抑制TLR4對急性呼吸窘迫綜合征小鼠的保護作用及機制研究

姜 蕓 郭 紅

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一種危及生命的呼吸系統疾病，是危重癥醫學中最具有挑戰性的臨床疾病之一。它是由創傷、炎癥、膿毒血癥等各種肺內、外致病因素所引發的急性呼吸衰竭[1]。ARDS引起的病死率高達40%～60%[2，3]。目前，ARDS發病機制尚不明確，但是已有研究表明，其病理過程與炎性反應密切相關，肺組織出現嚴重的炎性反應，TNF-α、IL-6等炎性因子大量釋放，并且伴隨炎性細胞在肺部的大量聚集而進一步加重肺組織損傷。已有研究表明，抑制炎性因子的釋放能夠有效緩解ARDS[4，5]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是一類與炎性反應密切相關的細胞膜受體，當其與LPS等配體結合后可激活下游NF-κB信號通路，進而促進炎性因子的釋放，TAK242作為TLR4抑制劑，能夠抑制TLR4的表達[6]。本研究通過使用TAK242抑制TLR4觀察對脂多糖(LPS)誘導的小鼠急性呼吸窘迫綜合征的影響及機制，旨在為ARDS臨床治療和研究提供幫助。

材料與方法

1.材料：6周齡雄性BALB/c小鼠45只，體質量20～25g,購自新疆醫科大學動物實驗中心，飼養及實驗取材過程中嚴格遵守實驗動物倫理保護等相關規定；LPS購自美國Sigma公司；TAK242購自美國MedChemExpress公司；TLR4、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、NF-κB一抗購自沈陽萬類生物科技有限公司；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自福麥斯生物技術有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自烏魯木齊熬銳東源生物科技有限公司；血氣分析儀ABL90購自丹麥Radiometer公司。

2.動物分組及造模：45只BALB/c小鼠隨機分為3組，分別為對照組、模型組(ARDS組)和TLR4抑制劑TAK242組(TAK242組)。ARDS組和TAK242組小鼠分別尾靜脈注射5ng/g的LPS誘導小鼠產生膿毒血癥，制備膿毒血癥性急性肺損傷模型，對照組小鼠注射等體積的0.9%氯化納注射液，TAK242組小鼠造模的同時給予5ng/g TAK242。

3.行動脈血氣分析：給藥治療結束后，各組小鼠麻醉成功后，暴露腹主動脈，用經肝素潤洗的1ml一次性注射器抽出動脈血約0.3ml，使用血氣分析儀行血氣分析，比較PaO2/FiO2。

4.ELISA檢測血清炎性因子TNF-α、IL-6水平：給藥結束后，各組小鼠麻醉后，開胸取腹主動脈300μl全血，室溫靜置4h后，3500r/min、4℃離心15min，分離上層血清，按照ELISA試劑盒檢測方法分別測定血清TNF-α、IL-6含量。

5.HE染色:實驗完成后，各組小鼠解剖取肺組織于組織固定液中固定，制作肺組織石蠟切片進行染色，于光學顯微鏡下觀察，并拍照記錄。

6.免疫組化:實驗結束后，各組小鼠解剖取肺組織于組織固定液中固定24h，石蠟包埋后制備石蠟切片，然后置于二甲苯中脫蠟，依次經乙醇和蒸餾水中復水；使用檸檬酸緩沖液進行抗原修復，經BSA封閉后一抗孵育過夜，清洗后二抗孵育，然后切片用蘇木精復染，使用中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察。應用IPP 圖像分析軟件測定小鼠肺組織各蛋白表達的平均吸光密度值來進行分析。

7.Western blot法檢測TLR4、NF-κB蛋白表達:取各組小鼠肺組織50mg，加入100ml RIPA蛋白裂解液，使用勻漿機于冰上勻漿，勻漿液 12000r/min離心15min，取上清即為組織總蛋白；BCA蛋白定量后樣品煮沸變性；然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的脫脂牛奶對PVDF膜封閉2h，然后以1∶1000比例稀釋后的TLR4、NF-κB一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應30s，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

