表面活性劑對石油污染土壤生物修復的影響研究

＊鄧春萍 肖鵬 崔學嚴 萬利瓊 鄭舒麗 王林娟

（西南石油大學 四川 610500）

引言

由于過去數年間各大油田區采油工藝的相對落后和密閉性不佳，加之環境保護措施、意識和影響評價體系相對落后、污染控制和相應修復技術的缺乏，我國油田區土壤的石油污染程度遠高于其他發達國家，土壤的石油污染呈逐年累積加重態勢。目前，石油污染土壤嚴重影響了我國油田區的經濟發展和生態環境，成為當地社會、經濟和環境可持續發展最主要的制約因素。因此，石油污染土壤的修復，已經成為我國當前環境領域研究的焦點和亟待解決的重大環境問題之一[1]。

微生物法修復石油污染土壤，是指通過改變微生物外部生活環境和依照生物自身的遺傳變異規律來提高石油降解速度和程度的一種修復方法[2]。石油烴污染物疏水性強，溶解度低，土壤中有機物質對石油烴有吸附作用，這些因素大大降低了土壤中石油的微生物可利用度，影響微生物修復效率[3]。采用表面活性劑提高污染物的溶解度是提高其生物可利用度的有效途徑，微生物在生長過程中所分泌的生物表面活性劑因其具有較高的界面活化能力以及對環境無二次污染等特性，在提高污染物的生物可利用度方面得到越來越多的重視[4]。

2020年Xin Hu等人發現紅球菌HX-2是生物表面活性劑的有效生產者，該表面活性劑表現出所需的生物修復特性。生物表面活性劑NK由于其在各種熱、酸、堿和高鹽條件下的穩定性而成為一種有吸引力的環境修復工具。與其他幾種表面活性劑相比，它對石油和多環芳烴的溶解速度也很高，最重要的是它增強了微生物降解石油的能力[5]。2019年楊忠平等人提出表面活性劑強化修復技術（SER）可使地下環境中的污染物解吸和淋出，對去除砂土層殘留態非水相液體（Nonaqueous Phase Liquids，NAPLs）具有顯著效果，適合石油類污染的修復工作，但其解吸效率受土壤顆粒性質、孔隙度與滲透率等因素的限制，助驅能力存在極限，不能完全將土壤中的石油污染物洗脫[6]。2007年譚麗泉等人提出降解菌對表面活性劑的優先利用消耗了必要的養分,同時削弱了其增溶作用,因此抑制了多環芳烴（PAHs）的降解[7]。

總體來看，盡管當前對使用表面活性劑刺激石油土壤污染的生物修復有一定研究，但研究結果顯示影響效果不確定，添加表面活性劑可能提高微生物修復效果，也可能對微生物具有一定的毒性，限制微生物修復。但關于表面活性劑對石油污染土壤生物修復效果的影響因素、內在機制的系統研究還不足[8]。為此，本文選用鼠李糖脂生物表面活性劑、β-環糊精、聚氧乙烯醚（Tween-80）、十二烷基硫酸鈉（SDS）作為研究對象，研究表面活性劑對石油污染土壤生物修復的影響，并通過實驗得出最優表面活性劑，并優化投放濃度，為表面活性劑強化生物修復石油污染土壤應用提供相關參考意見。

圖1 含油率變化

1.材料與方法

(1)實驗材料

供試土壤：清潔土壤（砂土）采自西南石油大學附近地區。

污染物：石油烴，取自中國石油化工有限公司。

石油降解菌：試驗添加的石油降解菌為經富集和馴化的混合降解菌。

Tween-80：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。

十二烷基硫酸鈉（SDS）：純度，AR，上海凜恩科技發展有限公司。

鼠李糖脂：純度，≥95%，上海麥克林生化科技有限公司。

β-環糊精：純度，≥95%，上海凜恩科技發展有限公司。

(2)實驗方法

①土壤制備

前期的土壤準備，土壤選自本校的無污染土壤。收集好土壤之后，將土壤運回實驗室，進行2周的晾曬，土壤去除根莖、樹葉、碎石子等后經室內風干、破碎、研磨，過20目篩。通過篩子過篩得到干燥的較小顆粒土壤，后通過加入不同量的用石油醚溶解過的石油模擬不同濃度石油污染的土壤。首先，分別配制了石油質量占比為3%、5%、7%、9%的4個濃度梯度的石油污染土壤。

②無機培養基制備

取超純水1L，NaNO31.5g，KCl 0.5g，(NH4)2SO41.5g，MgSO40.5g，K2HPO41g，CaCl20.002g，FeSO40.01g于錐形瓶中，調節溶液pH在7.0-7.2范圍內，于121℃下滅菌20min。

③接種菌群

混合降解菌接種自油泥，并在模擬污染物（石油）為碳源的無機培養中富集和馴化培養。經菌種鑒定，混合降解菌主要包含寡養單胞菌屬Stenotrophomonas、假單胞菌屬Pseudomonas和芽胞桿菌屬Bacillus。在無菌條件下向錐形瓶中加入配制好的無機鹽培養基、1g原油并加入1%菌液，先用稱量紙緊緊包住錐形瓶，后用報紙緊緊包住，放到搖床中，轉速為140r/min，培養10天標記為母液。以母液為菌液重復以上步驟再制備5組。以100g為一份，將四種污染程度的土壤各分17份，裝入相同的容器中。其中一份不加菌液也不加表面活性劑，只加入等量純水為空白參照。而后將四種表面活性劑依次配制4組不同濃度的溶液。將配置好的16組溶液等量依次加入到每種污染程度的等量小份土壤中，半小時后接著向土壤中加入等量的菌液。為保證土壤中的菌液正常生長，每天加入適量的純水。

