花生莢果發育過程中的microRNA鑒定與表達分析

胡冬秀 劉 浩 洪彥彬 梁炫強 陳小平

花生莢果發育過程中的microRNA鑒定與表達分析

胡冬秀**劉 浩**洪彥彬 梁炫強 陳小平*

廣東省農作物遺傳改良重點實驗室 / 國家油料作物改良中心南方分中心 / 廣東省農業科學院作物研究所, 廣東廣州 510640

花生(L.)是典型“地上開花、地下結果”的作物, 為從轉錄后調控水平解析此獨特的果實發育現象, 本文應用small RNA測序技術研究莢果發育11個時期果殼及種子中的microRNA及其靶基因。通過測序分別獲得212個已知的microRNA和112個新microRNA, 其中, 已知microRNA包括197個保守microRNA和15個花生特異microRNA, 新microRNA來自62個新的microRNA前體序列。表達分析發現, 67個microRNA及其靶基因在莢果發育的11個時期存在時空特異性表達, 部分microRNA的表達量積累階段性調節果殼與種子的發育, 表明microRNA參與了花生莢果暗發育的整個過程。此外, 對28個microRNA與30個靶基因進行熒光定量PCR驗證發現, microRNA和靶基因的表達趨勢與測序結果基本一致。本研究通過對花生莢果不同發育時期的果殼和種子進行small RNA測序, 鑒定參與調控花生莢果膨大相關的microRNA, 為研究黑暗條件下植物果實發育的調控機制與花生遺傳改良奠定理論基礎。

花生; 莢果發育; small RNA測序; microRNA; 靶基因

花生作為“地上開花、地下結果”的作物, 其生殖發育過程與其他作物存在差異。花生開花受精后, 子房柄伸長并向地生長形成果針, 位于其頂端的受精胚珠隨著果針的伸長被推入土壤中, 果針停止伸長, 胚胎發育在黑暗條件下重新啟動, 最終膨大形成莢果。花生莢果發育是一個復雜的生物學過程, 不同水平的調控對花生莢果種子發育均至關重要。研究microRNA如何調控黑暗條件下花生種子發育, 對理解植物果實暗發育調控與作物遺傳改良具有重要意義。

microRNA是一類內源性非編碼小分子RNA, 在植物中通常由18~24個核苷酸組成, 通過靶向降解或翻譯抑制在轉錄后水平調控基因的表達[1]。植物中非編碼的microRNA基因, 在NOT2和CDC5等轉錄因子的作用下通過RNA聚合酶II轉錄生成具有莖環結構的初級轉錄物Pri-microRNA (Primary microRNA)。隨后Pri-microRNA經DCL1、HY1和SE組成的切割復合體剪切產生前體pre-microRNA (microRNA前體)[2], pre-microRNA經DCL1與DCL4進一步剪切生成成熟的microRNA[3], 在甲基轉移酶HEN1的作用下使其3'端發生2'-O-甲基化來增強其穩定性[4-5]。microRNA在轉運蛋白HST作用下從細胞核進入細胞質中, 隨后與AGO效應蛋白(argonaute proteins, AGOs)結合形成RNA介導的沉默復合體(RNA-induced silencing complexes, RISCs)中, 結合互補的靶向基因信使RNA后使其被剪切降解[6]。microRNA作為一種重要的轉錄后調控因子, 參與植物的生長發育、信號轉導、脅迫響應、器官分化以及病原菌調控等多種生物學過程[7-14]。擬南芥中, FUL蛋白與ARF (auxin response factor)相互作用并結合到miR172前體序列的啟動子區域, 通過抑制miR172下游靶基因與3表達進而促進果實發育[15]; 人為干預miR319的表達活性則導致擬南芥花瓣變短、雄蕊敗育、種子缺失等現象[16]。單子葉植物中, 水稻OsIDD2與SLR1相互作用, 通過赤霉素途徑調控miR396介導的細胞增殖過程[17]; 而OsmiR408剪切OsUCL8編碼序列會影響細胞中的銅離子穩態、質體藍素豐度與水稻光合效率, 從而增加穗部分枝和粒數[18]。花生受到黃曲霉侵染時, 種子通過降低ayh-miRNA160、ayh-miRNA164對抗病基因TIR-NBS-LRR表達量產生的負調控效應, 從而提高抗病蛋白的表達量以抵御黃曲霉污染[19]。花生子房柄中的ayh-miR160a、ayh-miR171n與ayh-miR156e通過調控其靶基因參與激素信號轉導途徑, 在花生莢果、種子膨大階段起關鍵作用[20]。

