子癇前期孕婦血清維生素D水平與維生素D受體基因多態性的相關性

李祥雯 李 晶 朱啟英

子癇前期(preeclampsia, PE)是特發于人類的以孕期血壓升高、并導致一系列母胎并發癥為特征的妊娠期特有疾病。在全球范圍內的發生率約占孕婦總數的5%～10%[1]。在我國，隨著二胎政策的全面放開，PE的發生率也逐漸升高。PE的發生、發展涉及多種因素，近年來流行病學研究及臨床研究均提示孕期血清維生素D(vitamin D，VD)水平低下是PE的相關因素[2～4]。VD受體(VDR)是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族的成員，人類幾乎所有的組織和細胞中都發現存在 VDR，強調VDR可廣泛調節全身組織和細胞的功能[5]。VDR由一個巨大的基因(> 100kb)編碼，每一種基因變體如果出現在至少1%的人群中，就稱為多態性[6]。VDR基因具有4個精確描述的雙等位基因多態性，即BsmI (A>G)、ApaI (A>C)、FokI (C>T)和TaqI (T>C)。VDR等位基因變異和受體的不同表達在許多健康問題中起著關鍵作用，如乳腺癌或自身免疫性疾病[7,8]。但VDR及其等位基因變異，特別是不同維生素D水平下在子癇前期發生上的作用尚未明確。為此筆者醫院進行了一項對照研究，報告如下。

資料與方法

1.臨床資料：納入標準：①孕周20～28周；②均規律產檢；③均符合中華醫學會婦產科學分會妊娠期高血壓疾病學組制定的《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》中關于子癇前期的診斷標準[9]；④臨床資料完整；⑤均為單胎妊娠。排除標準：①存在器質性疾病、免疫系統疾病、血液病等基礎疾病者；②多胎妊娠；③妊娠期甲狀腺功能減退或甲狀腺功能亢進者；④合并慢性高血壓、心臟病、腎病、糖尿病及肝病病史，輸血、免疫治療史的孕婦。共納入2018年2月～2019年4月新疆醫科大學第一附屬醫院收治的子癇前期孕婦100例，設為PE組；另選取同期健康規律產檢孕婦100例，設為對照組。

2.收集指標：通過病歷回顧孕早期兩組孕婦的基本臨床資料，包括年齡、孕周、BMI、收縮壓、舒張壓，肝功能指標[谷草轉氨酶(ALT)、谷丙轉氨酶(AST)、直接膽紅素(Db)、間接膽紅素(Tb)、白蛋白(Alb)]、血清甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)及1,25(OH)2D3、鈣離子水平。

3.VDR基因多態性檢測：采集所有受試者的外周血5ml，采用Bioteke DNA提取試劑盒[中國江蘇無錫百泰克生物技術有限公司，批準文號：滬食藥監械(準)字2014第1400585號]提取DNA，分光光度儀測定DNA的濃度及純度，并置于-20℃冰箱中保存備用。維生素D受體基因BsmI、FokI、TaqI、ApaI的單核苷酸多態性采用 TaqMan 系統和 ABI7900HT RT-PCR 儀器(美國Life Technologies公司)進行測量。采用Apaman探針實時熒光PCR技術檢4個位點的基因型，引物由美國Applied Bio 生物科技公司設計研發，Apa位點的上游引物序列為5′-ACCCATAATAAGAAATAGTTTTA-3′，下游引物序列為5′-TGTGACCTAGTTTAC-3′；FokI位點的上游引物序列為5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3′，下游引物序列為5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′。TaqI位點的上游引物序列為5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3′，下游引物序列為5′-GGATGTACGTCTGCAGTGTG-3′；BmsI位點的上游引物序列為5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCATGA-3′，下游引物序列為5′-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3′。PCR采用25μl反應體系，擴增條件為95℃預變性3min，95℃15s，60℃1min，共45個循環，擴增結束后采用Bio-Rad C FX manager 3.0 軟件進行基因型分析。

結 果

1.PE和對照組孕婦一般資料比較：PE組孕婦血清1,25(OH)2D3、血鈣及白蛋白水平低于對照組，甘油三酯水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組孕婦一般資料比較

2.兩組孕婦VDR基因多態性比較:兩組孕婦VDR基因4個位點的基因型、等位基因頻率比較,差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 兩組孕婦VDR基因多態性比較

3.兩組中低1,25(OH)2D3水平的孕婦間VDR基因多態性比較：PE組VDR基因位點中BsmI GG基因型、G等位基因頻率及ForI CC基因型、C等位基因頻率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 兩組低1,25(OH)2D3水平的孕婦間VDR基因多態性比較

3.兩組正常1,25(OH)2D3水平的孕婦間VDR基因多態性比較:PE組與對照組各VDR基因位點的基因型及等位基因頻率情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表4。

