一株分離自水稻種子的真菌的鑒定及系統進化分析

李云飛 華陳意 宗凱 孫娟娟 盛旋 余曉峰 王滿滿 陳雨 姚劍

摘要：真菌病害是制約水稻高產穩產的重要障礙因素之一。為了研究水稻種子中真菌發生情況，對分離自水稻種子中的一株真菌進行系統發育分析及功能評價。在形態學鑒定基礎上，以通用引物ITS1/ ITS4對目標真菌序列進行PCR擴增、序列對比分析、鄰接法（NJ）構建系統發育樹。通過菌落培養特征、孢子形態特征觀察，分離菌株S-51的形態特征與文獻中雪霉葉枯病菌（Microdochium nivale）的描述極為相似；序列比對結果表明，目標真菌與雪霉葉枯病菌（M. nivale）相近，相似率為100%；系統發育樹顯示，其與雪霉葉枯病菌株在同一條分支上，雪霉葉枯病菌M. nivale和M. musae的親緣關系最近。利用ITS片段開展的序列分析和系統進化樹構建，結合形態特征，能夠確定分離自水稻種子中的S-51菌株為雪霉葉枯病菌（M. nivale）。

關鍵詞：水稻種子；雪霉葉枯病菌；ITS；分類地位；物種鑒定

中圖分類號：S412文獻標志碼：A論文編號：cjas20190500034

A Fungus from Rice： Species Identification and Phylogenetic Analysis Li Yunfei1， Hua Chenyi1， Zong Kai1， Sun Juanjuan1， Sheng Xuan1， Yu Xiaofeng1， Wang Manman1， Chen Yu2， Yao Jian1

（1Technical Center of Hefei Customs， Hefei 230022， Anhui， China； 2Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， Anhui， China）

Abstract： Fungal disease is one of the important obstacles for high and stable yield of rice. In order to study the occurrence of fungi in rice seeds， the phylogenetic analysis and functional evaluation of a fungus isolated from rice seeds were carried out. On the basis of morphological identification， the target fungal sequence was amplified by PCR with ITS1/ITS4， and the phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining （NJ） and analyzing the sequence. The morphological characteristics of strain S- 51 were very similar to those of Microdochium nivale in the literature， and the sequence alignment showed that the target fungi were similar to M. nivale， and the similarity rate was 100%. M. nivale and M. musae had the closest genetic relationship on the same branch as the strain of snow mold leaf blight. Sequence analysis and phylogenetic tree construction based on ITS fragments and combined with morphological characteristics could identify S-51 strain isolated from rice seeds as M. nivale.

Keywords： Rice Seed； Microdochium nivale； ITS； Taxonomic Status； Species Identification

0引言

水稻屬于禾本科（Gramineae）稻屬（Oyrzae），廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界一半以上的人口以稻米為主要糧食來源[1]。據統計，全世界有122個國家種植水稻，栽培面積在1.40億～1.57億hm2。中國水稻的種植面積約占全國耕地面積的1/4，年產量約占全國糧食總產量的一半。在水稻生產過程中，病害問題是制約水稻高產穩產的重要障礙因素之一，全世界水稻病害種類近百種，其中真菌病約50種[2-3]。水稻病害發生后防治與否，對產量損失影響極大，水稻病害經綜合防治后可挽回損失80%以上。不同病害的流行規律各不相同，防治方法亦不一樣，因此病原物的準確分類鑒定顯得尤為重要。

形態學分類法，是基于細胞形態、大小、菌落形態、培養基上的生長狀態等指標進行分類鑒定的一種方法[4]，各種生物的分類鑒定都是以形態特征為基礎發展起來的[5]。宋鎮慶等[6]根據形態特征對遼寧地區引起水稻苗綿腐病的真菌進行了分類鑒定。代麗婷[7]根據病菌形態特征對黑龍江省9個地區的冬小麥分離真菌進行了鑒定。賈菊生等[8]對分離于棉花、茄和蒼耳的6個菌株進行了形態學鑒定，確定其為大麗輪枝菌。但真菌形態特征復雜、種類繁多，缺乏統一標準的描述，主觀性較強，且形態特征指標易受多種因素的影響而不穩定[9-10]。另外，真菌形態學研究不能應用于人工培養的真菌中[11]。因此，形態學分類法只有結合分子生物學方法才能使分類鑒定效果更佳。胡渤洋等[12]對分離自楊柳科楊屬毛白楊的BUA-01菌株子實體形態特征進行了鑒定，同時基于ITS的系統發育樹對該菌株進行了分析，最終結合形態特征和ITS鑒定，確定BUA-01菌株為毛栓菌（Trametes hirsute）。張鉉哲等[13]從東北三省采集的26份水稻等谷物類樣品中分離獲得254株病原真菌，通過形態學方法鑒定，包括6種屬的病原菌，以分子生物學手段繼續進行了鑒定，保證了鑒定結果的準確性，分離獲得的病原菌分別為鐮孢菌屬、平臍蠕孢屬、根霉屬、曲霉屬、鏈格孢菌屬和枝孢屬。陳洪亮等[14]從大田感病水稻葉片上分離了病原真菌，隨后對病原菌的形態特征和分子生物學特征分別進行了研究，明確了該病原菌的分類地位，確定其為稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae）。

本研究先用傳統形態學方法對分離菌株進行分類研究，再對ITS基因進行擴增和序列測定，利用鄰接法neighbor-joining （NJ）進行系統發育樹的構建，建立了目標真菌的鑒定體系。將形態學鑒定和分子生物學鑒定相結合，對其分類地位進行確定。隨著現代分子生物學技術手段的不斷改進和創新，越來越多的學者重視真菌的分類研究，能夠解決真菌屬、種間系統發育關系問題，也能為指導田間防治提供可靠依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株供試菌株S-51為本實驗室自水稻種子中分離純化獲得。

