玉米雜交種純度鑒定SNP核心引物的確定及高通量檢測方案的建立

王 蕊 施龍建, 田紅麗 易紅梅 楊 揚 葛建镕 范亞明 任 潔 王 璐 陸大雷 趙久然* 王鳳格*

研究簡報

玉米雜交種純度鑒定SNP核心引物的確定及高通量檢測方案的建立

王 蕊1,**施龍建1,2,**田紅麗1易紅梅1楊 揚1葛建镕1范亞明1任 潔1王 璐1陸大雷2趙久然1,*王鳳格1,*

1北京市農林科學院玉米研究中心 / 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點研究室, 北京 100097;2揚州大學 / 江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點 / 糧食作物現代產業技術協同創新中心, 江蘇揚州 225009

純度是玉米種子質量的重要指標之一, 尤其雜交種自交株是影響田間產量的關鍵因素。KASP (kompetitive allele specific PCR)技術具有高通量、低成本的優點, 適用于種子純度檢測。本研究基于12套雜交種及其父母本的三聯體樣本及335份玉米雜交種國家審定標準樣品SNP指紋, 從384個SNP基礎位點篩選獲得60個候選位點, 位點轉化為KASP引物的成功率為95%。綜合考慮引物雙親互補率、多態性、穩定性和分型效果等多項指標, 最終確定20個引物作為玉米雜交種純度鑒定的核心引物, 能夠有效鑒定99.7%供試樣品純度。對于待測樣品京科968通過SNP-DNA指紋數據庫查詢, 并選擇雙親互補型引物進行純度鑒定。在檢測的110個個體中, 共檢出1個自交苗和2個異型株, 純度為97.3%。同時, 基于純度核心引物對批量樣品檢測建立高通量純度檢測方案, 具有快捷、準確、高通量和低成本的特點, 為政府監管和企業提供了更多純度鑒定方案的選擇。

純度; SNP; KASP; 玉米雜交種; 核心引物

玉米(L.)是世界上最早且最充分利用雜種優勢進行生產的作物, 國內目前90%以上的玉米生產用種是單交種[1]。雜交種的純度高低是影響田間產量、產品品質以及農民收益的關鍵因素之一[2]。因此, 玉米雜交種純度鑒定是把控玉米種子質量的重要手段, 尤其是對于雜交種中自交株的檢測, 在企業質量自控、政府市場監測等多個環節提供重要依據。當前常用于玉米雜交種純度鑒定的方法為田間小區種植鑒定法[3]、鹽溶蛋白法[4]以及SSR (simple sequence repeats)標記法[5-6]等。但以上3種方法都存在一些不足, 田間小區種植鑒定周期長且結果易受環境和人員判斷影響; 鹽溶蛋白法在某些品種上找不到雙親差異或無法區分自交苗, 不能鑒定所有品種; SSR分子標記等鑒定法無法滿足樣本高通量的檢測需求, 尤其是制種到市場銷售期間短期大量品種純度鑒定的需求[7]。因此探索出一套高效準確且適用于市場上絕大多數的玉米雜交種純度鑒定方案具有重要意義。

近年來, 隨著分子標記的快速發展, 第三代分子標記,即SNP (single nucleotide polymorphism)標記, 因其數量多、集成高、可微型化及自動化程度高等優勢, 廣泛應用于種質資源研究、品種身份鑒定、分子輔助育種(marker-assisted selection, MAS)等[8-11]領域。SNP檢測方法眾多, 包括水解探針法、高密度基因芯片以及競爭性等位基因特異性PCR法(kompetitive allele-specific PCR, KASP)等[12-14]。其中KASP平臺由于具有高效、低成本的特性, 目前已開發大麥[15]、棉花[16]等作物的純度鑒定標記。本研究依據建成的國家審定玉米品種指紋數據[17], 選擇60個SNP位點作為候選位點設計合成KASP引物, 以不同地區代表性品種為材料, 結合快速DNA提取法、高通量檢測平臺以及數據自動分析等篩選位點分型效果, 確定一套適用于玉米雜交種純度鑒定的SNP核心引物組合, 形成基于KASP技術的玉米品種純度鑒定檢測體系, 并建立玉米純度鑒定高通量檢測方案。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括12組玉米雜交種及其親本組成的三聯體樣品(表1), 用于測試KASP引物設計是否成功, 是否符合親子關系以及快提法DNA的分型效果; 335份1984—2013年國家審定玉米雜交種標準樣品[17], 用于構建SNP指紋數據并篩選候選位點; 市場購買玉米雜交種京科968種子若干及本實驗室收集母本京724、父本京92, 用于純度測試。

