馬鈴薯熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA3基因的克隆及其耐熱性功能分析

唐銳敏 賈小云 朱文嬌 印敬明 楊 清,*

馬鈴薯熱激轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及其耐熱性功能分析

唐銳敏1,2賈小云1朱文嬌2印敬明2楊 清2,*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太谷 030801;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇南京 210095

馬鈴薯在田間生長時常會受到各種不利環(huán)境的影響。夏季高溫常導(dǎo)致馬鈴薯塊莖產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。因此, 闡明馬鈴薯對熱脅迫的響應(yīng)機制, 發(fā)掘耐熱相關(guān)基因, 對馬鈴薯耐熱性的提高意義重大。熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor A3, HsfA3)在植物機體內(nèi)的活動影響到大量功能基因的表達, 在植物響應(yīng)熱脅迫的過程中發(fā)揮重要的作用。為了研究馬鈴薯中HsfA3的結(jié)構(gòu)和功能, 本研究通過RT-PCR從馬鈴薯品種Désirée中克隆到長度為1506 bp的基因, 編碼501個氨基酸。StHsfA3的相對分子量為55.23 kD, 理論等電點為4.9, 屬于親水性蛋白。構(gòu)建-pBA002過表達載體, 并轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株, 共鑒定得到5個獨立的過表達轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系。通過對轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株葉片中的相對含水量(relative water content, RWC)以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的測定發(fā)現(xiàn), 在高溫脅迫下, 轉(zhuǎn)基因植株葉片中的RWC顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, MDA含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株, 說明在耐熱過程中起到正調(diào)控作用。對、和在不同馬鈴薯植株中的表達分析顯示,過量表達誘導(dǎo)了和的表達, 預(yù)示著StHsfA3可能協(xié)同StHsp26-CP和StHsp70來增強過表達轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性。

馬鈴薯; 熱脅迫;; 基因克隆; 遺傳轉(zhuǎn)化; 功能分析

植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常會受到各種不利環(huán)境如極端溫度、鹽漬化、干旱、重金屬等脅迫[1]。其中, 熱脅迫是對植物生長繁殖影響最嚴(yán)重且最不易控制的因素之一[2]。而且, 溫室效應(yīng)的積累加劇了高溫的影響力, 從而造成農(nóng)作物減產(chǎn), 大大威脅了我國乃至全世界的糧食安全[1]。馬鈴薯營養(yǎng)豐富, 種植廣泛, 是一種重要的糧蔬兼用型作物。然而馬鈴薯性喜涼冷, 不耐高溫。在夏季馬鈴薯栽培過程中, 高溫會嚴(yán)重影響其生長發(fā)育過程, 導(dǎo)致塊莖產(chǎn)量和質(zhì)量下降[3]。因此, 闡明馬鈴薯對熱脅迫的響應(yīng)機制,發(fā)掘耐熱相關(guān)基因, 對馬鈴薯耐熱性改良具有重要意義。

熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, Hsf)作為熱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要元件, 激活熱脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達, 在植物熱響應(yīng)調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[4]。與其他轉(zhuǎn)錄因子類似, Hsf家族成員的N端有1個保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu), 為Hsf的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)[5]。與DBD區(qū)域相毗鄰的是寡聚域(oligomerization domain, OD), 由2個疏水的七肽重復(fù)序列(hydrophobic heptad repeats, HR-A和HR-B)和1段插入序列組成[5-6]。根據(jù)HR-A/B之間插入氨基酸殘基的數(shù)目不同, 可將Hsf分成A、B和C三大類。

與動物和酵母相比, 植物中的Hsf家族成員十分豐富[7]。例如在擬南芥()[8]、番茄()[9]、水稻()[10]和楊樹()[11]中, 分別鑒定得到21、24、25和30個Hsf家族成員。這些Hsf成員在植物對各種復(fù)雜的非生物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[12]。例如, 在擬南芥中,、、和表達會受到低溫脅迫、鹽脅迫以及滲透壓脅迫的誘導(dǎo)[7,13-14]。在我們前期的研究中, 鑒定出27個馬鈴薯Hsf家族成員, 分屬A、B和C三大類。這些馬鈴薯家族基因?qū)崦{迫、干旱脅迫和冷脅迫均有不同程度的響應(yīng)[15]。

