基于核酸適配體的膠體金層析試紙條對鎘離子的定量檢測

＊涂東堃 鄭麗婷 鄭曉亮 王藝偉 曾紹校 徐暉

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福建 350002）

引言

鎘是一種人體非必須元素，進(jìn)入人體后會對肺臟、腎臟等器官造成嚴(yán)重的損傷，且這種毒性作用時間長、不易消除，具有很強(qiáng)的蓄積性[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，大量礦產(chǎn)開采導(dǎo)致重金屬的平均暴露水平提高，不少地區(qū)土壤和水體中鎘離子含量升高，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品和食品中鎘的污染，對人體健康構(gòu)成威脅。因此，開發(fā)可靠的分析方法測定食品中鎘離子含量對保障人們的生命健康具有重要意義。

傳統(tǒng)的鎘離子檢測方法包括原子吸收光譜法[2]、原子熒光光譜法[3]、電感耦合等離子體質(zhì)譜[4]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[5]、高效液相色譜法[6]等。經(jīng)過多年的發(fā)展，儀器分析法已成為成熟可靠的檢測方法，具有很高的靈敏度和選擇性，結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性高。而這些檢測方法往往需要具備配套的大型儀器，設(shè)備耗材昂貴，這些問題限制了其在快速檢測和現(xiàn)場檢測的應(yīng)用。

核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體進(jìn)化系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)獲得DNA或RNA，通過形成發(fā)夾、凸環(huán)和G-四聚體等結(jié)構(gòu)與特定的靶標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生較高的親和力，可作為金屬離子、有機(jī)物或細(xì)胞等物質(zhì)的分子識別元件[7]。與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體具有可人工合成和修飾，純度高、親和力強(qiáng)等特點。近些年，核酸適配體被廣泛應(yīng)用于金屬離子的檢測中。Gan等[8]設(shè)計了一種基于核酸適配體的膠體金比色傳感器用于檢測Cd2+，核酸適配體與Cd2+結(jié)合后，游離的核酸適配體數(shù)量減少，導(dǎo)致膠體金在鹽的作用下聚集，溶液顏色變深。Zhu等[9]用6-羧基熒光素（6-FAM）修飾核酸適配體設(shè)計了一種熒光傳感器，檢測線為2.15nmol/L。重金屬離子結(jié)構(gòu)簡單、結(jié)合位點單一，與核酸適配體結(jié)合不會發(fā)生明顯的質(zhì)量變化和空間位阻效應(yīng)，限制了傳感器的開發(fā)和應(yīng)用。本研究以鎘離子核酸適配體為分子識別元件，設(shè)計了一種基于競爭性反應(yīng)的鎘離子快速檢測試紙條，以期用于食品和環(huán)境樣品中鎘離子的快速分析。

1.材料與方法

(1)主要材料與試劑

檸檬酸三鈉、三水合氯金酸、蔗糖、吐溫-20、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、十二烷基苯磺酸鈉、鏈霉親和素和氯化鈉購于美國Sigma公司；牛血清白蛋白和HEPES緩沖溶液購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸纖維素膜、樣品墊、結(jié)合墊和底板購于上海杰一生物技術(shù)有限公司。

(2)儀器與設(shè)備

DT2032金標(biāo)試紙條閱讀分析儀（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；CT300裁條機(jī)（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；HM3030三維平面點膜噴儀（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）。

(3)實驗方法

①膠體金的制備

通過檸檬酸三鈉鹽還原氯金酸制備粒徑為15～20nm的膠體金。實驗中所用的玻璃器皿均用新制王水浸泡24h，用超純水沖洗干凈，烘干備用。往圓底燒瓶內(nèi)加入250mL超純水和50μL 50%氯金酸溶液，于磁力加熱攪拌器上加熱攪拌至沸騰。溶液沸騰后，迅速加入5mL 45mmol/L檸檬酸三鈉鹽，溶液的顏色由淡黃色變?yōu)榛疑詈蟪示萍t色，繼續(xù)反應(yīng)10min停止加熱，保持?jǐn)嚢枥鋮s至室溫。收集所制得的膠體金溶液，于4℃儲存。

②膠體金標(biāo)記核酸復(fù)合物的制備

取6管十倍濃縮的膠體金，加入10μL 5mmol/L dATP溶液，振蕩15min后加入15μL 1%的SDS溶液；加入1mol/L的NaCl溶液進(jìn)行老化，于37℃水浴3h，離心取上清液，將制備所得的復(fù)合物重溶于緩沖溶液中。

③試紙條分析性能的研究

A.特異性檢測

用所制備的試紙條對As3+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+和Cd2+進(jìn)行檢測，對比檢測結(jié)果驗證試紙條的特異性。配制濃度為100ng/mL的各種金屬離子溶液，取47μL金屬離子溶液與3μL膠體金標(biāo)記核酸適配體復(fù)合物混合，室溫下振蕩20min，滴加于樣品墊，用50mmol/L HEPES緩沖液沖洗至樣品墊上無紅色。觀察試紙條顏色的變化，通過試紙條的響應(yīng)信號評估試紙條的特異性，每種重金屬平行做3次試驗。

B.重現(xiàn)性檢測

選用0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL三個濃度的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，每個濃度做5次重復(fù)試驗，計算其平均值與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評估試紙條重現(xiàn)性能。