1.2 DNA提取

采用改良CTAB法混株提取建庫樣品及參照樣品DNA, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop 2000檢測DNA濃度及質量, 統一稀釋到20 ng μL–1備用, 每份樣品2個重復。純度檢測采用改良DNA快提法(K-Mate DNA提取試劑盒, LGC Genomic)單株提取。

1.3 SNP純度候選位點及引物設計

根據335份國家審定玉米雜交種標準樣品的SNP指紋數據[17]統計384基礎位點的雙親互補率、最小等位基因頻率(minimum allele frequency, MAF)、多態性信息含量(polymorphic information content, PIC)等參數, 挑選出在染色體上分布均勻, 多態性好的60個位點作為純度候選位點, 并設計合成KASP引物(表2) (LGC Genomic, 英國), 在2條正向引物序列的5′端加上FAM或HEX熒光基團的接頭序列[18], 并按照上游引物12 μmol L–1, 下游引物30 μmol L–1混合制備成引物工作液備用。

表1 玉米三聯體樣品信息表

(續表2)

(續表2)

1.4 PCR體系與程序

反應體系: 1.5 μL DNA (烘干), 0.5 μL 2×KASP PCR預混液(LGC Genomic, 1536格式, 標準含量ROX, 英國), 0.486 μL去離子水, 0.014 μL引物工作液。反應程序: 61~55℃梯度循環程序: 第1步: 94℃ 15 min, 94℃ 20 s, 第2步: 61~55℃10個循環, 每循環遞減0.6℃, 第3步: 94℃ 20 s, 55℃ 60 s, 26個循環, 在高通量水浴鍋PCR儀(Hydrocycler 64, LGC Genomic)上進行擴增反應。

1.5 熒光檢測及基因型數據采集

利用Pherastar熒光掃描儀采集原始熒光信號, 利用Kraken (V16.3.16.16288)軟件進行基因分型, 將分型結果導入SNP-DNA數據庫管理系統(V1.0.0, 軟件登記號: 2018SR043088, 北京市農林科學院玉米研究中心研發)分析待測樣品純度。

1.6 數據分析

使用SNP比對統計工具軟件(V1.0, 軟件登記號: 2018SR026743, 北京市農林科學院玉米研究中心研發)計算引物雙親互補率、MAF和PIC等參數。引物雙親互補率為該引物具有雙親互補基因型的品種數與總品種數的百分比, 樣品雙親互補基因型比率為該樣品上具有雙親互補基因型的引物數與總引物數的百分比。待測樣品純度計算為正常個體數目(待測樣品總數減去非典型個體數目)與待測樣品總數的百分比。

2 結果與分析

2.1 適于玉米雜交種純度鑒定核心引物的篩選與確定

基于玉米384個SNP基礎位點, 根據位點雙親互補區分能力、試驗分型效果、染色體均勻分布等條件篩選確定1套適于玉米雜交種純度鑒定的核心引物組合。具體篩選過程為: (1) 確定候選位點組合: 基于335份國審品種基礎位點的指紋數據計算位點雙親互補率、多態性等參數, 基礎位點雙親互補率介于24.2%~65.6%之間, MAF值介于0.32~0.50之間, PIC值介于0.34~0.38之間。候選位點的篩選條件為位點雙親互補率高于40%, MAF≥0.33, PIC≥0.35, 從而優選60個候選位點。(2) KASP引物評估: 將候選位點設計合成KASP引物, 使用12組玉米雜交種及其親本三聯體材料進行測試。其中57個引物都能分成緊密的三群, 分型結果與預期結果一致, 符合孟德爾遺傳定律, 并且試驗重復結果一致(圖1-A); 3個引物不能正常分型或與預期結果不一致或擴增失敗(圖1-C, F), 從芯片位點轉化為KASP引物的成功率為95%。(3) 快速DNA提取法評估: 為縮短DNA制備時間, 提高純度鑒定效率, 進一步使用快提法對CTAB法分型表現好的位點進行測試, 選擇CTAB法和快提法均能清晰的分成3個緊密的分型, 且與預期分型結果一致的位點(圖1-D), 共有48個位點進入下一步的位點篩選; 9個引物使用CTAB法能夠正常分型, 但使用快提法無法正常分型(圖1-B, E), 不再進行純度核心引物篩選。(4) 確定純度鑒定核心引物: 綜合位點區分能力及染色體均勻分布等, 篩選出20個KASP引物作為純度鑒定核心引物(表3)。