HsfA3是熱激轉(zhuǎn)錄因子A家族的一個成員。在正常條件下,表達屬于組成型表達, 存在于細胞質(zhì)中; 而當(dāng)植物受到熱脅迫時, 其表達為誘導(dǎo)型表達, 作用在細胞核中[16]。研究表明, HsfA3在植物耐熱調(diào)控方面起著重要的作用。例如, 在擬南芥中,在DREB2A (dehydration-responsive element bindingprotein 2A)的調(diào)控作用下表達, 并對熱脅迫做出響應(yīng), 從而級聯(lián)調(diào)控其下游一系列熱誘導(dǎo)基因表達, 使植株獲得更高的耐熱性[17]。在番茄中, HsfA3能夠與MAP激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)直接相互作用來調(diào)控植物對熱脅迫的響應(yīng)[18]。在馬鈴薯中, 我們也發(fā)現(xiàn)在熱脅迫誘導(dǎo)下能夠高效表達, 表明StHsfA3可能在馬鈴薯響應(yīng)熱脅迫的過程中起著重要的作用[15]。除了調(diào)控植物對熱脅迫響應(yīng)之外, HsfA3還參與了其他非生物脅迫應(yīng)答。在水稻中發(fā)現(xiàn), OsHsfA3不但參與了植物的耐熱調(diào)控, 同時也通過調(diào)節(jié)依賴脫落酸和活性氧水平的多胺生物合成來提高植株的耐旱性[19]。在擬南芥中過表達百合可以通過改變脯氨酸分解代謝來提高擬南芥植株的耐熱性和鹽敏感性[20]。

目前, 對的研究主要集中在擬南芥、番茄等模式植物中, 在馬鈴薯中尚未見到有關(guān)克隆和表達的報道。在前期研究中, 我們通過構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)預(yù)測,(PGSC0003DMG 400003219)和(PGSC0003DMG400027611)可能是的共表達基因, 它們之間可能存在某種調(diào)控關(guān)系[15]。為了研究在提高植物耐熱性方面的作用以及與相關(guān)之間潛在的表達調(diào)控關(guān)系, 本研究從馬鈴薯品種Désirée中克隆了的cDNA序列, 通過在馬鈴薯中過表達該基因并對其耐熱性功能進行研究, 以期為揭示的調(diào)控機制提供基礎(chǔ), 同時也為馬鈴薯耐熱育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株及載體

馬鈴薯品種Désirée, 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)楊清教授實驗室提供, 保存于MS培養(yǎng)基中, 置于溫度為(22 ± 1)℃、光周期為光照(16 h)/黑暗(8 h)的溫室中培養(yǎng)。將1月齡的組培苗轉(zhuǎn)移至試管中煉苗, 1周后移至基質(zhì)中生長。菌株為大腸桿菌() DH5α和農(nóng)桿菌() GV3101。克隆載體pMD19-T (TaKaRa, 中國大連)和表達載體pBA002由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院喻德躍教授課題組提供。

1.2 馬鈴薯HsfA3的克隆及序列分析

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 取馬鈴薯品種Désirée的葉片約0.1 g, 利用RNA提取試劑盒(TaKaRa, 中國大連)提取樣品總RNA, 用不含RNase的DNase I (TaKaRa, 中國大連)消除基因組DNA的干擾。對所得RNA的完整性和濃度進行檢測后, 取0.5 μg RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Germany)合成cDNA第1鏈。將1 μL合成的cDNA用9 μL nuclease-free水稀釋作為模板。

1.2.2 馬鈴薯的分子克隆 根據(jù)NCBI網(wǎng)站中查到的馬鈴薯預(yù)測序列(XM_015306031.1)設(shè)計帶有I和I雙酶切位點的引物(P1, 表1)。以上述合成的cDNA作為模板, 進行PCR擴增, 擴增程序為94℃ 5 min; 94℃ 50 s, 58℃ 50 s, 72℃ 90 s, 33個循環(huán); 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳測定后通過凝膠回收試劑盒(Axygen Scientific Inc., Union city, USA)將目的片段回收, 然后將其連接至pMD19-T克隆載體中, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 經(jīng)PCR檢測后, 對陽性克隆進行測序檢驗, 將測序正確的菌液加甘油凍存。

表1 本研究所使用的引物

1.2.3 馬鈴薯HsfA3的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

由ExPASy的PrptParam工具 (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測基因編碼的肽鏈氨基酸殘基數(shù)目、相對分子量、理論等電點; 由NPSA-PRABI (http://npsa-pbil.ibcp.fr)和SWISS- MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)在線分析獲得StHsfA3蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。使用 NCBI conserved domains (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/)和SignalP 5.0 Server (http://www. cbs.dtu.dk/servers/SignalP/)分別預(yù)測StHsfA3的保守結(jié)構(gòu)域和信號肽。由ExPASy的ProtScale工具(http:// web.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 預(yù)測StHsfA3蛋白的疏水性; 用TMHMM Server v. 2.0 工具(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在線分析得到StHsfA3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。由ClustalX 2.0和MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 采用鄰接法(Neighbor-Joining Method)作圖, 重復(fù)計算次數(shù)設(shè)為1000。