花生(L.)是我國重要的油料與經濟作物, 莢果暗發育是花生最顯著的特征之一, 已有相關研究報道非編碼小RNA參與了花生胚胎與莢果早期的發育[21-22], 但對其莢果種子發育的整個過程缺乏全面的了解, 尤其對microRNA方面的相關研究仍然較為欠缺。本研究以‘粵油7號’為試驗材料, 對其莢果發育不同時期的材料進行small RNA測序, 并利用qRT-PCR技術驗證測序的結果, 鑒定和篩選出花生莢果種子發育過程中相關的microRNA及其在花生莢果種子發育過程中的表達模式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生品種粵油7號種植于廣東省農業科學院白云基地。對粵油7號植株的自交花進行鑒定并用彩色線標記, 在花后第8天用彩色標簽系好伸長的果針。花生果針入土前, 被標記為第1個時期, 命名為P0 (Pod 0); 莢果開始膨大后通過測量莢果與種子的直徑大小, 將整個莢果發育劃分為10個時期, 即P1~P10 (Pod1~Pod10), 其中果殼與種子分開取樣。果殼樣品以縮寫SH (Shell)表示, 種子樣本以縮寫SD (Seed)表示。本研究共對11個時期, 包括1個地上(果針即將入土)和10個地下發育階段(圖1-A), 以開花后天數為參考, 莢果與種子直徑為主要指標來劃分生育期, 最后獲得20份樣品。

1.2 RNA的提取及small RNA測序

利用TRIzol (Invitrogen)法提取20個樣品的總RNA, 使用NanoDrop (Thermo Scientific)和安捷倫2100生物分析儀(安捷倫)對每個樣品的RNA質量進行評估分析; 利用Illumina small RNA-seq文庫構建試劑盒制備small RNA測序文庫, 利用Illumina HiSeq 2000平臺產生原始測序數據。

1.3 small RNA測序結果分析

利用Fastx-Tool kit, 對small RNA序列的原始數據進行過濾篩選, 去除接頭序列、低質量序列, 包括冗余堿基或未被識別的堿基冗余序列, 以及小于18 nt的序列。將過濾后的數據利用Rfam 11.0數據庫和GenBank非編碼RNA數據庫去除t/r/sn/snoRNA以及帶有ployA尾巴的RNA, 對其他的small RNA序列利用microRNA19.0數據庫進行BLASTn搜索, 以檢索花生中已知的microRNA。此外, 利用Bowtie將small RNA序列映射到GenBank中的AHGI v2.0和花生GSS中進行比對, 完全匹配的序列將用于進一步分析。如果接近完全匹配的序列小于檢索的small RNA或已知small RNA的長度, 則人工挑選檢查與比較不匹配部分, 以確定匹配核苷酸的數量。為了有效識別花生中潛在的microRNA前體序列和新的microRNA, 用miREAP預測軟件分析microRNA前體序列, 利用MiPred對由此產生的莖環結構進行過濾, 剩余的pre-microRNA的二級發夾結構使用CentroldFold軟件進行評估。

