多囊卵巢綜合征與THADA基因多態性研究

帕孜力亞·牙生 姚 華 占 瓊 趙 靜

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種高度流行的內分泌疾病和婦科疾病，伴有月經不規律、不孕、肥胖、多毛、痤瘡和血生化水平異常等癥狀[1～3]。據統計，全球18～44歲的女性PCOS的發生率為5%～20%，且呈逐年上升趨勢[4，5]。許多研究表明遺傳因素與PCOS的病因有密切關系，經過2期PCOS的全基因組相關性研究(genome-wide association studies，GWAS)發現了11個PCOS的易感位點與17個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)[6]，其中包括甲狀腺腺瘤相關蛋白THADA基因。

甲狀腺激素主要參與能量代謝，若甲狀腺功能障礙會干擾能量代謝[7]。THADA編碼在腎上腺髓質、腎上腺皮質、甲狀腺、胰腺、睪丸、胸腺、小腸和胃中表達的甲狀腺腺瘤相關蛋白，與能量代謝紊亂有關。研究表明，THADA基因可能通過減少能量產生并增加肥胖易感性影響PCOS的風險[7,8]。但是，確切病因仍未完全闡明。因此本研究旨在分析可能與PCOS發生相關的THADA基因多態性，為PCOS的診斷和病因學研究提供依據，為制定預防PCOS的措施奠定基礎。

材料與方法

1.研究對象：經筆者醫院醫學倫理學委員會審核通過后，收集2018年4月～2019年10月在新疆醫科大學第一附屬醫院婦科門診做備孕檢查的健康備孕女性166例和同期同院生殖助孕中心的PCOS確診患者166例臨床資料及全血標本，用iMLDR技術檢測THADA基因多態性。兩組女性年齡控制在20～35歲且均已簽署知情同意書，并排除合并糖尿病等內分泌疾病、其他婦科疾病、合并感染者。

2.研究方法：主要包括以下兩方面：(1)通過病歷查閱的方式收集兩組女性實驗室檢測指標：抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estrodiol，E2)、空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)。(2)兩組女性在靜息空腹狀態下自前臂肘正中靜脈取4ml血，用全血基因組DNA快速提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，離心柱型]提取DNA并用超微量分光光度計進行定量，檢測DNA濃度。根據相關文獻以及利用國際HapMap數據庫中的中國人群基因組SNPs基因型信息(CHB)，挑選與PCOS相關的THADA基因3個位點，分別為rs12468394、rs13429458和rs7563201。根據目標位點設計引物(上海生工生物工程有限公司提供，表1)，進行多重PCR反應。采用改良多重高溫連接酶反應(improve multiplex ligasedetection reaction，iMLDR)技術測定基因型。

表1 PCR引物序列

3.統計學方法：采用SPSS 22.0統計學軟件和SHEsis軟件對數據進行統計分析，所有研究對象進行基因位點的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。PCOS組和對照組基因型和等位基因頻率的變量組間比較采用χ2檢驗，通過Logistic回歸衡量兩組基因組分布及等位基因頻率的關聯強度。隨后用單因素方差分析去比較所研究的PCOS相關臨床指標與相關基因位點的多種基因型。

結 果

1.THADA基因位點的Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗：經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗顯示，THADA基因的基因型頻率分布均符合平衡定律 (P均>0.05)，而且，所選位點遺傳標記在人群中的最小等位基因頻率(MAF)≥5%，由此提示，本次研究樣本來自一個穩定的群體，收集的樣本具有較好的代表性，詳見表2。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗

2.THADA基因各基因型和等位基因頻率的分布比較：分析PCOS組和對照組各位點的基因型及基因頻率的分布，對等位基因進行OR值和95%CI的計算，分析比較不同等位基因的分布與PCOS發生的關聯。THADA基因各位點的基因型和等位基因在兩組女性中差異無統計學意義(P>0.05)。對各位點的等位基因納入單因素Logistic回歸分析中，發現各位點OR值的95%CI均包含1，尚不能認為不同等位基因是PCOS的危險因素，詳見表3。

表3 PCOS組和對照組各位點基因型及等位基因頻率分布的結果[n(%)]

3.THADA基因在不同遺傳模型中基因突變與PCOS易感性分析：進一步構建模型分析THADA基因多態性與PCOS易感性進行關聯分析，THADA基因3個位點在不同模型下兩組間比較，差異無統計學意義，詳見表4。

4.3個基因位點多態性與臨床指標之間的聯系：對兩組女性進行THADA基因各位點與臨床指標之間的關聯性分析，發現PCOS組中E2在rs12468394位點CC、AC、AA 3個基因型間比較差異有統計學意義(P<0.05)。對照組中E2在THADA基因rs13429458位點AA、CA、CC 3個基因型間比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表5～表7。