1.3 馬鈴薯HsfA3過表達載體的構(gòu)建及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

從上述保存的大腸桿菌菌液中提取質(zhì)粒, 用I和I對其進行雙酶切, 回收目的片段; 同時用相同的酶將pBA002載體也進行雙酶切并將載體大片段回收。然后將目的基因片段與酶切后的pBA002載體通過T4連接酶(Thermo Fisher Scientific, USA)連接, 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。通過菌液PCR驗證、酶切驗證以及測序驗證后, 將測序正確的含有-pBA002重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液加甘油保存到-80℃冰箱, 用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗。

利用本實驗室已經(jīng)建立的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系[21], 將-pBA002重組子轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種Désirée外植體中。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、愈傷誘導(dǎo)、芽分化和生根篩選后, 獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

利用SDS法提取得到的抗性馬鈴薯植株以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑目侱NA。為了檢測- pBA002重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株內(nèi), 本研究設(shè)計了包含1段pBA002表達載體和1段基因片段的引物(P2, 表1)。以非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑目侱NA作為陰性對照,-pBA002重組質(zhì)粒作為陽性對照, 用該引物進行PCR驗證, 程序如下: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性50 s, 58℃退火45 s, 72℃延伸50 s, 33個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物再經(jīng)電泳檢測。

1.5 相對含水量(RWC)測定

將1月齡的非轉(zhuǎn)基因植株(wild type, WT)以及轉(zhuǎn)基因陽性株系(transgenic lines, L)的組培苗移栽到基質(zhì)中, 置于溫度為(22±1)℃, 光照周期為14 h光照/10 h黑暗的光照培養(yǎng)箱中生長2周, 再將它們分別分成2組, 一組放在35℃光照培養(yǎng)箱中; 另一組留在原來的培養(yǎng)箱中生長。處理8 h后取其葉片測定相對含水量。相對含水量的測定具體步驟如下: 秤取鮮重(fresh weight, FW)約為0.5 g的新鮮馬鈴薯葉片, 將其浸入水中, 一段時間后取出, 濾紙吸干表面水分, 稱重; 然后再把葉片浸入水中, 過段時間再取出, 吸干葉片表面水分后再稱重; 重復(fù)操作幾次, 直到重量穩(wěn)定, 此時葉片的重量為飽和鮮重(saturated fresh weight, SFW)。之后把吸水飽和的葉片放入紙袋, 置于溫度為105℃的烘箱內(nèi)殺青10 min, 再將烘箱溫度調(diào)到75℃繼續(xù)烘干葉片, 直至其重量不再變化。這時將葉片取出, 冷卻至室溫, 記錄其干重(dry weight, DW)。每個樣本設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3次試驗重復(fù)。相對含水量計算公式如下:

1.6 丙二醛(MDA)含量測定

用與1.5同樣的方法處理馬鈴薯植株, 不同溫度處理8 h后取馬鈴薯葉片測定MDA的含量。采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測定MDA含量[22], 其含量用“μmol g-1FW”來表示。取馬鈴薯植物新鮮葉片1 g, 剪碎后加入2 mL 5% TCA溶液, 于研缽中研磨成勻漿, 再加8 mL TCA, 將殘液移至10 mL離心管中。4℃, 4000′離心10 min; 取上清2 mL (對照中加入2 mL蒸餾水)至試管中, 加入2 mL 0.6% TBA溶液, 混勻后于沸水浴中煮沸10 min, 取出冷卻至室溫, 3000′離心15 min, 取上清量取其體積VS; 以對照管內(nèi)溶液為空白, 測定530 nm、600 nm和450 nm處的吸光值。每個樣本進行3個生物學(xué)重復(fù)和3次試驗重復(fù)。MDA含量用下列公式計算:

1.7 StHsfA3、StHsp26-CP和StHsp70的表達量檢測

用與1.5同樣的方法處理馬鈴薯植株, 處理2 h后分別取不同處理不同植株的葉片提取RNA, 采用熒光定量PCR方法檢測非轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因不同株系中的、和的表達量。這3個基因的引物見表1 (P3, P4, P5), 以為內(nèi)參基因, 引物為P6。按照FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, Mannheim, Germany)的使用說明, 在ABI-7500實時定量PCR儀上(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)檢測候選基因的表達量。PCR反應(yīng)體系為20 μL, 包含10 μL SYBR-Green、6.8 μL ddH2O、2 μL稀釋后的模板以及各0.6 μL 10 μmol L-1的正反向引物。PCR反應(yīng)程序如下: 50℃ 2 min; 95℃預(yù)變性10 min, 95℃變性5 s, 60℃退火35 s, 共40個循環(huán)。根據(jù)2???Ct法, 對每個基因的相對表達量進行標(biāo)準(zhǔn)化計算。每個樣本進行3次生物學(xué)重復(fù)和2次試驗重復(fù)。利用鄧肯多重測試法對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 StHsfA3基因的分子克隆及序列分析

