DNA甲基化參與調控馬鈴薯響應干旱脅迫的關鍵基因挖掘

李鵬程 畢真真 孫 超 秦天元 梁文君 王一好 許德蓉 劉玉匯 張俊蓮 白江平,*

DNA甲基化參與調控馬鈴薯響應干旱脅迫的關鍵基因挖掘

李鵬程1,2,**畢真真1,2,**孫 超1,2秦天元1,2梁文君1,2王一好1,2許德蓉1,2劉玉匯1,2張俊蓮1,2白江平1,2,*

1甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/ 甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室, 甘肅蘭州 730070;2甘肅農業大學農學院, 甘肅蘭州 730070

植物受到干旱脅迫時, 會通過DNA甲基化做出快速反應以幫助其應對脅迫。為探究在干旱脅迫下, DNA甲基化是如何影響基因轉錄表達, 本研究對甘露醇模擬干旱和5-azadC (去甲基化)處理下, 抗旱性不同的2個馬鈴薯品種(抗旱型, 青薯9號; 干旱敏感型, 大西洋)進行轉錄組學分析, 以Fold-change > 2和校正后< 0.01進行差異表達基因(DEG)的篩選。GO富集分析發現, 2種處理都共同顯著富集到氧化應激和碳水化合物代謝過程相關的GO term。說明不同耐旱性馬鈴薯在響應干旱脅迫時, 與這些GO term相關的基因也受DNA去甲基化調控。對既響應干旱又響應DNA去甲基化的1345個DEG進行KEGG功能富集發現, 與植物抗旱相關的通路有植物MAPK信號途徑、植物激素信號轉導途徑、植物谷胱甘肽代謝通路、糖酵解與糖異生和磷酸肌醇代謝通路。說明這些通路相關基因在大西洋和青薯9號2個抗旱性不同的馬鈴薯品種中, 響應干旱的敏感性受DNA甲基化調控。接著對DEG上游1500 bp啟動子區域進行順式作用原件和甲基化CpG島分析發現, 干旱脅迫下參與植物谷胱甘肽代謝的GST基因通過DNA去甲基化來降低啟動子區ABRE和CAAT-box作用元件的甲基化水平, 進而激活該基因的表達以應對干旱脅迫。因此, 利用比較轉錄組學分析干旱和DNA去甲基化處理下的差異基因, 可挖掘到DNA甲基化參與調控馬鈴薯響應干旱脅迫的相關基因, 為研究馬鈴薯干旱脅迫響應的表觀遺傳學機理提供新的研究思路。

馬鈴薯; 干旱脅迫; DNA甲基化; 轉錄組; 谷胱甘肽S轉移酶

干旱脅迫通常發生在土壤水分不足以維持植物正常的生命活動且蒸發量大的區域[1]。水分缺乏是限制植物生長發育的關鍵因素, 影響植物的伸長和膨大生長[2-3]以及土壤養分供應的不平衡等[4]。馬鈴薯作為四大主糧作物之一, 也是水分敏感作物。中國的馬鈴薯主要種植在西北干旱和半干旱地區, 因此干旱嚴重影響了馬鈴薯的植株生長、塊莖大小和商品屬性[5]。

近年來, 除了闡明響應干旱脅迫的信號轉導機制外, 越來越多的研究表明, 表觀遺傳調控在植物干旱脅迫響應中具有重要的作用[6-7]。DNA甲基化是發現最早、研究最深入的表觀遺傳修飾中的一種。DNA甲基化的修飾往往與基因的轉錄相關, 即DNA甲基化程度越高, 基因的轉錄水平越低[8-9]。干旱脅迫會引起植物體內DNA甲基化水平的改變, 激活脅迫相關基因的表達、轉座子的活性以及調控啟動子區域的開關, 以增強植物適應及抵御脅迫的能力[10]。Fei等[11]研究表明, 2個不同耐旱性的小麥品種中的胞質甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPC)[12]啟動子中不同類型和水平的DNA甲基化動態變化與干旱脅迫反應中基因表達之間存在顯著關系。Liang等[13]研究表明, 轉錄因子可能通過DNA甲基化調控從而在毛果楊干旱脅迫反應中發揮重要作用。對耐旱(Bachar)和干旱敏感(F177)蠶豆基因型的全基因組DNA甲基化多態性進行分析, 確定了6個與干旱脅迫相關的差異甲基化區域, 且發現干旱脅迫下Bachar的抗旱相關基因的表達水平高于F177。這表明全基因組DNA甲基化變化可能是蠶豆對響應干旱脅迫的重要調控機制[14]。本試驗前期通過5-azadC處理不同干旱敏感的馬鈴薯品種發現, 干旱脅迫下DNA去甲基化參與調控馬鈴薯試管苗表型性狀及生理生化的響應[15]。而有關DNA甲基化如何影響干旱脅迫下馬鈴薯相關基因的變化尚不清楚。