A, B, C, F為CTAB法分型效果; D, E為快提法分型效果。A, D為引物MG279, 在CTAB法和快提法均具有清晰、緊密的分型效果; B, E為引物MG304, 該位點使用CTAB法能夠正常分型, 但快提法無法正常分型; C為引物MG262, KASP引物分型效果為單態; F為引物MG067, 分型效果較散且數據缺失率較高。圖中每1個點代表1個反應孔的結果, 其中藍色和紅色點分別代表2種純合基因型, 綠色點代表雙親互補基因型, 粉色點代表未采集基因分型, 黑色點代表空白對照。

A, B, C, and F are the genotyping of CTAB method; D and E are the genotyping of fast extraction method. A and D are primer MG279, which have clear and close genotyping effect both by CTAB method and rapid extraction method; B and E are primer MG304, which has normal genotyping by CTAB method, but abnormal genotyping by rapid extraction method; C is primer MG262, of which KASP primer genotyping effect is monomorphic; F is primer MG067, of which KASP primer genotyping effect is wide and has high missing data rate. Each point represents the result of one reaction well, of which blue and red points represent two homozygous genotype, green points represent parental complementary genotype, pink points represent unused genotype and black points represent non-template control.

表3 玉米雜交種純度鑒定SNP核心引物信息表

MAF: minimum allele frequency; PIC: polymorphic information content.

2.2 適于玉米雜交種純度鑒定核心引物的特征分析

由于在進行純度引物篩選時, 我們更加關注雙親互補引物, 因此在純度鑒定核心引物篩選過程中雙親互補率是重要指標之一。篩選的20個核心引物的雙親互補率介于46.9%~65.6%之間, 平均雙親互補率為55.2%, 相比較于基礎位點和候選位點的平均雙親互補率46.4%和53.8%, 核心引物的平均雙親互補率有所提高。83.6%的樣品雙親互補基因型比率在核心引物上高于基礎位點(圖2-A)。核心引物MAF值介于0.33~0.50之間, 平均值為0.43, PIC值介于0.35~0.38之間, 平均值為0.37, 與基礎位點相比均有所提高。

在335份雜交種樣品中, 99.7%樣品的雙親互補基因型比率超過10%, 多個雙親互補引物可供篩選用于純度鑒定(圖2-B)。綜合各項參數說明, 20個純度鑒定核心引物均明顯優于基礎位點和候選位點, 也證明這20個核心引物能夠有效應用于目前國內市場絕大部分玉米雜交種的純度鑒定。

2.3 玉米SNP核心引物純度鑒定實例及高通量檢測方案的建立

使用SNP純度鑒定核心引物對待測樣品京科968進行純度鑒定, 通過SNP-DNA指紋數據庫查詢在20個核心引物中有15個顯示為雙親互補型, 從中隨機選擇MG072、MG135、MG175和MG215等4個引物進行純度鑒定。試驗放置的母本和父本自交系分型均與預期一致,空白對照未檢測到明顯增加的熒光信號, 說明各引物擴增正常, 本次試驗結果可信(圖3)。在檢測的110個個體中, 綜合4個引物的分型結果判定, 共檢出1個自交苗和2個異型株, 純度為97.3%。根據國家標準規定, 玉米單交種的純度不低于96.0%, 試驗結果表明該供試樣品純度符合標準。