根據(jù)NCBI網(wǎng)站中預(yù)測得到的馬鈴薯堿基序列設(shè)計加酶切位點的引物P1, 從馬鈴薯品種Désirée中克隆得到基因的cDNA全長序列。經(jīng)軟件分析,從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG的長度為1506 bp (圖1-A), 共編碼501個氨基酸(圖1-B)。利用ExPasy網(wǎng)站的PrptParam工具預(yù)測StHsfA3蛋白的相對分子量為55.23 kD, 理論等電點為4.9。本研究發(fā)現(xiàn), 在StHsfA3氨基酸序列的C端含有4個中心是色氨酸殘基的短肽基序(圖1-B): DEELSMGFE、GAELDSFSS、LSDLDIDPL和GVDKPADGS, 該結(jié)構(gòu)使得HsfA3具有高效的轉(zhuǎn)錄激活功能。

A圖中: M: DNA 2000分子標(biāo)記; 1:的擴增片段。B圖中: 紅線部分為4個中心是色氨酸(W)的短肽基序。

M: DNA 2000 marker; 1: amplified fragment ofin Fig. A; the motifs marked with red line are the four short peptide sequences containing tryptophan (W) in Fig. B.

對StHsfA3蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示, α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲的氨基酸殘基數(shù)分別為117、13和368個, 占整個氨基酸數(shù)目的23.35%、2.59%和73.45% (圖2-A)。無規(guī)則卷曲構(gòu)成了該蛋白的活性中心, 所占比例最高, 說明這部分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。通過NCBI CD search功能對該蛋白進行分析, 預(yù)測出其含有熱激轉(zhuǎn)錄因子Hsf典型的DBD結(jié)構(gòu)域(圖2-C)。其三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明, 該DBD結(jié)構(gòu)域含有3個α螺旋和4個β折疊片(圖2-B), 構(gòu)成了該蛋白最保守的結(jié)構(gòu)域。利用Signal P-5.0預(yù)測StHsfA3信號肽發(fā)現(xiàn), 該蛋白無信號肽(圖2-D), 為非分泌蛋白。

A: 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測; B: 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測; C: 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測; D: 信號肽預(yù)測。

A: secondary structure prediction; B: tertiary structure prediction; C: conservative domain prediction; D: signal peptide prediction.

利用ExPASy的ProtScale工具預(yù)測StHsfA3蛋白的疏水性發(fā)現(xiàn), 構(gòu)成StHsfA3蛋白的氨基酸中, 親水性氨基酸的數(shù)量遠遠大于疏水性氨基酸(圖3-A), 表明該蛋白屬于親水性蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明, StHsfA3蛋白沒有跨膜區(qū), 不屬于膜蛋白, 這與StHsfA3在細胞中的位置以及發(fā)揮的功能相適應(yīng)。

A: 圖中曲線得分在0以上說明這部分氨基酸為疏水性, 分值越高疏水性越強; 得分在0以下說明氨基酸為親水性氨基酸, 分值越低親水性越強。B: 沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。

A: the curves above zero show that these amino acids are hydrophobic, and the higher score, the stronger the hydrophobicity; the curves below zero show that these amino acids are hydrophilic, and the lower score, the stronger the hydrophilicity. B: there is no transmembrane domain.

2.2 StHsfA3的系統(tǒng)進化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到15個來自于其他植物物種的HsfA3氨基酸序列, 將馬鈴薯HsfA3蛋白序列與其他物種中的同源序列進行比對, 用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。該系統(tǒng)發(fā)育樹主要有兩大分支, 雙子葉植物HsfA3聚為一支, 單子葉植物HsfA3聚為一支。馬鈴薯HsfA3的氨基酸序列與番茄()、辣椒()和煙草()這些茄科植物的親緣關(guān)系比較近, 尤其與番茄的HsfA3親緣關(guān)系最近。