1.4 花生莢果發育過程中microRNA趨勢分析

microRNA測序數據以RPKM (reads per kilobase per million mapped reads)值表示, 將表達量數據歸一化分析。差異表達的microRNA以RPKM > 10為篩選標準, 以此數據為基礎利用TBtools軟件繪制表達熱圖, 利用STEM軟件對花生莢果發育過程中的microRNA和靶基因進行趨勢分析, 并獲得顯著性和非顯著性表達模式, 其中≤0.05的定義為顯著表達模式。

1.5 莖環RT-PCR熒光定量檢測microRNA

取5 μg總RNA加入DNase I去除基因組DNA污染, 利用TaKaRa SMART Scribea Reverse Transcriptase反轉錄酶對microRNA進行反轉錄。取2 μg的總RNA樣品中加入終濃度為2 μmol L-1的microRNA的莖環引物, 將混合物在72℃預熱3 min后置于冰上冷卻使RNA變性, 打開二級結構。隨后加5×First Strand Buffer、dNTP Mix、20 mmol L-1DTT、0.15 μL RRI (recombinant RNase inhibitor, 40 U μL-1)。加入1 mL (100 U μL-1) SMART Scribe RT再次混勻, 42℃孵育60 min, 反應結束后70℃加熱15 min或加入4 μL 50 mmol L-1EDTA終止反應。熒光定量PCR方法參照試劑AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明書, 上述反轉的cDNA樣品濃度稀釋為150 ng μL-1。熒光定量PCR的反應體系為20 μL, 包含10 μL SYBR Green Master Mix、2 μL模板、特異性正向引物和通用反向引物各0.4 μL、0.4 μL ROX Reference Dye I、6.8 μL的ddH2O。ABI Step OnePlus儀器檢測, 循環反應為95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 共40個循環;為內參基因, 用2-ΔΔCT法計算microRNA表達水平的相對定量, 每個樣品設置3次生物學重復。

1.6 Quantative real time-PCR檢測靶基因表達量

利用Prime Script RT試劑盒(TaKaRa, 中國大連)將1 μg總RNA反向轉錄為cDNA, 反應體系為20 μL, 采用ABI Step One Plus系統, 使用SYBR Premix Ex(TaKaRa, 中國大連)進行PCR反應, 用2-ΔΔCT法計算目標基因各組織的相對表達量, 以P0作為對照樣品。作為內參基因, 每個樣品設置3個重復, 數據用平均值±標準差(Mean± SD)表示。

2 結果與分析

2.1 花生莢果種子發育的表型特征

花生開花受精后, 子房柄不斷伸長形成果針(P0)。隨著果針的伸長, 位于其頂端的受精胚珠進入土壤中, 當果針剛進入地下時(P1), 其直徑并未發生變化(圖1-B)。在黑暗條件下, 果針停止伸長, 頂端迅速膨大形成莢果(P2~P6)。通過測量直徑, 果殼在P6時期的直徑大小是P2時期的5~6倍, 但是P6階段過后, 果殼基本不再繼續膨大, 因此進入土壤后的第6個時期是果殼發育逐漸停止的時期。種子發育在P2~P6階段生長緩慢, 在P6期果殼不再發育之后, 種子則以較快的速度開始充實, 其直徑從P6到最后的成熟期, 至少增大了3倍以上。表明, 果殼早于種子開始發育, 果殼的提前膨大為后續種子生長提供了空間和能量, 兩者間發育的時間差有利于能量物質有效地供應種子生長。

A: 試驗樣品信息; B: 花生莢果種子發育的表型特征。P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實充實期; P9~P10: 成熟期。

A: summary of experimental samples; B: phenotype characteristics of peanut pod (shell and seed) development. P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

