藏紅花素通過調控PI3K/Akt信號通路抑制成骨細胞凋亡引起的骨質疏松

何 艷 布海切木·卡德爾 周曉珊 馬彩玲 楊振華

骨質疏松癥是一種全身性的骨代謝疾病，其特點是骨量減少、骨密度降低、骨組織微結構退化[1]。由于其患者在臨床上發病緩慢且沒有特定癥狀，因此被多數人忽視，特別是女性在絕經后因缺乏雌激素導致的骨質疏松[2]。然而，藥物治療有一定局限性[3]。因此，尋找有效的預防措施和治療藥物是非常必要的。

藏紅花是一種中草藥植物，可作為香料和食品著色劑使用，也可用于中醫治療和作為鎮靜劑、祛痰藥和催吐藥[4]。藏紅花素是藏紅花的一種成分[5]。藏紅花素的藥理作用已被證實，包括抗腫瘤、抗炎癥、抗焦慮等方面[6～8]。近年來研究發現，藏紅花素對骨疾病如骨肉瘤、關節軟骨退變有保護作用[9]。但藏紅花素對骨質疏松癥的報道鮮少，且其具體的分子機制也不明確。本研究探討了藏紅花素對去卵巢骨質疏松小鼠和成骨細胞凋亡的影響及其分子機制，為臨床治療骨質疏松癥提供可能的治療靶點。

材料與方法

1.材料：40只8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠(體質量21～24g)；藏紅花素(美國Sigma-Aldrich公司)；雌激素(華北制藥股份有限公司)；LY294002(PI3K/Akt信號通路抑制劑)和OC、ALP檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗體(美國CST公司)；β-actin抗體(上海相比生物公司)；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素(美國Sigma公司)；堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(上海古朵生物科技有限公司)；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。

2.骨質疏松模型建立及給藥：小鼠隨機分為4組(n=10)，包括假手術組、模型組、雌激素組和藏紅花素組。參考Morris等[10]的研究，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，接受雙側開腹手術(假手術組)或雙側卵巢切除手術(模型組)。術后恢復4周，對造模成功的兩組小鼠每天分別進行雌激素(25μg/kg)和藏紅花素(20mg/kg)灌胃治療，對假手術組和另一模型組進行等量蒸餾水灌胃，連續灌胃12周[11]。實驗期間，每隔兩周，對小鼠稱重1次。

3.小鼠樣本收集：在小鼠末次給藥后，禁食24h，收集小鼠尿液，用2ml(1mol/L)的鹽酸酸化。腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，取眼球放血，1500×g離心10min提取血清。處死小鼠取左右腿股骨，浸泡在10%甲醛內，-20℃保存。

4.子宮指數：子宮指數=子宮質量(mg)/小鼠體質量(g)

5.骨密度檢測：采用雙能X線骨密度分析儀掃描和測量骨密度。測量結果以每平方厘米表面積的礦物含量克表示。

6.HE染色觀察股骨組織病理學形態：將小鼠股骨脫鈣處理1周，石蠟包埋和切片(5μm厚)。再依次進行二甲苯脫蠟、乙醇脫色、蘇木精染色、分化、洗滌、伊紅染色。最后在顯微鏡下觀察。

7.骨代謝生化指標檢測：利用全自動生化分析儀檢測小鼠血清和尿液中Ca、P以及尿液中Cr含量，利用OC、ALP的ELISA試劑盒檢測小鼠血清中OC、ALP水平。所有步驟均按照ELISA試劑盒說明書進行(n=3)。

8.Western blot法檢測骨組織p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達：根據Schreiweis等[12]描述的方法提取骨蛋白。將裂解液離心、定量，經SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，5%牛奶室溫封閉1h，將PVDF膜孵育在p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、β-actin一抗孵育液中4℃過夜；再與相應二抗室溫孵育1h，再用磷酸緩沖液(PBS)洗滌。最后用ECL顯影。

9.小鼠成骨細胞的原代培養及鑒定：采用胰蛋白酶-膠原酶消化法和組織培養法提取原代成骨細胞。取小鼠脛骨并去骨膜，用PBS沖洗直到呈白色或透明。用眼剪將脛骨剪成約11mm的碎片。用0.25%胰酶消化變白，再于37℃、200r/min離心60min。離心得到白色沉淀，收集上清，用含10%FBS的低糖DMEM培養基培養在細胞瓶。每隔10min轉移至新細胞瓶培養，重復兩次，得到高純度的成骨細胞懸液。選擇第4代成骨細胞進行ALP染色鑒定及實驗，ALP染色按試劑盒說明書進行。

10.成骨細胞分組與處理：將成骨細胞分為假手術組、模型組、藏紅花素組、LY249002組、藏紅花素+LY249002組。前兩組可直接從小鼠提取，藏紅花素組是在模型組中加4mmol/L藏紅花素，LY249002組是在模型組細胞中加5μmol/L的LY249002，藏紅花素+LY249002組是在模型組細胞中加了4mmol/L的藏紅花素和5μmol/L的LY249002。

11.流式細胞術檢測各組成骨細胞凋亡：將成骨細胞接種于6孔板中，細胞密度為2×105個細胞/孔，培養24h，收集細胞。用含5μl Annexin Ⅴ-FITC和5μl碘化丙啶(PI，1μg/ml)的300μl結合緩沖液重懸細胞，PBS洗兩次，冰浴0.5h，再根據FACScan分析。

結 果

1.藏紅花素改善模型小鼠體質量變化：在灌胃給藥12周內，假手術組小鼠體質量增加緩慢，模型組小鼠體質量增長迅速(P=0.000)，與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組顯著抑制了小鼠體質量的增加(P<0.01，圖1)。