表4 兩組正常1,25(OH)2D3水平的孕婦間VDR基因多態性比較

討 論

PE通常表現為孕20周以后出現的血壓升高，但研究顯示，PE的發生起始基礎是早孕期胚胎著床和胎盤形成不良，引起胎盤局部缺血缺氧、炎癥和免疫調控網絡失衡，釋放各種因子，引起全身小血管痙攣[10]。多項研究顯示,孕期血清維生素水平低下是PE的高危因素，孕早期維生素D缺乏可增加早發型PE的發病風險。臨床研究顯示，約40%～62%的女性在孕早期血清內存在維生素D缺乏，這就可能增加PE的發生風險[11]。維生素D能夠廣泛調節全身組織和細胞功能，除了直接調節鈣磷骨代謝外，對于免疫系統、心血管系統也具有一定的作用。維生素D參與上述調節需要細胞膜上的VDR參與，VDR廣泛存在于全身各組織細胞中，妊娠期子宮內膜基質細胞和妊娠早期蛻膜細胞等多種生物組織細胞中均有VDR的表達。還有研究表明，VDR及VDR信號途徑在胎盤中具有重要作用，子癇前期患者胎盤組織中VDR表達水平低可能與子癇前期發生有關[12]。VDR調節異常可能是低水平1,25(OH)2D3參與PE形成的關鍵原因，也是機制研究的一個切入點；但目前國內外尚未見有1,25(OH)2D3降低PE發生的機制研究。維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)是由VDR基因編碼，VDR基因位于12號染色體長臂1區3帶，全長75kb，由9個外顯子和8個內含子組成，包含有多個單核苷酸多態性位點， VDR基因多態性是指每種基因多態性位點出現在至少1%的人群中就稱為該基因的多態性[13]。常見的VDR多態性位點為rsl544410、rs7975232、rs731236以及rs2228570雙等位基因位點，而這些等位基因的變異進而導致其受體呈現不同表達，對于許多疾病的發展起著重要作用，但在妊娠期的作用特別是對于子癇前期發生風險的機制尚不明確[14]。

本研究的維生素D水平與國內其他學者研究的新疆地區的維生素D水平相類似，均低于中東部地區人群[15]。另外VDR受體多態性也與國內關于新疆地區人群中VDR的研究類似[16]。新疆地區孕婦的子癇前期發生率也高于中東部地區，可能與人種和新疆地區居民的飲食結構有關[17]。

在本研究中，PE組孕婦血清1,25(OH)2D3、血鈣及白蛋白水平低于對照組，甘油三酯水平高于對照組，分析認為，子癇前期孕婦體內存在多種物質代謝紊亂，特別是脂代謝紊亂和胰島素代謝異常，國外文獻也報道了相同的結論[18]。維生素D在體內的活性形式為1,25(OH)2D3，通過與VDR結合發揮生物學效應，包括調節鈣磷骨代謝和相關蛋白的合成等。國內有研究者利用前瞻性隊列分析顯示，超過2/3的重度子癇前期患者處于維生素D缺乏或不足的狀況，其血清1,25(OH)2D3水平于妊娠第6～10周就明顯低于正常妊娠者[19]。在妊娠期VD通過與VDR結合參與胚胎著床、調節妊娠相關蛋白合成、調節細胞因子的合成及鈣的輸送，對于維持正常妊娠和胎兒生長發育發揮著重要作用。

進一步分析VDR基因的多態性，25(OH)2D3水平低的PE組VDR基因位點中BsmI GG基因型、G等位基因頻率及ForI CC基因型、C等位基因頻率高于對照組；但1,25(OH)2D3水平正常的PE組和對照組之間各基因位點差異無統計學意義，這提示VDR基因多態性影響血清維生素D水平的高低，也影響PE的發病風險。分析上述現象，VDR基因多態性可能會影響VDR基因的表達和功能，并可能影響1,25(OH)2D3與VDR的結合。有研究指出，BsmI位點的多態性會影響鈣的吸收及VDR在小腸上皮細胞的表達，進一步影響VD的吸收[20]。

正常水平的血清維生素D可以通過抑制RAS來預防高血壓。同樣，維生素D可以通過抑制血管平滑肌細胞增殖來影響血壓，維生素D含量過低可能會增強腎素分泌，與血管平滑肌細胞增殖有關的機制可能是子癇前期的發病一個潛在因素。已發現FokI和BsmI的常見VDR多態性與妊娠外高血壓風險之間有很強的聯系，另外，有關于克羅恩病和VDR基因多態性關系的研究發現，ForI位點的基因突變能夠影響克羅恩病的嚴重程度，VD與相應的受體結合增強了局部的炎性反應有關[21]。而1,25(OH)2D3低下的PE患者ForI位點CC基因型、C等位基因頻率較高，這些突變基因型的VDR受體在于VD結合后有可能增加胎盤及子宮內血管壁的炎癥，增加了PE的發病風險。

綜上所述，子癇前期孕婦體內1,25(OH)2D3水平較低，這種低水平的狀態可能與維生素D受體基因位點BsmI和ForI多態性有關；低1,25(OH)2D3水平且BsmI位點GG基因型及ForI位點CC基因型比例較高的孕婦易發生子癇前期。