2.2 花生莢果發育過程中small RNA分析

對花生果殼和種子發育的20個樣品進行small RNA測序, 共獲得282,960,633個reads, 每個文庫的reads數量從7,049,655到17,761,513。對接頭序列和短序列進行修剪后, 共得到206,940,419個序列(圖2-B), 長度大于17 nt。其中長度在18~30 nt的有177,581,859條, 有38,699,203條為花生中的特異small RNA。

microRNA屬于微小的非編碼RNA, 在轉錄后水平的基因調控中具有重要作用。為全面了解莢果發育過程中microRNA的全基因組信息, 從花生莢果種子發育過程中鑒定了長度為18~30 nt的small RNA序列(圖2-A), 在21個和24個核苷酸處觀察到了花生地下莢果種子發育(P1~P10)的2個主要高峰。果殼文庫(P2SH~P10SH)有2個接近的高峰, 而種子文庫(P2SD~P10SD)則以24個核苷酸small RNA為主。值得注意的是, 氣生莢果P0中19個核苷酸處出現1個額外的高峰, 進一步分析發現, 這19個核苷酸序列中的大多數來自于幾個高度表達的microRNA。此外, 在最初的地下莢果P1中, 總的small RNA在27~30個核苷酸之間高度表達, 但24個核苷酸small RNA在所有樣本中均占優勢, 在種子和果殼的總small RNA中分別占74%和72%, 表明花生的small RNA是類型復雜且多樣的非編碼RNA。

A: 全部以及特異性small RNA的長度分布和頻率; B: small RNA統計分析; C: small RNA的分類。P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實充實期; P9~P10: 成熟期。

A: length distribution and frequency of total and unique small RNAs; B: summary statistics of small RNAs; C: the categories of peanut small RNAs. P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

2.3 花生莢果發育過程中small RNA的鑒定

為進一步鑒定花生中保守的和新的特異性microRNA, 我們通過圖3所示的策略分析small RNA。對接頭和短序列進行過濾后, 共得到38,699,203條花生的特異small RNA, 隨后去除t/r/sn/snoRNA共15,326,397條, 其中rRNA的數量最多, 其次是tRNA、snRNA和snoRNA數量相對較少(圖2-C)。得到38,326,363條候選的small RNA, 鑒定到212個已知的microRNA, 包括39個microRNA家族的197個保守的microRNA和13個microRNA家族的15個特異microRNA (附表1)。經過逐步篩選, 本研究還獲得62個新的microRNA二級前體結構以及其對應生成的112個新的成熟microRNA。將前體命名為ahy-MIR-s (1~62)。利用RNAfold在線軟件(http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWeb- Suite/RNAfold.cgi)預測其二級結構(圖4), 所有前體都能形成莖環結構, 多數前體形成4~6個莖環, 此外, ahy-MIR-s23、ahy-MIR-s31和ahy-MIR-s57等3個前體形成了3個莖環, ahy-MIR-s2、ahy-MIR-s36和ahy-MIR-s56 3個前體有7個莖環, ahy-MIR-s45和ahy-MIR-s20分別形成1個和8個莖環。進一步研究發現, 112個新的成熟microRNA (表1)定位于62個的新的Pre-miRNA的3￠臂或5￠臂, 并將其命名為ahy-miR-s(1-62)-3/5P, 大小為19~24 nt, 其中ahy-miR-s8-3p為19 nt, ahy-miR-s3-5p、ahy-miR-s7- 5p和ahy-miR-s29-5p等7個microRNA為20 nt, ahy-miR-s1-3p、ahy-miR-s2-3p和ahy-miR-s3-3p等40個microRNA為21 nt, 序列長度為22 nt和23 nt的microRNA分別為12個和6個, ahy-miR-s6-5p、ahy-miR-s15-5p和ahy-miR-s16-3p等46個microRNA長度為24 nt。

