1), 符合數量性狀的典型特征, 適宜采用QTL手段解析其早熟性狀的遺傳基礎。

對上述4個早熟性狀進行相關性分析(表2)表明,開花期、花期持續時間、角果期持續時間等性狀與全生育期均顯著相關, 其相關系數分別為0.926、-0.701和0.158。

表1 親本和DH群體在4個環境下的早熟相關性狀表型

同列中不同大寫和小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上差異達到顯著。

Different uppercase and lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

表2 DH群體4個早熟性狀的相關性分析

*和**分別表示在0.05和0.01水平上顯著相關。

*,**: Significant correlations at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

2016 NC, 2016 SG, 2018 NC和2018 XN分別指2016年南昌, 2016年韶關, 2018年南昌和2018年西寧。

2016 NC, 2016 SG, 2018 NC, and 2018 SG were the code of different environment: 2016 Nanchang, 2016 Shaoguan, 2018 Nanchang and 2018 Xining, respectively.

2.2 遺傳圖譜構建

經過對測序數據進行質控過濾、BWA比對, 變異檢測注釋等一系列生物信息分析后, 共獲得875,740個變異位點。參考Xie等[23]提出的方法, 篩選出874,995個高質量多態性的SNP標記用于構建遺傳連鎖圖譜。各連鎖群長度在62.56~ 206.71 cM之間, 平均長度為136.88 cM。對上述SNP位點進行整合得到3905個Bin。各連鎖群Bin數目在140~320之間, 平均數目為206個; 各連鎖群上相鄰bin之間平均距離在0.42~0.98 cM之間。遺傳標記在各連鎖群上覆蓋密度較高, 且分布較為均勻(表3和圖2)。

表3 遺傳連鎖圖譜信息統計表

2.3 多環境下早熟性狀QTL定位

利用上述構建好的遺傳圖譜和DH群體表型數據, 采用QTL Cartographer (v. 1.17)軟件對南昌、韶關和西寧2年4個環境下的早熟相關性狀分別進行QTL掃描。共檢測到30個早熟相關性狀QTL位點, 其中開花期、花期持續時間、角果期持續時間和全生育期等分別檢測到12、5、4和9個QTL位點, 解釋了5.8%~22.4%的表型方差(表4)。其中,和位點可在多個環境中重復檢測到。發現4、2和1個全生育期QTL置信區間分別與開花期、花期持續時間、角果期持續時間位點置信區間完全或部分重疊(表4), 表明開花期、花期持續時間、角果期持續時間等各個發育階段均能影響油菜全生育期, 其中開花期影響最大。

表4 不同環境下檢測出的早熟相關性狀QTL

FT: 開花期; FPD: 花期持續時間; SPD: 角果期持續時間; FGP: 全生育期。

FT: flowering time; FPD: flowering period duration; SPD: silique period duration; FGP: full growth period.

2.4 候選基因預測

參考甘藍型油菜基因組ZS11-v20200127, 將30個QTL置信區間內序列和擬南芥的序列進行比對, 分別在A02、A06、A09、C04、C06、C07和C08染色體上的QTL 區間內篩選到29個可能與油菜早熟相關的候選基因(表5)。在開花期QTL區間內, 篩選到12個候選基因, 其中為基因, 介導春化作用, 參與的轉錄調控。有2個屬于基因家族, 在花分生組織活動中起著核心作用。的擬南芥同源基因影響mRNA加工, 參與開花時間的調控。的擬南芥同源基因為一年生冬性擬南芥延遲開花所必需。在花期持續時間QTL區間內, 篩選到的5個候選基因、S、、和分別與擬南芥、、、和同源, 其中直接參與開花時間調控,在花分生組織維持中起作用,參與花的發育, 光形態發生,參與花的發育, 對生長素刺激的響應和果實的發育等,為基因家族的成員, 編碼SCL13蛋白質。在角果期持續時間QTL區間內, 篩選到8個候選基因, 有2個候選基因與生長素調控響應相關, 3個候選基因與光合作用及光敏性相關, 2個候選基因編碼LEA家族蛋白, 與胚胎晚期發育有關, 1個候選基因編碼ENTH/ANTH/VHS超家族蛋白。在全生育期QTL區間內, 篩選到4個候選基因。其中,為基因, 參與調控植物從胚發生到花形成過程, 在乙烯介導的信號傳導中起關鍵作用。編碼MADS box家族轉錄因子, 參與調控根細胞分化和開花時間。編碼MIKC家族轉錄調控因子, 參與花粉發育。為基因, 參與晝夜節律。