通過轉錄組測序比較不同物種中不同基因型的轉錄表達是探索非生物脅迫下抗性基因、闡明代謝途徑以及解析響應脅迫的耐受性機制的最合適技術之一[16-17]。因此, 本研究通過比較轉錄組學分析以探討耐旱型品種青薯9號和干旱敏感型品種大西洋在干旱脅迫和DNA甲基化抑制劑處理下相關基因的表達特性, 以期獲得受DNA甲基化調控響應干旱脅迫的相關基因, 從而為更好地闡明DNA甲基化參與調控馬鈴薯響應干旱脅迫的分子機制, 擴展對馬鈴薯耐旱機制的認識, 為馬鈴薯抗旱分子育種的新方法提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

馬鈴薯耐旱品種為青薯9號(Qingshu 9), 干旱敏感品種為大西洋(Atlantic), 均由甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室提供。使用紙橋法將2個品種的馬鈴薯組培苗莖段接種到MS液體培養基(不含瓊脂), 每個莖段帶有1個腋芽, 生長環境條件為溫度(22±2)℃, 光強25.0~37.5 μmol m-2s-1, 光照16 h d-1。培養24 d后, 用200 mmol L-1甘露醇和60 μmol L-1DNA甲基化抑制劑(5-azadC)處理馬鈴薯試管苗, 分別取處理2、6、12和24 h以及未進行處理(對照, 0 h)試管苗的莖葉, 迅速使用液氮冷凍, 存儲在-80℃超低溫冰箱備用。每個處理3個生物學重復。5-azadC (5-aza-2’-deoxycytidine)購于Sigma公司。

1.2 莖葉總RNA提取、文庫構建及轉錄組測序

使用植物總RNA提取TRIzol試劑(Invitgen, 美國)分別提取54個樣品{2個品種′[對照+(2種處理′4個時間點)]′3次生物學重復}的總RNA, 用Turbo DNase I (Ambion, 美國)處理30 min后使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, 德國)進行純化; 然后使用TruSeq RNA sample Prep V2 kit (Illumina, 美國)構建轉錄組測序cDNA文庫, 并利用Agilent 2200 TapeStation (Agilent, 美國)系統檢測cDNA文庫質量; 最后使用Illumina HiSeqX10測序儀上進行雙端測序。

1.3 轉錄組數據分析

首先使用FASTQC對下機數據進行質控并計算Q20、Q30和GC含量。然后從ENSEMBL植物數據庫中下載了馬鈴薯參考基因組序列(SolTub 3.0)和注釋文件(gtf), 利用HISAT2將測序reads比對到馬鈴薯參考基因組中, 獲得sam文件; 利用Samtools 工具將sam文件轉換為bam文件并排序, 使用Cufflinks對排序后的bam文件進行轉錄本的組裝和定量; 使用HTseq-count計算各樣本轉錄本的counts數, 利用Python腳本計算參考基因組各基因的長度, 使用R包Dseq2計算各基因的TPM (Transcripts Per Million, 每百萬條reads的轉錄本)和樣本間的差異表達分析。將校正后的<0.01和變化倍數大于2定義為差異表達基因(DEG), 通過比較青薯9號和大西洋在同一處理同一時間點的表達水平來確定差異表達基因。采用在線工具g:Profiler[18](https://biit.cs. ut.ee/gprofiler_beta/gost)進行GO和KEGG功能富集分析, 以<0.05作為顯著富集GO term和KEGGpathway的篩選條件。

1.4 啟動子區甲基化CpG島預測和順式作用元件分析

先使用perl腳本批量提取所分析基因上游1500 bp啟動子序列, 然后利用在線軟件MethPrimer[19](http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/MethPrimer.cgi)對差異富集基因5￠調控區進行CpG島預測, 預測參數設置為: CpG島長度>100 bp, CPG檢測含量/CpG期望含量 (Obs/Exp)>0.60, GC含量>50%。使用Plant Care[20](http://bioinformatics.psb.ug ent. be/webtools/plantcare/html/)預測基因啟動子的順式作用元件?