5.3個基因位點的連鎖不平衡分析：采用SHEsis軟件分析THADA基因3個位點的連鎖不平衡，按規定，當D′>0.8和r2>0.33時代表所分析的兩位點連鎖不平衡，D′值和r2值越接近于1，說明其連鎖越明顯[9]。檢驗結果如表8和圖1所示，THADA基因rs12468394位點與rs13429458位點、rs12468394位點與rs7563201位點、rs13429458位點與rs7563201位點間均具有較強的連鎖不平衡(D′≥0.85)。基于上述構建單倍體型滿足單倍體型頻率>0.03的條件時THADA基因Block 可形成3種單倍型。經分析，THADA基因的各單倍體型與PCOS發生風險未觀察到明顯統計學關聯(P>0.05，95%CI包含1)，詳見表9。

討 論

PCOS是臨床上常見的婦科及內分泌科疾病，近年來，雖然大量PCOS相關研究對于PCOS的診治工作做出了重大貢獻，但PCOS的發生率在世界范圍內仍呈現逐年上升的趨勢，其中各國報道的育齡期女性PCOS發生率為5%～20%[2]。我國育齡期女性PCOS發生率為5.6%[10]。因此，PCOS的研究依然是內分泌及婦科學術界的熱點。目前關于PCOS的發生機制尚未完全闡明，大量研究資料顯示，PCOS的發生是多種因素綜合作用的結果，包括環境因素以及遺傳因素，遺傳因素是多因素變異累積的過程，涉及多種基因異常[11～13]。

THADA基因，也稱甲狀腺腺瘤相關蛋白，位于2號染色體短臂2p21，首次發現于甲狀腺瘤。THADA的遺傳變異可能改變能量消耗并導致體重增加，肥胖會增加胰島素抵抗。因此，THADA基因變異可能通過胰島素抵抗增加PCOS風險[6]。Ⅱ期GWAS研究結果顯示THADA基因rs12468394、rs13429458、rs12478601與漢族女性PCOS發病有關[14]。隨后一項家系研究進一步證實了rs13429458與PCOS的關系[15]。國外一項針對歐美人的研究中rs12468394也得到了驗證，但提示rs13429458、rs12478601并無關聯。Louwers等[16]進行的Meta分析顯示，rs12468394、rs12478601位點與PCOS易感性有一定的關系，rs13429458與之無關。由于眾多研究結果不一致，因此本研究也分析THADA基因rs12468394、rs13429458及rs7563201位點，但以上3個位點在PCOS和對照組女性中比較,差異無統計學意義(P>0.05)。對其進行進一步的分析，在3種模型下分析其與PCOS的關聯性，仍未發現SNP位點的顯著差異性，因此未得出THADA基因多態性是PCOS的危險因素或保護因素的結論。得出上述結論的可能原因是這些位點與PCOS發生風險存在微效作用，而本次研究由于樣本數量不夠多，導致其檢驗效能不夠強；但也有可能是這些位點的確與PCOS發生不相關。

表4 不同模型中PCOS組與對照組各基因多態性的關聯性分析[n(%)]

表5 THADA基因rs12468394位點各基因型與PCOS相關因素分析[M(Q1，Q3)]

表6 THADA基因rs13429548位點各基因型與PCOS相關因素分析[M(Q1，Q3)]

表7 THADA基因rs7563201位點各基因型與PCOS相關因素分析[M(Q1，Q3)]

表8 PCOS組和對照組THADA基因多態性 位點連鎖不平衡檢驗

圖1 THADA基因多態性各位點連鎖不平衡檢驗 左側為D′檢驗，右側為r2檢驗

表9 THADA基因構建的單倍體型在PCOS組和對照組中的分布[n(%)]

既往基因型-表型研究表明，THADA基因與脂代謝和LH、T分泌關系密切， 對PCOS臨床特點的改變有一定的影響，且與卵巢多囊改變的表型有關[17]。故本研究進一步在THADA基因rs12468394、rs13429458、rs7563201這3個位點的不同基因型下分析兩組女性臨床檢測指標的差異，在PCOS組中rs12468394位點雜合子突變CA型的E2水平低于野生型純合子CC型，且差異均有統計學意義(P<0.05)，而對照組中剛好相反。分析其原因可能是該位點突變有可能會影響下丘腦-垂體-卵巢軸調節功能，使E2水平降低，但具體機制還需要進一步分析。

本研究也具有一定的局限性，本研究為單中心研究，且樣本例數偏少，可能出現患者的選擇偏倚，而且在分析相關基因型與疾病關聯時出現個別基因型未檢測的現象，導致這種現象的原因可能是樣本量不足所引起的偏倚。因此筆者將在后續入選病例中，完善實驗設計，補充樣本量，對PCOS相關因素及機制進行更全面、深入的研究。