C.工作曲線和檢測線繪制

用試紙條分別對0ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、70ng/mL、90ng/mL、100ng/mL的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，每個濃度做3個平行樣，以Cd2+濃度為橫坐標(biāo)，試紙條檢測線響應(yīng)信號為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算檢測限。檢測限計算公式如下：

式中，a-標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；

b-標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；

LOD-試紙條檢測限度；

N-空白響應(yīng)值的平均值。

D.信噪比的計算

以空白樣溶液為對照，以100ng/mL的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液為試驗組，做3次平行試驗，讀取檢測線和控制線的峰面積，取平均值。通過空白與試驗組的峰面積之差比空白組峰面積的平均值計算信噪比。信噪比計算公式如下：

式中，X1-空白樣的峰面積平均值；

X2-100ng/mL樣品峰面積平均值；

S/N-信噪比。

2.結(jié)果與分析

(1)鎘離子核酸試紙條工作原理

當(dāng)待測溶液中存在Cd2+時，膠體金標(biāo)記核酸適配體（Conjugate）與Cd2+結(jié)合，形成Conjugate-Cd2+；Conjugate-Cd2+在毛細(xì)的作用下流過檢測線，由于核酸適配體與Cd2+形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，無法與捕獲探針結(jié)合，檢測線不顯色；當(dāng)樣品溶液中不存在Cd2+時，核酸適配體與捕獲探針1雜交互補(bǔ)配對，在檢測線上形成紅色條帶。控制線顯色時，為有效測試；當(dāng)控制線不顯色時，則視為無效測試。通過裸眼觀察檢測線和控制線對樣品溶液進(jìn)行定性分析，當(dāng)檢測線顯示紅色時樣品為陰性，當(dāng)檢測線無色時樣品為陽性；檢測線上紅色條帶的顏色深淺與靶標(biāo)Cd2+濃度成反比關(guān)系，通過檢測線上的響應(yīng)信號，可對樣品溶液進(jìn)行定量分析。

(2)特異性分析

本實驗選擇As3+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+和Zn2+做為干擾離子，分析試紙條對Cd2+離子的選擇性。結(jié)果如圖1所示，在相同濃度下（均為100ng/mL），試紙條對Cd2+具有最高的信噪比，顯著高于其他干擾離子，說明所制備的核酸試紙條對Cd2+具有較好的選擇性和特異性；盡管試紙條對干擾離子中的Cu2+、Zn2+也有微弱的信號響應(yīng)，可以對Cu2+和Zn2+采取屏蔽措施以減小其對檢測結(jié)果的干擾[10]。

圖1 試紙條特異性檢驗

(3)重現(xiàn)性分析

重現(xiàn)性是試紙條性能分析的重要指標(biāo)，決定著試紙條是否穩(wěn)定和是否符合定量檢測的要求。本實驗選取0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL三個濃度的樣品進(jìn)行試驗，每組濃度平行測定5次。計算不同濃度下樣品響應(yīng)信號的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)計算三種濃度下的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4%、4%、7%，說明該試紙條具有較好的重現(xiàn)性。

圖2 不同濃度樣品的試紙條重現(xiàn)性檢驗

(4)工作曲線和檢測線

在最佳條件下，對不同濃度的Cd2+進(jìn)行檢測，繪制試紙條工作曲線。結(jié)果如圖3所示，隨著Cd2+濃度逐漸增高，檢測線上的顏色由深紅色逐漸變淺，鎘離子濃度達(dá)到100ng/mL時試紙條消線。圖4為試紙條響應(yīng)信號與濃度關(guān)系（工作曲線），其中橫坐標(biāo)為Cd2+的濃度（ng/mL），縱坐標(biāo)為該濃度下的試紙條的響應(yīng)信號值。計算得到工作曲線的線性方程為y=-6.6355x+706.71，R2=0.9865，檢測限為3.79ng/mL，線性范圍為10～100ng/mL，可利用該試紙條對一定濃度范圍的鎘離子進(jìn)行定量檢測。

圖3 不同濃度鎘離子樣品的試紙條圖片

圖4 不同濃度鎘離子樣品的工作曲線

3.結(jié)論與討論

本文構(gòu)建了一種用于Cd2+的快速檢測的膠體金標(biāo)記核酸適配體試紙條。對所制備的試紙條重現(xiàn)性、特異性進(jìn)行分析，結(jié)果表明試紙條具有較好的重現(xiàn)性，對Cu2+、Zn2+有較微弱的響應(yīng)，其余金屬離子對試紙條影響不明顯。試紙條的響應(yīng)信號和Cd2+濃度在10～100ng/mL時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-6.6355x+706.71，R2=0.9865，經(jīng)計算該方法檢測限為3.79ng/mL。本文的試紙條檢測方法與其他試紙條方法[11-13]及比色法進(jìn)行對比[14-16]，本文的試紙條方法具有較低的檢測限，更寬的線性范圍，適合于現(xiàn)場的快速檢測。該試紙條的靈敏度達(dá)到生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749-2006）中鎘離子的限量5ng/mL，檢測時間比國標(biāo)方法縮短了1h。后續(xù)工作主要集中在繼續(xù)提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性：篩選更具親和力的核酸適配體；優(yōu)化試紙條的工藝；采用信號擴(kuò)增技術(shù)提高靈敏度等。