3 討論

3.1 油菜遺傳圖譜構建

分子遺傳圖譜是進行油菜重要性狀QTL定位和基因克隆的基礎。早在1991年, Landry等[24]就利用103個RFLP標記, 構建了首張甘藍型油菜遺傳連鎖圖譜, 此后國內外實驗室陸續發布了多張遺傳圖譜, 但普遍存在密度較低和標記分布不均勻等問題, 這限制了QTL定位的效率和精度。近年來, 分子生物學技術的高速發展極大地推動了油菜高密度遺傳圖譜的構建。Shi等[25]利用1038個標記和BnaZN F2群體, 構建了一張長度為1763.2 cM的高密度遺傳圖譜, 其相鄰標記距離在1.45~4.01 cM之間, 平均2.19 cM。基于SNP芯片技術, Liu等[26]利用9164個SNP標記和RIL群體, 構建了長度為1832. 9 cM的油菜高密度遺傳圖譜, 其相鄰標記平均距離為0.66 cM, 分辨率大大提高。俎峰等[27]利用甘藍型油菜60K SNP芯片(Illumina Infinium HD Assay)技術構建的高密度遺傳連鎖圖長度為3838.2 cM, 包含7601個SNP位點。目前報道的高密度遺傳連鎖圖大多采用甘藍型油菜60K SNP芯片(Illumina Infinium HD Assay)或簡化基因組測序技術。本研究利用全基因組重測序篩選出874,995個SNP標記構建高質量遺傳連鎖圖譜, 各連鎖群上相鄰bin之間平均距離在0.42~0.98 cM之間。遺傳標記覆蓋密度較高, 且分布較為均勻。基于全基因組重測序技術構建的遺傳連鎖圖譜質量較傳統分子標記、芯片或簡化基因組測序技術手段獲得的遺傳圖譜更具優勢。

3.2 不同發育階段與全生育期的相關性

全生育期是油菜早熟性狀鑒定的主要指標, 由于開花期與全生育期高度正相關, 對于油菜早熟性狀的研究及品種選育等工作主要圍繞開花期性狀進行研究[28-31]。俎峰等[27]認為, 生育期比開花期遺傳更復雜, 在其QTL定位研究中需盡可能分解性狀, 量化性狀判定指標, 從而降低生育期的遺傳復雜度, 有利于檢測出穩定的遺傳位點。本研究對影響油菜全生育期的各個發育階段(開花期、花期持續時間、角果期持續時間等)進行表型調查和QTL定位分析。各發育階段的田間表型和QTL定位結果均表明, 它們與全生育期密切相關。其中, 開花期、花期持續時間、角果期持續時間與全生育期的皮爾森相關系數分別為0.926、-0.701和0.158, 相關性均達到顯著水平。在檢測到9個全生育期QTL位點中, 發現4、2和1個全生育期QTL置信區間分別與開花期、花期持續時間、角果期持續時間位點置信區間完全或部分重疊。以上結果表明, 雖然開花期是早熟性狀選擇的重要指標, 但開花后的一系列生命活動也參與了油菜的生殖生長發育進程, 與全生育期顯著相關。因此, 在早熟性狀的研究中, 可以從各個發育階段入手, 不但有利于使熟期進一步提前, 也可減緩早熟油菜品種過早開花導致的冬前低溫寒潮天氣的不利影響。

