肝臟常溫機械灌注修復及評估系統的研制

劉雯雁 ，劉鋒鋒，呂毅，湯博，馬濤，閆煬，鄭云巧，鄭幸龍,

1 西安交通大學第一附屬醫院 血液凈化科，西安市，710061

2 西安交通大學第一附屬醫院 精準外科與再生醫學國家地方聯合工程研究中心，西安市，710061

3 西安交通大學第一附屬醫院 心血管外科，西安市，710061

4 西安交通大學第一附屬醫院 麻醉手術部，西安市，710061

0 引言

肝移植仍是目前治愈終末期肝病的唯一有效手段。目前我國肝移植供肝的主要來源為公民心臟死亡器官捐獻（donation after cardiac death，DCD），其中邊緣供肝的使用一定程度上拓展了供肝的來源，但其對缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）的耐受能力明顯減弱[1]。常溫機械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）能夠在生理溫度下為肝臟持續提供氧氣和營養物質，并排出代謝廢物，改善器官保存期間的能量代謝狀態[2-3]。大量動物實驗及臨床研究提示NMP可有效減輕移植肝IRI，促進術后肝功恢復[4-5]，甚至可減少術后缺血性膽道狹窄的發生率[6]及修復脂肪供肝[7]。

基于此，本團隊設計并研制了肝臟常溫機械灌注修復及評估系統，在灌注修復供肝的同時對肝功能進行評估，評估供肝質量是否達到肝移植要求，或者經過修復后是否達到肝移植要求。

1 設計思路

目前，傳統的器官保存方式仍是靜態冷保存，然而越來越多的證據證實即使持續處于4oC，仍在進行大約5%的代謝，這就會造成ATP儲備減少且持續產生有害的代謝產物，導致供肝質量受損。傳統的保存方式已不能滿足DCD供肝保存需求。為解決臨床困境，我們團隊研發了肝臟常溫機械灌注修復及評估系統，由肝臟常溫機械灌注裝置、熒光成像系統及組織測氧儀組成。常溫機械灌注裝置持續在生理溫度下為肝臟提供氧氣和營養物質，維持細胞功能，減輕炎癥反應，達到保護及修復的目的，熒光成像系統通過激發并識別灌注液中吲哚菁綠（indoeyanine green,ICG）的熒光，并在屏幕上成像來實時評估供肝微循環情況及肝細胞代謝功能，組織測氧儀可以實時監測肝臟氧分壓變化評估細胞氧供狀態。同時，通過灌注屠宰場獲取的豬肝初步驗證了系統的穩定性。

2 基本結構

2.1 肝臟常溫機械灌注修復系統

圖1 肝臟常溫機械灌注修復系統組成Fig.1 Components of liver normothermic machine perfusion repair system

系統由三個模塊組成，分別為灌注模塊、氧合模塊及監測控制模塊（見圖1）。灌注模塊包括：蠕動泵（BQ50-1J保定蘭格），用于提供動脈循環動力；儲肝容器，用于放置肝臟；第一動脈循環管路，入口端與儲肝容器的出口端連通；第二動脈循環管路，入口端與恒溫氧合裝置的第一出口端連通，出口端延伸至開放式儲血容器內，用于與放置在儲肝容器內的供肝的肝動脈連通；靜脈循環管路，入口端與恒溫氧合裝置的第二出口端連通，出口端延伸至儲肝容器內，用于與供肝的門靜脈連通。主要功能為肝臟動脈及門靜脈提供雙重灌注，模擬在體狀態下的血液循環。氧合模塊包括：儲液罐，用于儲存灌注液，內部設置有液位傳感器，用于監測儲液罐內的液位；變溫水箱，有熱水出口和回水口，熱水出口和回水口分別與膜式氧合器內的熱交換管的兩個端口對應連通以使變溫水箱內的熱水循環流過熱交換管以將流過膜式氧合器血液加熱至預設溫度；膜式氧合器（Maquet），用于氧合灌注液，為供肝提供富氧灌注液，入口端與第一動脈循環管路的出口端連通將儲肝容器的血液輸送至膜式氧合器；氧氣瓶，用于儲存氧氣，在器官轉運途中也可為灌注液提供氧合條件。主要功能為利用膜式氧合器對灌注液中的紅細胞進行氧合，并對灌注液加溫，為肝臟提供充足的氧氣，滿足肝細胞代謝需求。監測控制模塊包括：流量計，用于檢測動脈循環管路及靜脈循環管路的灌注液流量；壓力傳感器，用于檢測動脈循環管路及靜脈循環管理的灌注壓力；流量控制閥，用于穩定動脈循環管路及靜脈循環管路灌注液流量在設置范圍內，當流量超過設定值時，流量閥啟動，壓迫管道，通過減小管徑來降低流量；控制顯示屏，控制器獲取流量計、壓力計、液位傳感器的監測信號，控制器與驅動器連接，根據相應的監測信號通過驅動器控制蠕動泵、變溫水箱、流量控制閥啟動、停止或進行相應的控制動作，同時控制器與顯示屏連接能夠將各種監測信號發送至顯示屏進行顯示，并可通過顯示屏調節各項控制參數。主要功能為實時監測灌注過程中門靜脈、肝動脈的流量及壓力，并穩定灌注流量與壓力在一定范圍內。