結 果

1.各組小鼠行血氣分析檢測結果：與對照組比較，ARDS組小鼠PaO2/FiO2值顯著降低(452.00±9.54 vs 263.30±21.63,P<0.05)；與ARDS組比較，TAK242組小鼠PaO2/FiO2值顯著增加(263.30±21.63 vs 308.12±13.53,P<0.05)。

2.血清炎性因子TNF-α、IL-6水平：與對照組比較，ARDS組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與ARDS組比較，TAK242組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較

3.小鼠肺組織病變:HE染色檢測結果顯示，對照組小鼠肺組織肺泡結構完整，組織細胞排列整齊，沒有出現出血以及炎性細胞的浸潤，沒有病理損傷；ARDS組小鼠肺組織出現彌散性肺損傷，肺泡壁損傷嚴重，肺間質嚴重增寬，出現紅細胞露出，炎性細胞浸潤明顯，肺組織損傷嚴重，說明ARDS造模成功；TAK242組小鼠肺組織損傷程度較弱，肺泡結構相對完整，炎性浸潤較ARDS組顯著減少，提示TAK242能夠緩解ARDS小鼠肺組織損傷(圖1)。

4.免疫組化檢測各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6表達：ARDS組小鼠肺組織TNF-α、IL-6表達高于對照組，而TAK242組小鼠肺組織TNF-α、IL-6表達低于ARDS組(圖2，表2)。

5.Western blot法檢測各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達：與對照組比較，ARDS組小鼠肺組織TLR4、NF-κB表達水平均顯著升高(P<0.05)。與ARDS組比較，TAK242治療組小鼠TLR4、NF-κB表達水平均顯著下調(P<0.05,圖3)。

圖2 免疫組化檢測各組小鼠TNF-α、 IL-6表達結果(×200)

表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6表達的 平均光密度統計

圖3 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平 與對照組比較，*P<0.05；與ARDS組比較，#P<0.05

討 論

研究表明，ARDS的主要病理特征為肺組織中蛋白質類液體累積，炎性反應暴發浸潤肺部，威脅患者的生命[7]。現階段臨床常采用機械通氣治療以及非機械治療，但治療效果并不理想。因此，控制炎性反應、探究新型有效的抗炎治療藥物對于ARDS的臨床治療亦至關重要[8～10]。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR可以識別來源于微生物的具有保守結構的分子并激活機體產生免疫細胞應答，對病原微生物感染早期的特異性識別及介導炎性反應具有十分重要的意義[11,12]。

另一方面，LPS是由免疫活性宿主中的細菌所產生的，可以在體內外引起強烈的炎性級聯反應，并且在體內可誘發感染，進而引起肺組織嚴重的炎性反應[13]。TLR4可以通過識別宿主壞死細胞釋放的熱休克蛋白(heat-shock proteins，HSP)等促進內源性酶的級聯活化反應，激活下游NF-κB信號通路，促進TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、趨化因子、黏附分子、集落刺激因子等細胞因子的釋放，介導體內炎癥暴發[14]。本研究通過LPS誘導了小鼠急性呼吸窘迫綜合征模型，旨在探究TAK242作為TLR4的選擇性的信號轉導抑制劑對ARDS小鼠的治療作用及機制。結果表明， TAK242能夠顯著增加ARDS小鼠氧合指數，改善ARDS小鼠血氧水平，并且降低血清炎性因子TNF-α、IL-6水平，緩解體內炎性反應。病理切片檢測結果顯示，TAK242能夠顯著改善ARDS小鼠肺組織損傷，以及肺組織TNF-α、IL-6表達水平，并且抑制ARDS小鼠肺組織TLR4及NF-κB表達，說明TAK242抑制TLR4表達而抑制NF-κB信號通路進而緩解小鼠ARDS。

綜上所述，TAK242能夠通過阻斷TLR4抑制小鼠ARDS炎性因子表達，進而抑制下游NF-κB信號通路及炎性反應，發揮對ARDS小鼠的治療作用。