在實際純度檢測過程中, 純度待測樣品情況是比較復雜的, 如是否提供樣品信息、是否為批量樣品、是否存在樣品一致性問題等, 因此純度檢測試驗設計不能使用固定模式。基于玉米純度鑒定核心引物對批量樣品純度檢測, 建立高通量純度檢測方案。當樣品信息已知, 可通過玉米SNP-DNA指紋數據庫查詢雙親互補引物, 優先選擇純度核心引物進行檢測。當樣品信息未知, 可以選擇純度核心引物快速建立批量樣品指紋, 并找到雙親互補引物進行檢測。其中雙親互補引物用于快速準確鑒定自交苗, 對于遺傳不穩定的位點, 由于其仍處于分離狀態, 不應計入樣品純度統計。在試驗流程上, 通過快速DNA提取法、高通量擴增、自動化掃描讀取數據和數據庫管理系統批量計算樣品純度等環節的有機結合, 共同實現批量樣品高通量純度檢測。

A為樣品雙親互補基因型比率比較圖, 橫坐標為按照核心引物的樣品雙親互補基因型比率從低到高的樣品排序, 縱坐標為樣品雙親互補基因型比率; B為樣品雙親互補基因型比率柱狀統計圖, 柱狀圖表示樣品雙親互補基因型比率每增加10%區間的樣品數。

A is the comparison chart of parental complementary genotype rate of sample between three loci set, of which the abscissa is the parental complementary genotype rate of sample sorted from low to high according to the core primes and the ordinate is the parental complementary genotype rate of sample; B is the histogram of the parental complementary genotype rate of sample, of which the histogram shows the number of samples for each 10% rise in parental complementary.

圖中每1個點代表1個單株的檢測結果, 其中藍色和紅色點分別代表2種純合基因型, 綠色點代表雙親互補基因型, 黑色點代表空白對照, 三角形點代表親本自交系樣品。

Each point represents the result of single seed, of which blue and red points represent two homozygous genotype, green points represent parental complementary genotype, black points represent non-template control and triangle points represent parental inbred lines samples.

3 討論

3.1 KASP技術應用于玉米純度鑒定的優勢

玉米雜交種純度鑒定應達到快捷、準確、高通量和低成本的要求。本研究在檢測方法中選擇適于高通量樣品檢測平臺KASP技術結合快速DNA提取法, 在技術方案上具有以下優點。

第一, 試驗步驟快速簡便, 易實現高通量自動化。KASP技術是目前應用SNP檢測技術中試驗步驟最簡單的方法之一, 僅需要DNA提取、PCR擴增和數據采集3個環節。由于純度樣品需要對每個單株樣品進行檢測, 常規的DNA提取方法會造成時間和試驗成本增加, 使用快速DNA提取法是純度快速檢測的前提。整體試驗操作結合自動化工作站、高通量水浴和孔板熒光掃描儀等儀器能大幅提高檢測效率, 目前最高配置的SNPLine平臺每輪試驗檢測的最高通量超過8萬個數據點, 如使用Arraytape平臺可進一步提高檢測通量。數據采集與統計利用軟件自動化分析, 進一步提高數據采集的效率, 也減少人工讀取數據誤差的可能。當純度檢測樣品量超過一定范圍, 水浴PCR系統具有明顯優勢。假設有100份樣品集中檢測純度, 每個樣品檢測100個單株, KASP平臺使用4個位點檢測, 總數據點為4萬個, 僅需要一輪擴增即可完成, 擴增后進行全部熒光掃描時間約1 h; 使用熒光毛細管平臺檢測, 需選擇適合的引物組合多重擴增并使用384 PCR儀擴增, 使用96通道毛細管電泳儀掃描, 需要25塊PCR板和100塊電泳板, 每塊電泳板按照30 min掃描完成, 需要50 h即可完成電泳檢測。與熒光毛細管平臺相比, KASP平臺通過使用高通量儀器大大縮短了擴增和檢測時間; 通過自動化數據分型讀取, 減少了數據人工分析時間。