2.3 StHsfA3過表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的獲得

將克隆獲得的基因目的片段通過I和I雙酶切后插入到pBA002表達載體35S啟動子, 構(gòu)建成::過表達載體(圖5-A), 并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。利用利福平(rifampicin, Rif)和壯觀霉素(spectinomycin, Spec)篩選出含有過表達載體的農(nóng)桿菌陽性菌落, 并用PCR驗證。提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒, 經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和I雙酶切后, 除了載體片段, 還得到1條長度為1506 bp的目的片段(圖5-B), 說明過表達載體已成功構(gòu)建。

利用ClustalX 2.1和MEGA 4.0軟件構(gòu)建來自16個物種的Hsf A3氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹, 重復(fù)計算次數(shù)設(shè)為1000。各物種名稱縮寫及NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列號如下: MdHsfA3: 蘋果(XP_008391748.1); ZjHsfA3: 棗(XP_015898712.1); CsHsfA3: 柑橘(XP_006481891.1); AtHsfA3: 擬南芥(NP_195992.2); VrHsfA3: 豇豆(XP_014511066.1); GmHsfA3: 大豆(XP_003541445.1); PeHsfA3: 楊樹(XP_011016541.1); NtHsfA3: 煙草(XP_016473897.1); CaHsfA3: 辣椒(XP_016542894.1); SlHsfA3: 番茄(NP_001234854.1); OsHsfA3: 水稻(XP_015623061.1); ZmHsfA3: 玉米(NP_001147968.1); SiHsfA3: 狗尾草(XP_004952622.1); BdHsfA3: 二穗短柄草(XP_003575055.1); HvHsfA3: 大麥(AEB26588.1)。

The Neighbor-joining phylogenetic tree of HsfA3 amino acid sequences from 16 plant species was constructed by ClustalX 2.1 and MEGA 4.0, which was bootstrapped over 1000 cycles. Abbreviations for each species and database accession numbers are as follows: MdHsfA3:(XP_008391748.1); ZjHsfA3:(XP_015898712.1); CsHsfA3:(XP_006481891.1); AtHsfA3:(NP_195992.2); VrHsfA3:(XP_014511066.1); GmHsfA3:(XP_003541445.1); PeHsfA3:(XP_011016541.1); NtHsfA3:(XP_ 016473897.1); CaHsfA3:(XP_016542894.1); SlHsfA3:(NP_001234854.1); OsHsfA3:(XP_015623061.1); ZmHsfA3:(NP_001147968.1); SiHsfA3:(XP_004952622.1); BdHsfA3:(XP_003575055.1); HvHsfA3:(AEB26588.1).

將含有過表達載體的農(nóng)桿菌菌液侵染馬鈴薯組培苗莖段, 經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷、芽分化以及草丁膦生根篩選(圖5-C), 初步得到12株抗性植株。提取其葉片DNA, 利用引物P33進行PCR驗證, 最終鑒定得到5個的過表達馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系(圖5-D)。熒光定量結(jié)果顯示,在過表達馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系中的表達量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(圖5-E)。

A: 帶有酶切位點的載體示意圖。B: M: 1 kb plus DNA marker; P: 含有pBA002-載體的農(nóng)桿菌質(zhì)粒; 1, 2: 含有pBA002-載體的農(nóng)桿菌質(zhì)粒酶切結(jié)果。C: a. 預(yù)培養(yǎng); b. 芽分化; c. 生根篩選; d. 盆栽苗。D: M: DNA 2000 marker; WT: 非轉(zhuǎn)基因植株, 作為陰性對照; +: pBA002-農(nóng)桿菌質(zhì)粒, 作為陽性對照; L1~L5: 轉(zhuǎn)基因株系。E: 不同植株中的表達量測定。**表示在0.01水平差異顯著。

Schematic diagram ofvector with site of restriction enzymes in Fig. A. M: 1 kb plus DNA marker; P: pBA002-plasmid; 1, 2: enzyme digestion identification of pBA002-plasmid in Fig. B. a: preincubation in darkness; b: bud formation; c: selection of transgenic lines; d: plants in pot in Fig. C. M: DNA 2000 marker; WT: non-transgenic potato plant, used as a negative control; +: pBA002-plasmid, used as a positive control; L1–L5: Transgenic lines in Fig. D. The expression levels ofwere determined in different plants in Fig. E. **: significantly different at the 0.01 probability level.