1.5 實時熒光定量PCR驗證

隨機選擇22個差異基因, 使用Primer Express 3.0.1設計引物(表1), 進行實時熒光定量PCR分析。采用cDNA合成試劑盒9 (TaKaRa, 日本)將各樣品3次生物學重復的RNA反轉錄為cDNA, 以為內參, 利用QuantStudio5實時熒光定量PCR系統 (ABI, 美國)進行熒光定量檢測。每個樣品3次生物學重復, 按2–ΔΔCT相對定量法計算相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR所用的引物

2 結果與分析

2.1 不同馬鈴薯品種干旱和DNA甲基化處理下差異表達基因的鑒定與分析

在數據過濾和質量評估后, 54個樣品產生了大約2547百萬的reads數, 平均每個樣本約產生7.1 G堿基, GC含量均在44.17%~46.83%范圍之間。應用RNA-seq分析比對軟件HISAT2將各樣本所有的reads與馬鈴薯參考基因組序列進行比對, 比對率為75.56%~94.64% (表2)。

為了分析不同耐旱型馬鈴薯品種在甘露醇和5-Azadc處理期間轉錄水平的差異, 使用R包Dseq2對大西洋和青薯9號在同一時間樣本的TPM值計算了所有差異基因的表達。以Flod-change>2和校正后<0.01作為差異表達基因 (DEG)的篩選標準。結果表明, 在對照 (0 h)下, A vs. Q中篩選到1030個DEG,其中有515個上調和515個下調表達基因。干旱處理下, 在A vs. Q 2 h中篩選到568個DEG, 其中有384個上調表達基因, 184個下調表達基因, 在A vs. Q 6 h中篩選到994個DEG, 其中有560個上調表達基因, 434個下調表達基因, 在A vs. Q 12 h中篩選到519個DEG, 其中有321個上調表達基因, 198個下調表達基因, 在A vs. Q 24 h中篩選到1251個DEG, 其中有471個上調表達基因, 780個下調表達基因。DNA去甲基化處理下, 在A vs. Q 2 h中篩選到1603個DEG, 其中有1033個上調表達基因, 570個下調表達基因。在A vs. Q 6 h中篩選到501個DEG, 其中有641個上調表達基因, 434個下調表達基因。在A vs. Q 12 h中篩選到1153個DEG, 其中有576個上調表達基因, 577個下調表達基因。在A vs. Q 24 h中篩選到981個DEG 其中有465個上調表達基因, 516個下調表達基因(表3)。

為了進一步分析馬鈴薯不同品種在不同處理下特定和共同差異表達基因變化。利用R語言分別繪制了干旱和DNA去甲基化處理下的Upset圖(圖1-A, B)。與對照相比, 干旱處理下, A vs. Q在2、6、12和24 h時差異表達基因總數為1790, 在2、6、12和24 h中特異表達的差異基因為170、432、175和507個, 在4個時間點共同表達的基因有17個; DNA去甲基化處理下, A vs. Q在2、6、12和24 h中差異表達基因總數為2617, 在2、6、12和24 h中特異表達的差異基因為890、435、345和291個, 在這4個時間點共同表達的基因有29個。同時繪制了對照、干旱和DNA甲基化抑制劑處理下A vs. Q差異表達基因的韋恩圖(圖1-C), 干旱和DNA甲基化抑制劑處理下共同表達的基因有1354個, 表明這1354個基因可能受DNA甲基化調控參與馬鈴薯干旱響應, 可作為后續基因挖掘的重點部分。

表2 測序reads數比對到參考基因組的基本統計

C: 對照處理; A: DNA甲基化抑制劑處理; M: 干旱處理; At: 大西洋; Qs: 青薯9號。

C: control treatment; A: 5-azadC treatment; M: mannitol treatment; At: Atlantic; Qs: Qingshu 9.