3.3 候選基因篩選

對模式植物擬南芥早熟相關基因的研究主要集中在開花期性狀[32-33], 其遺傳調控網絡的研究表明, 主要有以下幾種途徑參與開花調控, 分別是春化、光周期、赤霉素、自主途徑和年齡等, 涉及100多個基因參與[34-37]。對于油菜早熟相關基因的研究, 也有開花基因被成功克隆的報道[38-41]。Chen等[42]克隆得到油菜開花基因, 并研究其花期調控機制。Hou等[43]克隆出甘藍型油菜基因, 該基因是調控油菜冬春分化的關鍵因子, 其表達受春化作用的抑制。本研究在油菜早熟性狀QTL置信區間內篩選到29個早熟相關基因, 它們主要參與開花調控、花序分生組織活動、春化、光形態建成及生長素響應等生物學過程。其中, 開花期、花期持續時間QTL置信區間內篩選到的候選基因主要影響開花過程, 例如在C08染色體上篩選到的候選基因其擬南芥同源基因介導春化作用, 參與了的轉錄調控。編碼一種核定位鋅指蛋白。在野生型擬南芥中, 春化導致開花抑制因子水平的穩定下降。在突變體中, 雖然的表達在春化過程中正常下調, 但當植物恢復到正常溫度時,mRNA的水平會上升[44]。在A02染色體上篩選到的候選基因, 其擬南芥同源基因與bHLH轉錄因子結合形成異二聚體并負向調控其表達, 直接受和基因的負調控, 為開花期調控所必須[45]。油菜開花受精后, 籽粒發育過程是影響油菜產量、品質、成熟期等性狀的關鍵。對水稻、小麥等作物籽粒灌漿過程的研究表明, 大粒品種和高產品種的籽粒均具有灌漿速率快和灌漿時間長的特點[46]。而在角果持續時間QTL置信區間內篩選到的候選基因主要影響籽粒發育過程。例如, 在A09染色體上的, 其擬南芥同源基因為生長素調控基因, 參與籽粒發育。Hu等[47]發現, 受生長素誘導的基因在擬南芥器官發育過程中能夠通過改變細胞數量, 延長生長發育時間等方式調控籽粒發育。在C08染色體上的, 其擬南芥同源基因編碼LEA家族蛋白, LEA蛋白及其mRNA主要在籽粒發育晚期大量積累, 主要參與應答植物失水脅迫, 與籽粒發育密切相關[48], 其對籽粒發育時間的具體影響還有待進一步研究。

4 結論

田間表型和QTL定位結果均表明, 開花期、花期持續時間、角果期持續時間等與全生育期密切相關。篩選到的29個候選基因通過調控花期或籽粒發育等生長發育進程影響油菜早熟。因此, 油菜早熟性狀的研究可同時考慮開花和籽粒發育過程。以上工作為油菜早熟性狀的遺傳改良提供了新的思路。

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QTL mapping and candidate genes screening of earliness traits inL.

LI Shu-Yu, HUANG Yang, XIONG Jie, DING Ge, CHEN Lun-Lin*, and SONG Lai-Qiang

Institute of Crops, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, Jiangxi, China

Currently, the research on earliness traits of rapeseed mainly focused on flowering time. Although there was a significant positive correlation between the flowering period and the growth period, it was not completely consistent. There are few reports on the genetic studies and QTL mapping of traits related to rapeseed growth and development after flowering. We carried out phenotypic survey (flowering time, flowering period duration, silique period duration etc.) and QTL mapping with the DH population constructed by ‘Huaqianzao’ and ‘Global’ as material. A total of 30 QTL loci for earliness traits were detected. Among them, 12, 5, 4 and 9 QTL loci were detected in the flowering time, flowering period duration, silique period duration and full growth period, respectively, explaining 5.8%–22.4% phenotypic variance. The 2, 4, and 1 QTL confidence intervals of full growth period were found overlap in part or in whole with flowering time, flowering period duration and silique period duration respectively. The 29 candidate genes were screened, which affected the earliness traits by regulating flowering or silique development in rapeseed growth and development processes. Therefore, in the study of earliness traits, we could consider flowering time and silique development process at the same time, which not only helps to advance the maturity period, but also reduces the adverse effects of early flowering.

L.; earliness traits; QTL mapping; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2021.04145

本研究由國家自然科學基金項目(31660403), 國家重點研發計劃項目(2017YFD0101703)和國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-12)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31660403), the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0101703), and the China Agriculture Research System (CARS-12).

陳倫林, E-mail: lunlinchen@163.com

E-mail: lishuyu0104@163.com

2020-07-02;

2020-10-14;

2020-11-11.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201111.1038.002.html