2.藏紅花素升高模型小鼠子宮指數：與假手術組比較，模型組小鼠子宮指數降低(P<0.01)。與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組增加了小鼠子宮指數(P<0.01，圖2)。

3.藏紅花素改善模型小鼠骨組織病理形態：雙能X線骨密度分析顯示，與假手術組比較，模型組小鼠骨小梁密度顯著降低，而與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組顯著提高了骨小梁密度(圖3A，P<0.05)。HE染色發現，假手術組骨小梁分布均勻，排列有序，骨小梁之間間隔小，模型組骨小梁分布稀疏，排列分散且有斷點，與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組都改善了骨質疏松小鼠骨小梁分布與排列(圖3B)。

4.藏紅花素抑制模型小鼠尿液中U-Ca/Cr、U-P/Cr升高：生化分析顯示，各組小鼠血清中S-Ca或S-P含量比較，差異無統計學意義(圖4A、B)；與假手術組比較，模型組小鼠尿液中U-Ca/Cr和U-P/Cr水平升高，分別為104.5%和36.9%，與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組均能抑制U-Ca/Cr和U-P/Cr水平升高(P<0.05，圖4C、D)。

5.藏紅花素增加模型小鼠血清中OC、ALP水平：ELISA結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠血清中OC、ALP水平升高，而與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組均顯現出降低了OC、ALP水平(P<0.05，圖5)。

圖3 各組小鼠骨密度和骨形態變化 A.骨密度檢測 ；B.HE染色(×200)；*P<0.05,**P<0.01

圖4 各組小鼠血清和尿液中Ca、P、Cr水平 *P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

圖5 各組小鼠血清中OC、ALP水平 *P<0.05,**P<0.01

6.藏紅花素調控PI3K/Akt信號通路：通過Western blot法檢測骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達。與假手術組比較，模型組小鼠骨組織中PI3K/Akt蛋白表達顯著下調，與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組均上調PI3K/Akt蛋白表達(P<0.05,圖6)。

圖6 藏紅花素調控PI3K/Akt信號通路 *P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

7.藏紅花素抑制成骨細胞凋亡：原代培養假手術組和模型組小鼠成骨細胞，經ALP染色鑒定為成骨細胞(P<0.01，圖7A、B)。再經Western blot法檢測p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達，發現蛋白表達在模型組中低于假手術組；藏紅花素組多于模型組，LY249002組與模型組比較差異無統計學意義；而與藏紅花素組比較，藏紅花素+LY249002組蛋白表達被抑制，說明LY249002成功抑制了PI3K/Akt信號通路(P<0.05，圖7C、D)。流式細胞術顯示，與假手術組比較，模型組成骨細胞凋亡顯著增多；與模型組比較，藏紅花素組抑制了成骨細胞凋亡，LY249002組與模型組比較差異無統計學意義；但與藏紅花素組比較，藏紅花素+LY249002組抵消了藏紅花素對成骨細胞凋亡的抑制作用(P=0.000，圖7E、F)。

討 論

骨質疏松癥是一種以骨量減少和骨組織微結構退化為特征的骨代謝疾病，常見于絕經后女性，由于雌激素分泌不足導致她們對骨質疏松癥的易感性明顯增加[1]。研究發現，骨質疏松癥抑制骨細胞分化和形成，降低骨質量和強度[11]。目前，骨質疏松癥正成為主要公共衛生威脅。因此，探索治療骨質疏松的有效藥物至關重要。

藏紅花是一種草本植物，具有很強的抗氧化性能[12]。藏紅花素是藏紅花顏色的主要化學成分，是西紅花中一類主要藥用成分，主要在治療阿爾茲海默病、腫瘤、炎癥等疾病有作用[4，6，7，13]。最新研究發現，藏紅花素可減輕代謝綜合征引起的大鼠骨質疏松癥，但其分子機制未有報道[14]。筆者研究發現，藏紅花素抑制去卵巢骨質疏松鼠體質量增加和骨密度降低，防止骨小梁微結構惡化。此外，還抑制了尿液中U-Ca/Cr、U-P/Cr和血清中OC、ALP水平的升高。OC和ALP都是骨代謝和骨形成的標志物，對成骨細胞凋亡有重要作用[15]。筆者還發現藏紅花素抑制成骨細胞凋亡，而成骨細胞凋亡是導致骨質疏松的部分原因。因此，藏紅花素可能通過抑制成骨細胞凋亡對去卵巢骨質疏松小鼠具有保護作用。

PI3K/Akt是參與調控細胞代謝、生長、增殖、死亡和存活的重要信號通路，也是干預多種疾病的前提[16]。此外，它還可影響骨形成和骨細胞存活，從而控制骨密度平衡[17]。筆者研究發現，PI3K/Akt信號通路在去卵巢骨質疏松小鼠中被抑制，而藏紅花素可調控PI3K/Akt信號通路中關鍵分子表達。同時在成骨細胞中加入藏紅花素抑制成骨細胞凋亡。而當在模型小鼠成骨細胞中加入藏紅花素和LY249002時，藏紅花素對成骨細胞凋亡的抑制作用則被抵消。因此，藏紅花素可能通過調控PI3K/Akt信號通路來抑制骨質疏松小鼠成骨細胞凋亡。

綜上所述，藏紅花素可通過調控PI3K/Akt信號通路抑制成骨細胞凋亡，進而對去卵巢誘發的骨質疏松癥具有保護作用。