表3 干旱、DNA去甲基化處理下不同品系間差異表達基因數量

A和B是UpSet圖, 分別表示干旱和DNA去甲基化處理下AvsQ各時間點比較得到的集合的重疊和DEG的數量。C是韋恩圖。

A and B are UpSet diagrams, showing the overlap of sets and the number of DEG obtained by comparison of AvsQ at each time point under drought and DNA demethylation, respectively. C is the venn diagram.

2.2 不同馬鈴薯品種干旱和DNA甲基化處理下差異表達基因GO分析

甘露醇處理下, 對A vs. Q在2、6、12和24 h中共1790個差異表達基因進行GO功能富集分析發現, 這些差異基因主要富集包括生物過程、分子功能、細胞組分三大分類下的42個GO term (圖2-A)。生物學過程共富集到15個GO term, 主要是苯丙烷類分解代謝過程(GO:0046274和GO:0009698)、木質素代謝過程(GO:0009808)、氧化還原過程(GO:0055114)、蛋白質磷酸化(GO:0006468)、植物型細胞壁組織或生物發生(GO:0071669)和碳水化合物代謝過程(GO:0005975)。分子功能共富集到22個GO term, 與催化活性(GO:0003824)、氧化還原酶活性(GO:0016491和GO:0016682)、碳水化合物結合(GO:0030246)、水解O-糖基化合物的水解酶活性(GO:0004553和GO:0016798)、天冬氨酸肽酶活性(GO:0070001和GO:0004190)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(GO:0004674)、木糖基轉移酶活性(GO:0016762)、蛋白激酶活性(GO:0004672)、內肽酶抑制劑活性(GO:0004866)、鈣調素結合(GO: 0005516)和磷酸轉移酶活性(GO:0016773)相關。細胞組分共富集到5個GO term, 主要是質外體(GO:0005576)、細胞膜(GO:0005576和GO:0030312)和細胞壁(GO:0005618)。同樣地, 對DNA甲基化抑制劑處理下, A vs. Q在2、6、12和24 h共2617個差異表達基因進行GO功能富集分析(圖2-B)發現, 這些差異基因也顯著富集到生物過程、分子功能、細胞組分下的39個GO term。其中富集到生物學過程的共16個, 主要包括氧化還原過程(GO: 0055114)、碳水化合物代謝過程(GO:0005975)、糖代謝過程(GO:0010411、GO:0006073、GO:0044042、GO: 0010410、GO:0044264、GO:0010383和GO:0005976)和蛋白水解(GO:0045861)過程。分子功能共富集到18個GO term, 與催化活性(GO:0003824)、加氧酶活性(GO:0004497)、氧化還原酶活性(GO:0016491)、血紅素結合(GO:0020037)、木糖基轉移酶活性(GO: 0016762)、輔酶因子結合(GO:0048037)、水解O-糖基化合物的水解酶活性(GO:0004553)和內肽酶抑制劑活性(GO:0004866)相關。細胞組分共富集到5個GO term, 主要是是質外體(GO:0005576)、細胞壁(GO: 0005618)和細胞膜(GO:0005576和GO:0030312)。

同時比較干旱處理和去甲基化處理下所富集的GO term發現, 2種處理都共同顯著富集到催化活性(GO:0003824)、氧化還原酶活性(GO:0016491和GO:0016682)、木糖基轉移酶活性(GO:0016762)、內肽酶抑制劑活性(GO:0004866)、碳水化合物代謝過程、質外體(GO:0005576)、細胞壁(GO:0005618)和細胞膜(GO:0005576和GO:0030312)。

2.3 兩種處理下共同差異表達基因表達聚類分析

聚類分析主要是把表達模式一致的差異表達基因歸為一類。以干旱和DNA甲基化抑制劑處理下A vs. Q共同差異表達的1354個基因的表達量為目標, 對各樣本進行表達層次聚類分析。由圖3可知, A vs. Q在干旱和DNA甲基化抑制劑處理下的表達模式基本一致。表達趨勢主要分為: 2種處理下持續下調表達基因, 說明與馬鈴薯響應干旱脅迫相關的負向調節基因受到DNA去甲基化的負調控; 以及2種處理下持續上調表達基因, 說明與馬鈴薯響應干旱脅迫相關的正向調節基因受到DNA去甲基化的正調控。