1.1.2試劑耗材引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；2×PCR Taq Master Mix，購自天根生化科技（北京）有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），購自青島海博生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的分離取50 g水稻種子置于無菌水中室溫浸泡處理1天，轉入-20℃下冷凍處理1天，1%次氯酸鈉消毒60 s，無菌水洗滌3次后，用滅菌濾紙吸干水分按10粒/皿置于PDA培養基上，在25～28℃，12 h黑暗/ 12 h光照（12 h光暗交替）條件下培養，第3天開始觀察，根據種子周圍新生菌落的形態和顏色進行分離。病原菌純化采用單孢子分離法[15]。

1.2.2培養性狀和形態學觀察觀察培養基上菌落的顏色、形態和大小等，采用十字交叉法測量菌落直徑。插片法取樣[16]，染色后光學顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子等。另，保存菌株于CTAB緩沖液的Eppendorf管中用于DNA提取。

1.2.3分子生物學鑒定CTAB法提取菌株總DNA，使用真菌通用引物（ITS1/ITS4）進行PCR擴增。PCR擴增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反應體系50μL：模板2μL，2×PCR Taq Master Mix 25μL，10μmol/L正向引物和反向引物各1μL，滅菌雙蒸水補足至50μL。PCR反應程序：94℃5 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min，35個循環；72℃7 min。PCR擴增產物進行DNA純化、測序，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2.4系統發育樹的建立將測得的ITS序列在GenBank中進行Blast比對分析，比對和查找親源關系較近菌株的基因序列，并下載。使用MEGA7軟件構建系統發育樹，從而確定菌株的分類地位[17]。

2結果與分析

2.1形態學特征

在PDA培養基上，初生菌落白色、后期菌落中間褐色，初生菌落背面淡黃色，氣生菌絲稀疏，呈薄絨狀，菌落生長速度略慢，培養7天的菌落直徑為4.5 cm，平均6.4 mm/d。菌落邊緣整齊，形成同心環，在每天光照12 h的條件下培養，菌落上最終形成顏色深淺程度不同的同心環，從內到外顏色逐漸變淺（圖1）。培養7天開始產生分生孢子，可產生橙色孢子團。顯微鏡下觀察小型分生孢子長橢圓，無色；大型分生孢子新月形，兩端鈍圓，無色，以1個和3個隔膜居多。產孢細胞瓶形或倒梨形，頂端較細（圖2）。分離菌株S-51的形態特征與文獻中[7，18-19]雪霉葉枯病菌（Microdochium nivale）的描述極為相似。

2.2基因序列分析結果

應用ITS通用引物進行PCR擴增，S-51菌株獲得了500 bp左右的清晰條帶，電泳結果見圖3，將純化的PCR產物直接測序，獲得了506 bp的序列。

2.3系統進化樹構建

將測序所得的ITS序列（506 bp），通過NCBI上GenBank數據庫進行序列比對，比對發現菌株S-51序列與NCBI上Query coverage值超過95%、Max idenl值超過97%的序列比對結果中，除了雪霉葉枯病菌（M. nivale）外其他的結果均為Microdochium sp.信息。下載親源關系較近或同屬菌株的基因序列及其相關信息，使用Mega7中的鄰接法（NJ）構建系統發育樹。選取了11個與本試驗菌株相似性較高或關系較近的ITS區段序列，進行系統進化樹的構建，外類群（Outgroup）使用引起水稻紋枯病的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）。從進化樹（圖4）上可以看出，本研究菌株S-51與Genbank編號為KJ780751.1的雪霉葉枯病菌（M. nivale）單獨聚為1枝，兩者的親緣關系非常近，支持率達100%，與外類群相距較遠。結果表明，S-51菌株與雪霉葉枯病菌（KJ780751.1）相似度極高，雪霉葉枯病菌M. nivale和M. musae的親緣關系最近。

3討論與結論

關于雪霉葉枯病菌開展的相關研究中，其寄主均為小麥[7，18-19]，僅Broggi等[25]于1997—1998年之間在阿根廷恩特雷里奧斯省稻米主產區進行了一次真菌學調查，發現M. nivale為Microdochium屬在水稻種子中的優勢種，其他關于水稻中分離到該菌的相關報道很少。本研究對一株水稻種子中分離的真菌進行鑒定，確定其為雪霉葉枯病菌（M. nivale）。

由于某些真菌的屬或種在形態學特征方面差異極不明顯，給傳統的分類鑒定方法增加了難度，從分子水平來分析真菌的遺傳結構已成為傳統分離鑒定的有效補充[20]。ITS區受到的選擇壓力較小，進化速率較快，在絕大多數真核生物中表現出了極為廣泛的序列多態性[21- 23]，可廣泛用于種間、種內群體間的系統學研究[24]。筆者利用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增了分離所獲菌株的部分rDNA-ITS序列，長度為506 bp，包括18S rDNA部分序列、ITS1-5.8S-ITS2全序列和28S rDNA部分序列。利用這個片段開展的序列分析和系統進化樹構建，結合形態特征，能夠確定分離自水稻種子中的S-51菌株為雪霉葉枯病菌（M. nivale）。

研究中未見該菌在水稻上的危害癥狀，其是否能引起田間水稻發病，有待今后進一步調查研究。鑒于水稻種植目前在中國的重要地位，積極研究其潛在病害的發生情況，對預防病害的發生有著重要意義，也為生產中防控該病害提供了理論依據。

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