2.4 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的相對含水量(RWC)和丙二醛(MDA)含量分析

相對含水量和丙二醛含量是反應(yīng)植物在逆境狀態(tài)下生長狀況的重要生理指標(biāo), 通常可用于鑒定植物抗逆境脅迫的能力。通過檢測非轉(zhuǎn)基因植株(WT)和轉(zhuǎn)基因植株(L)在適溫(22℃)和高溫(35℃)條件下葉片中的相對含水量發(fā)現(xiàn), 在適溫條件下, 馬鈴薯葉片中的相對含水量均保持在80%以上(圖6-A)。當(dāng)熱處理8 h之后, 不論是轉(zhuǎn)基因植株還是非轉(zhuǎn)基因植株, 其葉片的相對含水量都因葉片受到熱脅迫而呈現(xiàn)不同程度的下降, 而且熱處理后轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片中的相對含水量仍然顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, 表明過表達轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株在熱脅迫下的保水能力更強, 因此耐熱性更高。

對轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株和非轉(zhuǎn)基因植株在35℃高溫脅迫下和22℃適溫條件下葉片中MDA含量的檢測(圖6-B)發(fā)現(xiàn), 熱處理8 h后,植株葉片中的MDA含量均升高, 說明它們都受到了熱脅迫引起的膜脂過氧化, 但轉(zhuǎn)基因各株系葉片中的MDA含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株, 說明過表達植株受到熱脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化程度低于普通非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯, 因此,過表達轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株耐熱性強。

WT: 非轉(zhuǎn)基因植株; L:過表達轉(zhuǎn)基因株系(L1、L3、L5三個株系); RWC: 相對含水量; MDA content: 丙二醛含量; 正常生長溫度: 22℃; 高溫脅迫: 35℃; 處理時間: 8 h; 圖中的值是3個獨立試驗的結(jié)果, 每個試驗3個重復(fù), 以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。根據(jù)Duncan’s多重測試, 柱形圖上不同小寫字母表示< 0.05的顯著性差異水平。

WT: non-transgenic plants; L:overexpression transgenic plant lines; RWC: relative water content; MDA: malondialdehyde; temperature treatments: 22℃ (optimal temperature) and 35℃ (heat stress) for eight hours. Values are means ± SE of three independent experiments with three replicates in each experiment. Bars with different lowercase letters are significantly different at< 0.05 according to Duncan’s multiple range tests.

2.5 StHsfA3、StHsp26-CP以及StHsp70的表達量分析

利用qRT-PCR的方法, 本研究檢測了適溫(22℃)和高溫(35℃)條件下非轉(zhuǎn)基因植株和3個轉(zhuǎn)基因株系葉片中的表達水平(圖7-A)。在適溫條件下, 轉(zhuǎn)基因株系中的表達量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, L1、L3、L5中的表達量分別是非轉(zhuǎn)基因植株中的3.95、7.05和3.36倍。在高溫處理2 h后, 各植株中的表達量均受高溫誘導(dǎo)而上升, 且3個轉(zhuǎn)基因株系中該基因的表達量都顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。

在正常生長條件下,過表達轉(zhuǎn)基因植株中和的表達量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株中, 說明過表達誘導(dǎo)了和在轉(zhuǎn)基因植株中的表達, 但和是否是的靶基因, 是否被直接調(diào)控, 還需要進一步研究。當(dāng)35℃處理2 h后, 所有植株中和的表達量都在高溫誘導(dǎo)下顯著上升, 且各轉(zhuǎn)基因株系中這2個基因的表達量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(圖7-B, C)。

3 討論

馬鈴薯地上部分生長的最適溫度為20~25℃, 塊莖形成的最適溫度為15~20℃[23-24]。高溫抑制馬鈴薯塊莖的形成和發(fā)育, 從而嚴(yán)重影響營養(yǎng)物質(zhì)的積累。因此馬鈴薯耐熱基因的開發(fā)和耐熱機制的研究對提高馬鈴薯的抗熱性具有重要意義。

熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsf)廣泛存在于各植物中, 在熱脅迫應(yīng)答方面具有十分重要的作用。隨著馬鈴薯全基因組測序工作的完成, 課題組前期已鑒定出27個馬鈴薯基因家族成員。其中,介導(dǎo)了一系列高溫脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 包括以及一些其他的功能基因, 在植物的熱響應(yīng)調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[15]。