2.4 花生莢果發育過程中microRNA的表達分析

對RPKM大于10的microRNA進行表達分析發現, 在花生莢果11個發育階段共有67個microRNA差異表達。利用TBtools軟件[23]進行聚類分析和繪制熱圖(圖5)發現, microRNA在莢果發育過程動態表達, 且呈時期特異性。在種子中microRNA的表達可分為K1、K2和K3三個簇, K1簇中microRNA在種子發育中表達相對較低。在K2簇中microRNA在種子成熟期(P7~P10)高表達。例如, ahy-miR166e、ahy-miR-s21-5p和ahy-miR-s26-5p在P8具有較高的表達量, 而ahy-miR-s1-3p、ahy-miR319c、ahy- miR-s29-5p和ahy-miR-s53-5p等4個microRNA在P10表達顯著高于其他時期; ahy-miR166h-3p、ahy-miR168a和ahy-miR-s12-5p等microRNA在P8~P10都呈現了較高的表達。K3簇中microRNA主要在P5~P7中表達, 其中ahy-miR319i、ahy- miR390a-5p和ahy-miR-s31-5p等3個microRNA在種子初期(P2)有較高表達。ahy-miR167-3p、ahy-miR- s36-5p和ahy-miR-s10-5p等3個microRNA在P4~P6均有較高表達。在種子發育過程中P3時期microRNA的表達都相對較低。microRNA在果殼中的表達, 聚類將其分為了5個簇, C1簇中microRNA在果殼P8~P10高度表達, 例如, ahy-miR319c、ahy-miR156b-5p和ahy-miR167e分別在P10、P9和P8時期高豐度表達。C2簇主要在果殼發育初期(P2)高豐度表達, C3簇中microRNA呈現階段性表達, 主要在P5~P9期有較高的表達量, 例如ahy- miR167c在P7~P9均表達較高。C4簇中microRNA在果殼中呈現低表達, C5簇主要在P3呈現高表達。表達分析結果進一步表明, microRNA在果殼和種子中都以高度階段性或時期特異性的方式表達。

花生莢果發育過程中microRNA的趨勢分析結果顯示, 花生莢果發育中的microRNA共分為10種表達模式(圖6-A), 大約84%的microRNA聚類到兩種模式, 其中有43個microRNA聚類為profile.9表達模式(圖6-B), 13個microRNA聚類為profile.8表達模式, 說明花生莢果發育過程中多數microRNA歸入上述2個顯著表達模式。microRNA在花生莢果發育過程中的表達是動態的, 在profile.9表達模式中, 花生莢果發育初期(P2~P5期)中microRNA的表達在種子中呈現下調, 在果殼中表達也較低, 隨后microRNA表達上調, 種子和果殼發育中期(P6~P7期) microRNA表達達到最高, 花生莢果發育后期microRNA表達下調。在profile.8表達模式中, 花生莢果發育過程中microRNA的表達均處于上調, 在種子發育P4和P7期表達最高, 而在果殼中P9期表達最高。在其他幾個表達模式中, microRNA在花生莢果發育的不同時期的積累水平也存在一定的差異。

P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實充實期; P9~P10: 成熟期。

P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

2.5 花生莢果發育過程中靶基因的表達分析

microRNA在轉錄后水平調控其下游靶基因來發揮生物學功能, 對67個microRNA的靶基因進行預測分析, 按照錯配數≤5進行篩選, 共得到552個靶基因, 其中ahy-miR482e的靶基因數目最多(32個), ahy-miR-s51-3p和ahy-miR-s58-5p的靶基因數目最少(僅1個)。大多數保守的microRNA的靶基因是MYB、ARF和BEL1-like等轉錄因子, 其他microRNA的靶基因包括NB-LRR型抗病蛋白、F-box/FBD/LRR重復蛋白和鋅指蛋白等, 此外還有部分未知功能的靶基因。為了進一步了解所預測靶基因的可能功能, 對其進行表達模式分析, 如圖7所示, 其靶基因在花生果殼和種子發育過程中也呈現了高度階段性和特異性的表達方式。例如,為BEL1-like轉錄因子, 在種子的P6期高豐度表達, 而和分別在果殼的P4和P3期高豐度表達。編碼了NB-LRR抗病蛋白, 在種子中表達量較高, 而在果殼中幾乎不表達。介導絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)途徑, 在莢果發育的后期, 即種子和果殼的P7~P10期均有較高的表達。值得注意的是,在莢果發育的整個過程中均高豐度表達, 但對其功能有待研究。