2.2 程序處理流程

系統開機啟動后，初始化完所有的硬件設備，通過主控制臺設置溫度、血液流量、壓力閾值、蠕動泵轉速等參數。點擊啟動按鈕系統開始運行，讀取液位傳感器信息，判斷水位達到指定容量，控制繼電器開啟電加熱管電源開始水箱加熱，水恒溫到設定值。啟動循環泵，運行加熱循環系統，通過膜肺將血液加熱至設定值。連接灌注肝臟，啟動蠕動泵開始系統血液循環，實時監測流量與壓力，調整流量控制閥或蠕動泵轉速保證血液流量及壓力均在要求范圍之內。串口實時獲取溫度、壓力傳感器的數據解析并計算處理，定時器實時獲取計數脈沖并計算得到流量（見圖2）。

圖2 程序處理流程Fig.2 Program treatment process

整個系統中，肝動脈端流量主要依靠蠕動泵驅動，靜脈端流量主要依靠儲液罐與儲肝容器之間的高度差通過重力驅動。系統的流量反饋調節依靠流量控制閥實現精準控制。蠕動泵轉速設置在430 r/min以維持系統基本流量，通過第二動脈循環管路中流量控制閥擠壓管道以實現對儲液罐液面及肝動脈流量的控制。同時，通過調節靜脈循環管路中流量控制閥的松緊程度以實現門靜脈灌注的流量控制。亦可手動通過顯示屏控制調整蠕動泵泵速，然后經流量計反饋系統自動調整流量控制閥松緊度，以確保流量符合要求。灌注過程中門靜脈流量維持在1 000～1 200 mL/min，肝動脈流量維持在200～400 mL/min，肝動脈壓力維持在65～75 mmHg（1 mmHg=133.32 Pa）。若儲血罐液面水平低于警戒線或肝動脈壓力高于設定閾值，系統將報警，蠕動泵隨之停轉。

2.3 供肝評估系統

該評估系統由熒光成像系統和組織測氧儀組成，見圖3(a)，以實現對供肝的實時功能評估。熒光成像系統基于肝細胞可攝取代謝ICG并由膽汁排出的特性，通過785 nm近紅外光激發，產生830 nm更長波段的近紅外光而實現定位，通過觀察灌注過程中肝臟及膽道系統成像的變化可評估微循環灌注效果及肝細胞代謝功能。熒光成像系統包括：激發器，在距離肝臟8～12 cm處發射激光，激發灌注液中的ICG；體外圖像處理單元，CCD相機捕捉肝臟組織的熒光圖像，通過傳像束組件將圖像傳輸至數據處理中心，并在顯示器中顯示肝臟熒光圖像。激發器和CCD相機集成于手持式探頭中。組織測氧儀（OxyLiteTM，英國Oxylite公司）包括：光纖氧微傳感器，利用光學熒光技術實現組織氧分壓的定量測定及溫度測定；信號采集器，將采集到的生物學信號轉化為電信號；顯示屏，可實時顯示組織氧分壓及溫度。將傳感器插入肝組織，可實時監測肝組織中的氧分壓及溫度變化，見圖3(b)。熒光成像系統和組織測氧儀分別為兩套獨立系統，各自配有顯示器，ICG成像結果，見圖3(c)。