本研究從馬鈴薯品種Désirée中克隆得到基因。序列分析顯示,的cDNA長度為1506 bp, 編碼501個氨基酸(圖1)。大多數(shù)A族Hsf具有1個包含氨基酸激活序列(AHA)的C端激活域(C-terminalactivation domain, CTAD)[25]。StHsfA3雖然屬于HsfA家族成員, 但在其CTAD區(qū)域不含AHA基序, 而是含有4個中心是色氨酸殘基的短肽基序(圖1-B)。該結(jié)構(gòu)在番茄HsfA3中也有發(fā)現(xiàn), 它與AHA功能相似, 使得HsfA3具有高效的轉(zhuǎn)錄激活功能[16]。經(jīng)研究證實, 不含AHA基序的HsfA可與其他HsfA成員結(jié)合形成異聚體, 從而激活其轉(zhuǎn)錄活性[10,26]。StHsfA3蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示, 無規(guī)則卷曲所占比例最高(圖2-A), 它們構(gòu)成了該蛋白的活性中心, 激活了Hsf三聚體的形成, 促進了該三聚體與基因啟動子區(qū)的有效結(jié)合[5-6]。其DBD結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)模型含有3個α螺旋和4個β折疊片(圖2-B)。α螺旋和β折疊片一般作為蛋白質(zhì)的支架, 因此這部分構(gòu)成該蛋白最保守的結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)軟件預(yù)測到StHsfA3是無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽的親水性蛋白, 表明它既不是分泌蛋白也不是膜蛋白, 這與其在細胞中的位置以及發(fā)揮的功能相適應(yīng)。馬鈴薯HsfA3的氨基酸序列與番茄、辣椒和煙草這些茄科植物的親緣關(guān)系比較近, 尤其與番茄的HsfA3親緣關(guān)系最近, 表明馬鈴薯HsfA3可能與番茄HsfA3具有相似的功能和作用機制。

WT: 非轉(zhuǎn)基因植株; L:過表達轉(zhuǎn)基因株系(L1、L3、L5三個株系); 正常生長溫度: 22℃; 高溫脅迫: 35℃; 處理時間: 2 h; 圖中的值是2次試驗重復(fù)的結(jié)果, 每個試驗3個生物學(xué)重復(fù), 以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。根據(jù)鄧肯多重測試, 柱形圖上不同小寫字母表示< 0.05的顯著性差異水平。

WT: non-transgenic plants; L:overexpression transgenic plant lines; temperature treatments: 22℃ (optimal temperature) and 35℃ (heat stress) for two hours. Values are means ± SE of two experimental replicates with three biological replicates in each experiment. Bars with different lowercase letters are significantly different at< 0.05 according to Duncan’s multiple range tests.

為了研究基因的功能, 本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株, 最終獲得了5個獨立的過表達轉(zhuǎn)基因株系。在我們驗證的3個轉(zhuǎn)基因株系中,的表達量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, 表明基因在強啟動子CaMV 35S帶動下高效表達[27]。然而在這3個轉(zhuǎn)基因株系中(L1、L3和L5),的表達量存在差異, 在L3中表達量最高, 在L5中表達量最低, 這可能是與目的基因插入的位點和在馬鈴薯中的拷貝數(shù)不同有關(guān)[27]。相對含水量(RWC)反映了植物的保水能力, RWC越小, 說明水分虧缺越嚴(yán)重, 對逆境的耐受性越弱[28]。在高溫脅迫下, 活性氧的積累導(dǎo)致植物生物膜脂發(fā)生過氧化產(chǎn)生丙二醛(MDA), 因此MDA含量越高, 說明植物生物膜受傷害程度越深, 對逆境的耐受性越弱[29]。因此, 這2個指標(biāo)側(cè)面反映植物耐熱性的強弱。本研究通過檢測各植株在高溫處理后葉片中的RWC和MDA含量的變化發(fā)現(xiàn), 高溫處理后轉(zhuǎn)基因植株中的RWC顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, MDA含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株。這說明過表達轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株在熱脅迫下的保水能力更強, 受到熱脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化程度更低, 預(yù)示馬鈴薯植株內(nèi)過表達提高了馬鈴薯植株的耐熱性。

在前期研究中, 通過構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),、與處于同一個共表達模塊中, 表明和可能是的共表達基因[15]。本研究發(fā)現(xiàn), 在正常條件下生長時,過表達馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系中和的表達量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, 說明在馬鈴薯植株中的過表達誘導(dǎo)了和表達。當(dāng)受到熱脅迫后, 轉(zhuǎn)基因植株中受高溫誘導(dǎo)而大量表達, 與此同時,和也呈現(xiàn)出與表達量變化一致的趨勢。這說明對和表達起到一定的正調(diào)控作用, 與我們前期的研究結(jié)果相一致。StHsp26-CP屬于葉綠體sHsp家族。研究發(fā)現(xiàn), 擬南芥中的葉綠體sHsp (AtHsp21)能夠與一種質(zhì)體核蛋白pTAC5 (plastid transcriptionally active 5)結(jié)合, 來維持質(zhì)體編碼RNA聚合酶(plastid-encoded RNA polymerase, PEP)的功能, 從而保護葉綠體[30]。馬鈴薯StHsp26-CP是否具有與AtHsp21相似的作用, 還需要進一步的試驗驗證。Hsp70是一類結(jié)構(gòu)最保守、分布最廣泛的熱激蛋白。它能夠幫助蛋白質(zhì)正確折疊, 或者將蛋白聚合物降解, 最后將其轉(zhuǎn)運到細胞外, 從而減輕熱脅迫對細胞和組織的破壞[31]。