P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實充實期; P9~P10: 成熟期。

P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

對花生莢果發育過程中靶基因表達趨勢進行分析表明, 花生莢果發育過程中靶基因共有20個表達模式(圖8)。其中有profile.7、profile.11、profile.18和profile.19等4個顯著表達模式, 在profile.7表達模式中, 基因在種子P6~P9中高豐度表達, 在種子成熟期基因表達逐漸下調, 而在果殼中表達相對較低。在profile.11表達模式中, 基因在種子和果殼的發育早期表達最高。在profile.18中基因在莢果發育的過程中均處于上調表達, 在種子P3和P6以及果殼的P9時期表達量最高。在profile.19中, 種子發育早期基因表達量較低, 在P6時期基因上調表達, 而在果殼發育早期基因表達量較高, P8期開始下調表達。

2.6 RT-PCR實時定量驗證

為了驗證測序結果數據的準確性, 選取28個microRNA和30個靶基因分別進行莖環RT-PCR和實時熒光定量PCR檢測發現, microRNA和靶基因的表達趨勢與測序分析結果基本一致(圖9)。例如, 在microRNA中(圖9-A), ahy-miR-s29-5p和ahy- miR166d分別在種子P10和果殼P3高豐度表達; ahy-miR2118a在果殼中高豐度表達, 而在種子中表達相對較低; ahy-miR156e在種子發育過程中從P3時期開始有表達, P7時期表達量最高, 隨后逐漸降低, 而在果殼中幾乎不表達。在靶基因表達中(圖9-B),編碼的AUX1蛋白基因在果殼P10時期的表達顯著高于其他時期,為GATA轉錄因子, 在種子的P8時期高表達,為乙醇酸氧化酶基因, 該基因在種子P7~P9時期均高豐度表達, 呈現階段性的表達方式。總體而言, 熒光定量檢測結果表明, microRNA及其靶基因的表達量與測序結果基本一致, 該結果為后續深入分析、克隆microRNA及其靶基因調控花生莢果發育奠定了基礎。

P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實充實期; P9~P10: 成熟期。

P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

3 討論

為了解花生莢果發育過程的表型特征, 對花生莢果的1個地上發育時期和10個地下發育時期的研究發現, 果針向地生長過程中(即P0~P1時期)不斷伸長但其直徑幾乎不變, 果針入土后停止生長, 胚胎恢復發育, 莢果迅速膨大, 即P2~P6時期是莢果體積的快速增長階段, 而種子的發育相對滯后, 即在這一時期生長相對緩慢。在P6時期后莢果大小基本不變, 種子則進入快速生長階段。因此, P6時期既是莢果停止膨脹的分界點, 也是種子進入快速發育階段的分界點。