第二, 試驗對于DNA質量容忍度高, 取樣部位限制少。DNA質量是影響篩選標記的是否好用的重要因素, 標記分型結果進一步影響自動化采集數據的效率。使用快速DNA提取法尤其考驗測試位點對DNA質量的容忍度, 主要原因包括DNA拷貝數不如常規方法多, 上清液中含有雜質或PCR抑制劑, 獲得的DNA鏈有可能存在降解斷裂等[19-21]。在本研究測試的位點中, 有84.2%的位點在CTAB法和粗提法中均能夠具有清晰穩定的3個基因型, 說明KASP技術大部分引物對于核酸質量及數量要求很低。原因主要是KASP上下游引物被設計在緊貼著SNP變異位點的幾個堿基對范圍內, 整體擴增產物為100 bp左右, 而且KASP引物在上游引物的5'端連接通用尾巴序列, 在擴增中與體系中的互補序列結合增加熒光基團, 在擴增循環中形成“完美擴增”。因此, 當DNA降解斷裂等情況發生時, 與長目標片段相比, 這種設計使目標片段正常擴增的可能性增加。“完美擴增”使得模板DNA加入的拷貝數很少, 也可實現擴增。使用本文測試的快速DNA提取方法, 對于待測樣品的取樣部位要求限制少, 已經測試的部位, 包括玉米籽粒、幼苗及田間葉片等, 均取得了良好、穩定的分型效果。在實際應用中可以在種子生產和田間鑒定等多個場景中進行純度檢測。

第三, 檢測儀器兼容性高, 檢測成本低。使用KASP技術不僅可以選擇高通量檢測儀器, 還可以跟據常規檢測樣品通量和實驗室已有儀器靈活選擇適宜的儀器。擴增及熒光掃描儀器均選擇廣泛, 擴增儀器不僅可以使用水浴PCR儀, 還可以使用金屬浴PCR儀, 也可以使用平板PCR儀等。熒光掃描既可以使用實時熒光定量PCR儀終點法讀數, 也可以使用能夠檢測FAM和HEX/VIC熒光通道的酶標儀等。同時此類儀器維護成本也較低, 與電泳設備相比, 免去沖洗、換膠等周期性維護工作。KASP體系單個反應的檢測成本低于1元, 具體成本取決于所選擇的反應體系、檢測樣品量和檢測試劑耗材等。當檢測樣本量增加時, 通過減少反應體積, 增加單位面積的檢測數據量, 使檢測成本大幅下降[11]。

3.2 兼容多平臺的SNP位點的轉化和應用

基于SNP標記對于親本與子代差異的可識別性、不受環境影響特性以及試驗結果可靠性。盡管玉米基因組中存在大量SNP位點, 但可供選擇具有多態性、穩定和兼容多平臺的SNP位點仍然只占少數[22], 因此位點篩選中各個評價指標非常重要, 決定了所選標記是否具有大規模應用的潛力。隨著生物技術和生物信息學技術的不斷發展, 挖掘轉化SNP變異位點的方法包括從公共數據庫中挖掘已有SNP位點并進行驗證, 在不同平臺間轉化已有SNP位點以及通過重測序技術挖掘新的SNP位點等[16,18]。本文采用將已有商業化芯片SNP位點轉化為KASP引物的策略, 并在KASP平臺進一步篩選評估獲得純度核心引物。其中, 多態性和雙親互補率參數、是否為單拷貝和是否緊密分型等已通過芯片平臺驗證, 開發KASP標記主要考慮引物雙親互補率、是否與預期結果一致以及試驗分型效果等信息。這種策略在第二階段篩選過程中避免了稀有變異、多拷貝、單拷貝和偏分離等問題, 位點轉化成功率較高, 多平臺間的結果可以有效相互驗證, 保證了標記分型結果的準確性。

基于SNP多平臺兼容性的特點, 我們可以更加靈活的制定檢測方案, 將具有不同特點的平臺結合使用—使用位點高通量的芯片平臺構建樣品SNP指紋數據庫, 通過轉化等位基因命名建立共享樣品指紋數據庫, 并獲得其純度核心引物指紋圖譜。在數據庫中查詢確定雙親互補引物進行純度鑒定, 利用KASP平臺建立樣本高通量的快速檢測方案。其中, 純度SNP核心引物應包含于真實性SNP核心引物, 既具有真實性核心引物的高區分能力, 同時可以保證建庫指紋中包含了純度核心引物, 可以同步采集純度核心引物指紋數據。通過有機結合多個檢測平臺, 發揮不同技術平臺的優勢, 建立合理的檢測方案。