圖3 供肝評估系統Fig.3 Assessment system of donor liver

3 肝臟灌注實驗

利用屠宰場獲取的豬DCD肝臟（n=10）進行設備的可行性驗證實驗，每個供肝離體灌注時間為6 h。在屠宰場獲取豬肝并行門靜脈及肝動脈插管，灌注生理鹽水沖出肝臟內殘留血液及血栓，同時行膽總管插管以方便留取膽汁。灌注液為稀釋豬全血（乳酸鈉林格液稀釋，灌注液成分配比仍需后續實驗調整），運行過程順利，關鍵參數門靜脈流量可維持在1 000～1 200 mL/min，肝動脈流量維持在200～400 mL/min，肝動脈壓力維持在65～75 mmHg(1 mmHg=133.32 Pa)。在開始灌注20 min內即可見膽汁生成，并持續引流，膽汁生成量約（10.2±8.7）mL/h。對于供肝的評估，在灌注初始，灌注液中加入20 g ICG，通過熒光成像系統和組織測氧儀可實時觀察肝臟表面熒光變化及組織氧供變化情況。圖3(c)所示為一例供肝離體灌注時的情況，隨著灌注的進行，豬DCD供肝逐漸顯影，灌注22 s時肝門部顯影，52 s時左外葉大部分顯影，至10 min 7 s時全肝呈顆粒狀花斑顯影。說明供肝的微循環通暢，并具備代謝功能。將氧分壓感受器探頭插入肝組織中，可見隨著灌注時間的延長，組織溫度維持在37oC左右且氧分壓逐漸升高，說明肝臟常溫氧合機械灌注效果良好（圖3(b)）。由此證明本系統離體灌注DCD肝臟具備一定可行性并且安全有效。

4 小結

目前國外已報道用于臨床試驗的肝臟常溫機械灌注系統主要有：OrganOx metra[5](英國OrganOx公司)，Organ Care System (OCS) Liver[8](美國Andover公司)，Liver Assist?[4]（荷蘭Assist公司）和Cleveland NMP[9]設備（美國Cleveland Clinic公司）。這些設備不僅價格昂貴，且多數實驗中心難以購入，限制了供肝保護修復方向的研究。國內亦有中心自主研發相關設備。本團隊研發的灌注系統不僅可實現離體肝臟的常溫氧合機械灌注，并且可實時監測灌注壓力及流量，通過反饋系統自動控制，及時調整泵速，將灌注壓力及流量維持在設定范圍內，具備一定的自動化。與此同時，本系統配有熒光成像系統及組織測氧儀，實現了肝臟部分代謝功能的實時監測。通過對灌注液的生化學檢查，可在移植前進一步評估供肝功能。

現有研究中，NMP在保護DCD肝臟中表現突出。NASRALLA團隊[4]臨床隨機對照研究發現與傳統靜態冷保存相比，NMP可顯著降低移植術后肝酶的峰值水平，同時供肝損傷率降低50%，平均離體保存時間延長54%。國內中山大學何曉順團隊[10]利用 NMP提出無缺血肝移植概念，術后 30 d總體生存率達100%。但是，目前灌注過程中對供肝“生存能力”及“可移植性”的評估，主要都集中在灌注液AST、ALT、LDH水平，或肝臟大體形貌，缺少直接證據和對供肝的實時評估。本系統實現了在灌注過程中即對供肝進行肝功能的評估，ICG熒光成像不僅可以評估微循環通暢程度，還可以通過觀察膽汁的熒光強度來評估肝細胞的代謝分泌功能，未來這一評估可以做到定量評估，更加準確。同時，肝臟組織氧分壓的測定可以評估肝組織耗氧情況，反映肝細胞功能恢復水平。實時評估系統有望指導DCD供肝的使用，明確灌注修復時間，避免過度灌注情況的發生，以及預測預后，早期指導用藥。系統現可以穩定運行并實現上述評估功能，其有效性還需進一步移植實驗來驗證。