類似地, 在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)一些基因表達與HsfA3的豐度有密切的關(guān)系。Sakuma等[32]通過在擬南芥中過表達的上游基因發(fā)現(xiàn),和3個基因(、和)的表達量均顯著上升。隨后, Yoshida等[17]進一步證明, 熱脅迫下擬南芥能夠直接被DREB2A調(diào)控而上調(diào)表達, 從而產(chǎn)生一系列等熱誘導(dǎo)基因的級聯(lián)表達, 如、和。然而, Hsf介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程, 往往是不同的Hsf分子共同作用的結(jié)果。如Li等[33]研究表明, 擬南芥中HsfA2和HsfA3在相同的耐熱調(diào)控途徑中發(fā)揮作用, 且它們在蛋白水平上能夠互作, 從而誘導(dǎo)下游耐熱基因大量表達。因此, 在馬鈴薯中和是否是作為StHsfA3的靶基因而受到StHsfA3直接調(diào)控, 還需進一步試驗驗證。

4 結(jié)論

本研究從馬鈴薯品種Désirée中克隆得到基因, 該基因cDNA全長為1506 bp, 編碼501個氨基酸。該蛋白的相對分子量為55.23 kD, 理論等電點為4.9, 無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽, 屬于親水性蛋白。StHsfA3與茄科植物番茄HsfA3的親緣關(guān)系最近。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法共得到5個過表達轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系。過表達增強了植株的相對含水量, 降低了植株的MDA含量, 表明基因在馬鈴薯響應(yīng)熱脅迫過程中起正調(diào)控作用。過量表達誘導(dǎo)了和表達, 推測StHsfA3可能協(xié)同StHsp26-CP和StHsp70增強過表達轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性。

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附圖1 馬鈴薯基因的cDNA序列和對應(yīng)的氨基酸序列

Fig. S1 cDNA sequence of potatoand corresponding amino acid sequence

Cloning of potato heat shock transcription factorgene and its functional analysis in heat tolerance

TANG Rui-Min1,2, JIA Xiao-Yun1, ZHU Wen-Jiao2, YIN Jing-Ming2, and YANG Qing2,*

1College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

During potato cultivation in the field, various adverse environmental stresses would affect its growth status. Heat stress in summer always results in the decline of tuber yield and quality. Therefore, it is of great significance to reveal the response mechanism of potato to heat stress and explore heat resistant genes for potato breeding. The activity of HsfA3 (heat shock transcription factor A3) affects the expression of numerous functional genes and plays an important role in response to heat stress. In order to investigate the structure and function of potato HsfA3, thegene was isolated from potato cultivar Désirée by RT-PCR. The full-length cDNA ofwas 1506 bp encoding 501 amino acids. StHsfA3 was predicted to be a hydrophilic protein with an estimated molecular weight of 55.23 kD and a theoretical isoelectric point of 4.9. The vector of-pBA002 was constructed and transformed into potato plants. Totally five independent transgenic potato plants overexpressingwere obtained. The detection of relative water content (RWC) and malondialdehyde (MDA) content showed that the RWC was significantly increased while MDA content was significantly decreased in the transgenic plants compared with the non-transgenic plants under heat stress, suggesting that StHsfA3 played a positive regulatory role in enhancing the heat resistance of potato. Furthermore, the expression levels of,, andwere determined by qRT-PCR in different potato plants. The results exhibited that the expression levels ofandin the transgenic lines overexpressingwere significantly higher than that in non-transgenic plants, indicating that StHsfA3might act in synergy with StHsp26-CP andStHsp70 to increase the heat tolerance of the transgenic plants.

potato; heat stress;; gene cloning; genetic transformation; functional characterization

10.3724/SP.J.1006.2021.04114

本研究由國家青年科學(xué)基金項目(31900450), 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項目(2018YJ28)和山西省優(yōu)秀博士來晉工作獎勵資金科研項目(SXYBKY2018034)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation for Young Scientists of China (31900450), the Science and Technology Innovation Fund of Shanxi Agricultural University (2018YJ28), and the Award Fund for Outstanding Doctors Working in Shanxi (SXYBKY2018034).

楊清, E-mail: qyang19@njau.edu.cn

E-mail: ruimin_tang829@hotmail.com

2020-05-25;

2020-08-19;

2020-09-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200907.1415.004.html