本研究獲得了62個新的Pre-microRNA和112個新的成熟的microRNA, 對Pre-microRNA進行二級結構預測發現, 所有前體均具有典型的莖環結構, 且多數序列(A+U)含量高于(G+C)含量, 說明鑒定得到的microRNA前體結構較穩定。成熟的microRNA在莖環結構的3￠臂或5￠臂上, 并能檢測到其表達。此外, 對microRNA進行表達模式分析表明, microRNA在莢果發育過程中的表達是動態的, 且呈現階段性和特異性表達。例如, ahy-miR390a-5p在種子P2時期表達較高, 在甘藍型油菜中, miR390通過調控靶基因的表達介導早期胚胎發育, 從而影響其種子的含油量, 推測ahy-miR390a-5p可能參與花生莢果發育早期胚胎的發育[24]。ahy-miR156d和ahy-miR156e在花生種子成熟期(P7~P9)的表達顯著高于其他時期, 相關研究表明, miR156通過靶向和基因, 能夠導致不正常的細胞分裂[25], 從而控制種子的發育[26-27]。ahy-miR397a在P0期高度表達, 在水稻中, miR397的過表達通過靶向L-抗壞血酸氧化酶(AO)[28], 抑制抗壞血酸(AA)的氧化, 從而使脫氫抗壞血酸(DHA)維持在較低水平, 進而促進細胞分裂[29]。而種子在早期發育階段需要具備很高的細胞分裂能力, 推測ahy-miR397a可能通過抗氧化途徑而調控花生種子的發育過程。ahy-miR167e在種子P4~P7時期表達顯著高于其他時期, ahy-miR167-5p在種子發育過程中均高表達, 在擬南芥和水稻中, miR167通過調控靶基因和的表達參與種子的發育[30-31], 因此ahy- miR167可能在花生莢果發育過程中發揮重要作用。microRNA319家族(ahy-miR319a、ahy-miR319b、ahy- miR319e和ahy-miR319f)在P0時期高度表達, miR319在花生莢果發育過程中參與生長素和GA信號傳導途徑, 能夠促進花生胚胎和莢果早期發育[22]。

P0: 地上果針; P1: 地下果針; P2~P5: 果殼膨大期; P6~P9: 果實充實期; P9~P10: 成熟期。

P0: aerial peg; P1: subterranean peg; P2–P5: pod expansion stage; P6–P9: seed filling stage; P9–P10: mature stage.

4 結論

花生莢果種子發育過程中, microRNA以時空特異的方式表達, 表明不同的microRNA在花生莢果、種子發育的不同時期發揮作用, 該結果為闡釋花生莢果暗發育的分子機制提供了轉錄后調控的理論參考依據。

附表 請見網絡版: 1) 本刊網站http://zwxb.chinacrops.org/; 2) 中國知網http://www.cnki.net/; 3) 萬方數據http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuo wxb.aspx。

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Identification and expression analysis of microRNA during peanut (L.) pod development

HU Dong-Xiu**, LIU Hao**, HONG Yan-Bin, LIANG Xuan-Qiang, and CHEN Xiao-Ping*

Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / South China Peanut Sub-Center of National Center of Oilseed Crops Improvement / Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong, China

“Aerial flower and subterranean fruit” is a distinct feature in peanut (L.). To dissect this character at post-transcription level, small RNA sequencing was performed to identify microRNAs in peanut pod shell and seed during eleven developmental stages. Sequencing analysis identified 212 known microRNAs, including 197 conserved and 15 specific microRNA. In addition, 112 novel microRNAs from 62 novel microRNA precursors were identified. Among the known and new microRNAs, 67 microRNAs and their target genes showed differentially expressed patterns during peanut pod development. Expression trend analysis revealed stage-specific and tissue-specific expression of microRNA and their target genes during pod shell and seed development, implying that microRNAs probably played a role in peanut pod development. To validate expression profiles from small RNA sequencing, quantitative real-time RT-PCR were performed using 28 microRNAs and 30 target genes, revealing consistent expression profiles with sequencing results. The data regarding microRNA and their target genes generated in this study would contribute to understanding the molecular mechanism of plant fruit development under darkness and to crop improvement.

peanut; pod development; small RNA sequencing; microRNA; target gene

10.3724/SP.J.1006.2021.04144

本研究由廣東省重點研發計劃項目(2020B020219003), 國家自然科學基金項目(31771841)和廣東省基礎與應用基礎研究基金(2020A1515010021)資助。

This study was supported by the Guangdong Provincial Major Research and Development Project (2020B020219003), the National Natural Science Foundation of China (31771841), and the Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2020A1515010021).

陳小平, E-mail: chenxiaoping@gdaas.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

胡冬秀, E-mail: HuDX1017@163.com; 劉浩, E-mail: liuhao@gdaas.cn

2020-07-02;

2020-10-14;

2020-11-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201118.1557.006.html