3.3 農作物品種純度檢測技術發展展望

農作物品種純度對于農作物生產具有重要的意義, 純度檢驗主要包括2種類型和對象, 生產企業對于品種純度摸底能夠及時掌握不同批次種子純度, 利于企業質量內控; 而政府抽檢能監控市場流通種子質量, 利于政府宏觀指導。因此, 純度檢測業務具有多元性和兼容性的特點, 在長期狀態下應有多種方案并存, 可根據實際情況選擇具體檢測方案。從方案選擇來看, 傳統的田間鑒定能夠有效觀察品種在不同生長時期的表型變化; 蛋白檢測具有檢測流程簡便、成本低特點; 分子標記檢測能夠有效識別自交苗, 不受生產季節的影響, 區分能力更高[23]。從分子標記類型來看, 二態性標記由于易實現數據采集和整合, 能夠大幅提高檢測效率、降低檢測成本[24], 而多態性標記雙親互補率較高, 更容易獲得雙親互補引物。進而引申到檢測平臺的選擇上, 以熒光顏色為基礎的二態性檢測平臺具有大幅增加樣品檢測能力的可能性, 因此更適合批量樣品; 以長度多態為基礎的電泳檢測平臺可以將引物組合成多重反應也能提高檢測效率, 降低檢測成本。隨著檢測技術的不斷發展, 未來準確、穩定、簡便和快捷的純度鑒定方案將不斷涌現并廣泛服務于種業, 為政府監管和企業提供了更多純度鑒定方案的選擇。

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Identification of SNP core primer and establishment of high throughput detection scheme for purity identification in maize hybrids

WANG Rui1,**, SHI Long-Jian1,2,**, TIAN Hong-Li1, YI Hong-Mei1, YANG Yang1, GE Jian-Rong1, FAN Ya-Ming1, REN Jie1, WANG Lu1, LU Da-Lei2, ZHAO Jiu-Ran1,*, and WANG Feng-Ge1,*

1Maize Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding, Beijing 100097, China;2Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Purity is one of the most important indexes of maize seed quality, especially for inbred seedlings in hybrids which is a key factor affecting field yield. A new high-throughput and economical technology named KASP (Kompetitive allele specific PCR) is suitable for seed purity detection. This study was based on 12 sets of triplet samples of hybrids with their parents and 335 SNP fingerprint data which was nationally approved as standard samples of maize hybrids. Sixty candidate loci were selected from 384 SNP basic loci, and the success rate of transformation from chip to KASP primers was 95%. Considering comprehensive elements including parental complementary rate, polymorphism and other indicators such as stability and genotyping effect of primers, 20 core primers were finally determined for purity identification of maize hybrids. The results showed these core primers were able to effectively identify the purity of 99.7% of tested samples. The purity of tested sample Jingke 968 was identified by searching SNP-DNA fingerprint database and selecting parental complementary primers. One inbred seedling and two off-types were detected in 110 individuals, and the purity value was 97.3%. Meanwhile, a high-throughput purity detection scheme was established based on the core primers of purity identification for batch samples, which is fast, accurate, high-throughput and low-cost, providing more options of purity identification for government regulatory agencies and enterprises.

purity; SNP; KASP; maize hybrid; core primers

10.3724/SP.J.1006.2021.03031

本研究由“十三五”國家重點研發計劃項目(2017YFD0102001)資助。

This study was supported by the 13th Five-Year National Key Research and Development Program of China (2017YFD0102001).

王鳳格, E-mail: gege0106@163.com, Tel: 86-10-51503558; 趙久然, E-mail: maizezhao@126.com, Tel: 86-10-51503936

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

王蕊, E-mail: skywangr@126.com; 施龍建, E-mail: SLJ18752782386@163.com

2020-06-14;

2020-11-19.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201119.0925.002.html