2.4 兩種處理下共同差異表達基因KEGG功能富集分析

為了進一步分析DNA甲基化參與調控馬鈴薯干旱脅迫響應的相關基因的生物學功能, 利用KEGG數據庫對2個馬鈴薯品種在甘露醇和DNA甲基化抑制劑處理下共同差異表達的基因進行通路分析發現, 1345個差異表達基因顯著富集到12個KEGG pathways (圖4-A), 其中與植物抗旱相關的通路有5個, 分別是植物MAPK信號通路(KO04016, 富集到DEG有11個)、谷胱甘肽代謝(KO00480, 富集到DEG有8個)、糖酵解/糖異生(KO00010, 富集到DEG有8個)、磷酸肌醇代謝(KO00562, 富集到DEG有5個)、植物激素信號轉導通路(KO04075, 富集到DEG有14個)。通過pathview繪制富集通路的基因在干旱和去甲基化處理下的表達模式和調控網絡發現, 大西洋和青薯9號在響應干旱處理和DNA去甲基化處理下, 谷胱甘肽代謝(圖4-B)和磷酸肌醇代謝(圖4-C)通路中差異基因多為上調表達基因, 且2種處理下各時間點表達趨勢類似。而MAPK信號(圖4-D)、糖酵解/糖異生代謝(圖4-E)和植物激素信號轉導(圖4-F)通路中差異基因多為下調表達基因。這些基因的功能注釋信息如表4所示。

2.5 兩種處理下共同差異表達基因啟動子分析

對KEGG富集到與植物抗旱相關的5個通路中的39個基因, 進行啟動子區CpG島預測和順式作用元件分析。首先, 從馬鈴薯基因組序列中提取39個基因1500 bp的啟動子序列。使用在線軟件MethPrimer預測這些基因的啟動子區域的CpG島發現, 只有1個與植物谷胱甘肽代謝通路相關的基因 ()含有CpG島, 位于該基因啟動子序列的-736~-866之間, 大小為131 bp (圖5)。同時, 使用在線數據庫Plant Care對該基因啟動子序列進行順式作用元件分析發現, 在基因的CpG島區域有ABRE、CAAT-box、A-box元件, 其中ABRE和CAAT-box與植物響應干旱脅迫相關。表明, 馬鈴薯在響應干旱脅迫時, 谷胱甘肽轉移酶基因啟動子區的ABRE和CAAT-box作用元件通過DNA去甲基化激活該基因的表達以應對逆境脅迫。

2.6 qRT-PCR驗證

從KEGG顯著富集到的5條干旱相關通路的基因中隨機挑選22個基因進行實時熒光定量PCR驗證。利用反轉錄cDNA試劑盒將轉錄組測序時保存的RNA樣品進行反轉錄, 使用qRT-PCR檢測這些基因在不同處理下在大西洋和青薯9號中的相對表達量。結果表明, qRT-PCR結果和轉錄組測序結果變化趨勢基本一致(圖6)。說明轉錄組測序數據的可靠性, 并進一步驗證了這些基因對干旱和DNA甲基化抑制劑的響應。

3 討論

植物對干旱脅迫反應的分子機制包括轉錄前表觀遺傳調控和轉錄后激素、轉錄因子、脅迫反應基因等信號分子的參與。研究發現, 植物通過基因組DNA甲基化和去甲基化的動態變化來迅速適應外部干旱環境, 表明DNA甲基化調控在植物響應干旱脅迫中起重要作用[21]。本研究利用甘露醇和DNA甲基化抑制劑分別處理2種耐旱性不同的馬鈴薯試管苗, 通過比較RNA-seq分析2個品種轉錄本在相同處理和不同處理下5個時間點的基因表達變化, 在分子水平探究DNA甲基化如何參與調控馬鈴薯對干旱脅迫的響應。