④含油率測定

從每一種污染程度的土壤中取5g，測定并記錄初始含油率，即第0天的含油率。之后每間隔5天，測定一次含油率，共測量記錄4次。對比分析數據，分析降解菌對石油降解的作用情況、同樣污染程度下不同表面活性劑的作用情況、不同污染程度下同一表面活性劑的作用情況、各種表面活性劑對于菌落降解石油的影響等。

2.結果與討論

(1)原始污染土壤粒徑占比

由表1原始污染土壤粒徑占比可得，原始污染土壤中粒徑在0.15mm-0.9mm的土壤占比64.6%，少部分土壤粒徑在0.15mm以下，極少部分土壤粒徑大于0.9mm。綜合分析可得，實驗使用土壤主要為沙土，土壤間隙較大，適合于好氧微生物生長以及土壤中石油烴的降解。

表1 原始污染土壤粒徑占比（%）

(2)供試土壤指標

表2 供試土壤指標

根據土壤營養分級，土壤pH屬于低堿性，有機質含量等級為中上，總氮含量等級為中等，堿解氮含量等級中上，總磷含量等級高，速效磷含量等級高，速效鉀含量等級中上偏高，總體土壤營養環境較好，適合微生物的生長。

(3)含油率變化圖

根據所得實驗數據做出的圖，分析可得表面活性劑的加入可以提高石油降解率。

根據所得實驗數據做出的圖，對原含油量為3%的數據組進分析：從第7天到第21天時，空白對照組（未接種也未加表面活性劑）含油量基本沒有變化，加了1.7% SDS組含油量下降了59%，其次是5.1% SDS下降了41.9%。而0%和9.6% β-環糊精、0.45%和0.9%的tween80、0% SDS均只下降了24%左右。剩余的3.4% SDS、3.2% β-環糊精、1.35% tween80均只下降了16%左右。綜上，得1.7%SDS效果最好。

根據所得實驗數據做出的圖，對原含油量為5%的數據組進分析：在7至21天土壤中的含油率均在下降，其中與0.76%鼠李糖脂效果最好，而0.38%鼠李糖脂次之。經過28天的實驗后，發現鼠李糖脂效果最好，其中0.76%的鼠李糖脂對石油降解的效率最好,下降了約51.5%,而0%鼠李糖脂下降了48.1%，0.38%鼠李糖脂含油率下降了45.54%.由于實驗操作中數據測量可能存在誤差，導致部分數據并不準確，存在一定誤差。總的來說，經過28天的觀測，0.76%鼠李糖脂對石油含量5%的土壤降解效果最好。

根據所得實驗數據做出的圖，對原含油量為7%的數據組進分析：從圖線總體趨勢來看，空白對照組和0%的SDS組中含油率幾乎沒有變化；1.7%的SDS組含油率下降了5.36%、3.4%的SDS組下降了7.11%，此效果不如單一使用微生物時的效果，所以該種表面活性劑不建議使用，可能會抑制微生物的生長；6.4%的β-環糊精組下降了2.3%，可能是表面活性劑濃度過高抑制了微生物的生長、0.90%的tween80組下降了9.56%；0.38%的鼠李糖脂組和0.76%的鼠李糖脂組含油率下降幅度大，分別下降了40.4%和43.76%，大于不加表面活性劑對照，說明鼠李糖脂的加入促進了石油烴在土壤中的微生物修復。從各組最后的含油量與初始含油量的比較中可以得出，降低含油量效果最好的是，0.76%的鼠李糖脂，其次是0.38%的鼠李糖脂。不同的表面活性劑降低含油率效果不同，從實驗數據可以看出，鼠李糖脂的效果＞tween80＞SDS＞β-環糊精。

根據所得實驗數據做出的圖，對原含油量為9%的數據組進分析：由圖中曲線趨勢可見，無論哪種表面活性都可使體系含油率下降，對比發現其中β-環糊精效果最好，SDS次之，最后是tween80，數據表明，濃度對表面活性劑有影響但并非單純的線性關系，3.2%β環糊精效果最好，土壤含油率下降百分數為64%，其次是0.90%tween80，土壤含油率下降百分數為51%，其余土壤含油率下降百分數為40%左右，綜上所述3.2%β-環糊精效果最好，其次是0.90%的tween80。

綜上所述，0.38%的鼠李糖脂對石油含量7%的土壤降解效果最好，性價比最高，達到了40.4%，明顯高于[9]中的19.5%，說明本實驗的菌株與表面活性劑的濃度配比合適，對微生物修復的增強效果十分的明顯。1.7%SDS組含油量下降了59%，明顯高于[10]中的46%,S說明低濃度的SDS對土壤石油烴的微生物降解具有明顯增強效果；3.2% β-環糊精對石油含量9%的土壤降解效果最好達到64%，明顯高于[11]中的降解率45%。從四種表面活性劑下對比下可知，鼠李糖脂和β-環糊精作為一種可以增強微生物降解石油烴的表面活性劑，總體效果較好，并且明顯的提高降解效果，值得思考的是，在以往研究中還有考慮土壤含水率的問題[12]，含水率對表面活性劑的增強效果也有巨大影響[12]，在后續實驗可以探究含水率和菌種濃度對修復效果的影響。