植物通過升高或降低DNA在特定位點發生特定類型的甲基化水平, 來打開或關閉一系列與逆境響應相關的基因, 進而啟動脅迫應答通路, 提高響應逆境相關酶活性, 從而防御逆境脅迫對植物功能基因表達造成的影響, 保護植物自身的生長發育[15]。植物對干旱脅迫的耐受性是由復雜的多組分信號通路觸發, 以恢復細胞動態平衡并促進植物生存[22]。信號轉導的一般途徑包括由應激特異性受體(如G蛋白偶聯受體、蛋白激酶受體或磷酸肌醇)檢測和接受信號, 然后由第二信使擴增信號, 導致參與調控響應干旱脅迫功能基因的激活或表達調節蛋白活性的激活與抑制[23]。Molina等[24]對鷹嘴豆根部在干旱處理下的轉錄組測序結果發現, 蛋白激酶基因和Ca2+應答基因在感知水分脅迫信號中發揮重要作用。本研究也發現, 馬鈴薯在干旱脅迫下, 蛋白激酶 ()、Ca2+結合蛋白(和)、肌醇加氧酶 (和)相關基因響應了干旱脅迫, 同時這些基因也響應了DNA去甲基化處理, 且2種處理下的表達模式基本一致, 說明馬鈴薯在響應干旱脅迫時蛋白激酶、Ca2+結合蛋白、肌醇加氧酶相關基因的表達受到DNA甲基化的調控。

植物激素是一類小的內源性信號分子, 如生長素(IAA)、赤霉素(GA)、細胞分裂素(CK)、脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)。植物激素是一種介質, 不僅作用于內源性發育過程, 而且還向多種激素反應途徑提供環境刺激, 以適應不利條件[25-26]。Jain和Khurana[27]發現, 水稻生長素反應相關基因在生殖發育和非生物脅迫過程中受到不同程度的調控。本研究也得到了類似的結果, 在“植物激素信號轉導”中富集到14個基因, 其中5個是生長素信號轉導基因, 編碼“生長素響應蛋白”和“GH3生長素響應基因”。因此, 我們推測生長素可能在馬鈴薯響應干旱脅迫中起重要作用。本研究還鑒定到與ABA、ET和SA調控相關的基因。共有9個差異表達基因, 分別編碼ERF2轉錄因子(PGSC0003 DMG400026261)、PR1蛋白(PGSC0003DMG40000 5108、PGSC0003DMG400005112、PGSC0003DMG 400005116和PGSC0003DMG400005110)和熱休克蛋白(PGSC0003DMG400023921); 同時PR1蛋白和熱休克蛋白也被富集到植物MAPK信號轉導通路。這些基因在2種處理下的表達模式基本一致, 這是因為在馬鈴薯響應干旱脅迫時, DNA甲基化參與了這些基因的表達調控。此外, 本研究還發現了參與植物糖酵解和糖異生途徑的相關基因, 如磷酸甘油酸變位酶()、丙酮酸脫羧酶()、己糖激酶(), 在馬鈴薯響應干旱脅迫時受DNA甲基化的調控。

表4 共同富集KEGG與干旱相關通路基因功能注釋

(續表4)

植物谷胱甘肽代謝中有3種重要的酶, 分別是谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GP)和谷胱甘肽S轉移酶(GST)。這3種酶活性的變化與植物應對逆境脅迫密切相關[28]。其中GST是在動植物中編碼的多功能蛋白的一個基因家族。同時GST也在參與干旱、鹽、重金屬等氧化應激的反應中發揮重要功能。過量的ROS誘導GST水平升高, 使得GST對外源物質的解毒和應激代謝中發揮關鍵作用[29]。Xu等[30]獲得了高表達番茄谷胱甘肽S-轉移酶的轉基因擬南芥, 命名為, 該轉基因擬南芥具有較強的耐鹽性和抗旱性, 同時也發現轉基因植株中脯氨酸、丙二醛含量以及抗氧化酶活性的變化與植物抗逆性相關。與野生型相比, 干旱處理過的擬南芥,啟動子區重復序列的DNA甲基化水平顯著降低, 同時基因表達水平顯著升高[31]。本研究也得到類似結果, 對抗旱性不同的馬鈴薯品種共同響應干旱和DNA去甲基化處理下的差異表達基因進行功能富集, 結果顯示, 有8個DEG顯著富集到植物谷胱甘肽代謝通路, 其中有6個屬于谷胱甘肽S轉移酶基因。同時差異基因啟動子區分析表明, 在谷胱甘肽S轉移酶基因()的CpG島區域有與植物響應干旱脅迫相關的ABRE和CAAT-box作用元件。推測馬鈴薯在響應干旱脅迫時, 可能通過DNA去甲基化來降低該基因啟動子區的ABRE和CAAT-box作用元件的甲基化水平, 進而激活該基因的表達以應對干旱脅迫(圖7)。

以上結果表明, 利用比較轉錄學分析干旱和DNA去甲基化處理下差異表達基因, 可挖掘到通過DNA甲基化參與調控馬鈴薯響應干旱脅迫的相關基因, 為研究馬鈴薯干旱脅迫響應的表觀遺傳學機理提供新的研究思路。同時, 本研究中有關DNA甲基化具體調控馬鈴薯響應干旱脅迫的機制尚不清楚,后續研究可通過檢測差異表達基因啟動子區DNA甲基化水平來進一步解析其蘊含的生物學意義。

4 結論

本研究對甘露醇和5-azadC處理下抗旱性不同的2個馬鈴薯品種進行比較轉錄組分析發現, 1345個DEG既響應干旱又響應DNA去甲基化。這些基因功能富集結果顯示, 與植物抗旱相關的通路有植物MAPK信號通路、谷胱甘肽代謝、糖酵解/糖異生、磷酸肌醇代謝和植物激素信號轉導通路。差異基因啟動子分析表明, 干旱脅迫下GST基因通過DNA去甲基化來降低啟動子區ABRE和CAAT-box作用元件的甲基化水平, 進而激活該基因的表達以應對干旱脅迫。本研究結果將為進一步解析馬鈴薯響應干旱脅迫的表觀遺傳學調控機理提供理論依據。

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Key genes mining of DNA methylation involved in regulating drought stress response in potato

LI Peng-Cheng1,2,**, BI Zhen-Zhen1,2,**, SUN Chao1,2, QIN Tian-Yuan1,2, LIANG Wen-Jun1,2, WANG Yi-Hao1,2, XU De-Rong1,2, LIU Yu-Hui1,2, ZHANG Jun-Lian1,2, and BAI Jiang-Ping1,2,*

1Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science / Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070, Gansu, China;2College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China

When plants are subjected to water stress, they will make a rapid response to drought stress through DNA methylation. In order to study how DNA methylation affects the transcriptional expression of genes under drought stress in potato, comparative transcriptomic analysis was carried out on two potato varieties with different drought resistances, which were planted under mannitol simulated drought and 5-azadC treatments. The differentially expressed genes (DEGs) were identified by Fold-change > 2 and corrected< 0.01. Then DEGs were subjected to GO enrichment analysis. The results showed that these DEGs were enriched in the oxidative stress and carbohydrate metabolism, suggesting these GO term-related genes were also regulated by DNA demethylation, responded to drought stress in different drought-tolerant potatoes. The common 1345 DEGs both responding to drought stress and DNA demethylation were functionally enriched by KEGG pathway. The results showed that plant MAPK signal pathway, plant hormone signal transduction pathway, plant glutathione metabolism pathway, glycolysis and glutathione metabolism pathway and inositol phosphate metabolism pathway were related to plant drought resistance. It was suggested that the sensitivity of these pathway-related genes responding to drought stress were regulated by DNA methylation in Atlantic and Qingshu 9. The cis-acting elements and methylated CpG islands were analyzed in the 1500 bp promoter region of DEGs. The results showed that the methylation level of ABRE and CAAT-box acting elements in the promoter region of GST gene involved in plant glutathione metabolism were reduced through DNA demethylation under drought stress. Then the expression was activated in response to drought stress. Therefore, DEGs under drought and DNA demethylation treatments could be analyzed using comparative transcriptomic, and then the genes related to DNA methylation involved in regulating drought stress response in potato could be found. These results provide a new idea for further studying the epigenetic mechanism of drought stress response in potato.

potato; drought stress; DNA methylation; transcriptome; glutathione S transferase

10.3724/SP.J.1006.2021.04152

本研究由國家自然科學基金項目(31660432, 31960442), 國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-09-P14), 甘肅省馬鈴薯產業體系(GARS-03-P1), 甘肅農業大學引進人才專項科研項目(2017RCZX-01)和甘肅省科技廳項目(18JR3RA170)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31660432, 31960442), the China Agriculture Research System (CARS-09-P14), the Gansu Potato Industry System (GARS-03-P1), the Gansu Agricultural University Special Talent Research Project (2017RCZX-01), and the Gansu Science and Technology Fund (18JR3RA170).

白江平, E-mail:baijp@gsau.edu.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

李鵬程, E-mail: 526040572@qq.com; 畢真真, E-mail: bizhen925@sina.com

2020-07-11;

2020-10-14;

2020-11-06.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201105.1124.004.html