Wnt信號通路與無脊椎動物天然免疫

鄒晨辰 阮靈偉 施泓

（自然資源部第三海洋研究所 自然資源部海洋生物遺傳資源重點實驗室，廈門 361005）

Wnt信號通路最早在果蠅的發育中被發現，它在動物間存在遺傳學上的高度保守性，且存在于所有后生動物中［1］。該信號通路廣泛參與細胞增殖和凋亡、組織分化和再生、胚胎發育等多種生物過程［2］。目前，Wnt信號通路在多種疾病發生和發展中的作用，以及在病原體侵染時發揮的天然免疫調控作用正成為研究熱點。

Wnt信號通路以Wnt為配體激活信號通路，從而將胞外信號傳入胞內。根據Wnt的分子類型和下游分子的響應作用機制，Wnt信號通路可分為2類，即經典Wnt信號通路和非經典Wnt信號通路。經典Wnt信號通路目前已被廣泛研究，隨著研究的深入非經典Wnt信號通路也正越來越多地引起人們的關注。其中非經典Wnt信號通路主要包括Wnt/平面細胞極性信號通路（Wnt/planar cell polarity pathway，Wnt/PCP pathway）和 Wnt/Ca2+信號通路［3］。

1 經典Wnt信號通路

1.1 經典Wnt信號通路概述

經典Wnt信號通路，也稱Wnt/β-catenin信號通路，是最早發現的Wnt信號通路，因此被稱為經典Wnt信號通路。它最大的特點是由該通路的關鍵分子β-catenin來介導。

在正常狀態下，Wnt信號通路處于關閉狀態。細胞質中的β-catenin被由支架蛋白Axin、腺瘤息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、糖原合酶激 酶 -3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）和 酪蛋白激酶1（casein kinase1，CK1）等蛋白組成的降解復合體磷酸化后，被β-轉導素重復序列包含蛋白（β-transducin repeat containing protein，β-TrCP）泛素化［4］。隨后，泛素化的β-catenin被蛋白酶體識別并快速降解，在細胞中維持較低水平［5］。而這時在細胞核中，T細胞因子/淋巴樣增強因子（T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）與共阻遏因子Groucho（人類中同源蛋白為TLE）結合，并募集去乙酰化酶如 HDAC1（果蠅中為Rpd3），催化靶基因區域組蛋白去乙酰化，從而抑制靶基因表達［6-7］。除了Groucho外，Dact1、Osa、Mtgr1、TIS7和CtBP等分子也參與靶基因表達的抑制過程［8］。

當受到外界刺激（如損傷、病原體、激動劑等）時，Wnt蛋白與細胞膜上的兩種跨膜蛋白——Frizzled家族受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related proteins5/6，LRP5/6）（果蠅中同源物為Arrow）的胞外結構域結合后，形成Wnt-Frizzled-LRP5/6三聚體復合物，激活Wnt信號通路［9-14］。其中，Frizzled通過Disheveled（Dvl）的PDZ和DEP結構域募集并磷酸化Dvl。磷酸化的Dvl通過DIX同源結構域相互作用，將Axin募集到質膜上［15-16］。此外，由于GSK- 3和CK1與支架蛋白Axin存在互作，因此一起被募集到質膜上。LRP5/6胞質區包含保守的5個PPPSPxS基序，在Wnt刺激后PPPSP被GSK-3磷酸化，xS被CK1磷酸化。磷酸化的5個PPPSPxS基序同時為Axin分子提供結合位點，導致Axin去磷酸化降解。此外，Wnt刺激也會導致GSK-3的活性受到抑制，但其具體機制仍存在爭議［14］。Axin、GSK-3和CK1的膜轉移導致APC從降解復合體中分離，并使降解復合體解聚，因此 β-catenin 的降解被抑制［11，17］。穩定的β-catenin在細胞質中積累并在Twa1的作用下轉移至細胞核，取代Groucho并與BCL9、Pygopus、CREB結合蛋白等轉錄共激活因子形成復合物，同時與TCF/LEF轉錄因子結合，使TCF/LEF從抑制狀態轉變為激活狀態，以細胞特異性方式啟動下游靶基因如cyclinD1、c-myc和metalloproteinase的轉錄，進而誘導后續細胞反應的發生［18-21］。

雖然以上經典模型已被普遍接受，但對于降解復合體是如何被Wnt信號調節的仍存在很大爭議。Lybrand等［22］認為Wnt刺激改變了降解復合體的構象而導致其失活。也有報道稱β-catenin泛素化失敗是Wnt信號通路激活的主要事件。Wnt與其受體的互作并不改變降解復合體的組成，且不影響其激酶活性，甚至β-catenin仍然與降解復合體結合，而唯一的變化是β-TrCP從降解復合體中解離。因此，β-catenin不再被泛素化和降解，從而使Axin達到飽和［23］。此外，TCF/LEF由抑制狀態轉變為激活狀態也有多種模型［8］。有研究表明，β-catenin也可以不依賴TCF/LEF轉錄因子，而是由Oct-4等作為下游轉錄因子來調節靶基因的轉錄［24-25］。針對不同應答，Wnt信號通路可能有不同的調節方式。以上都體現了經典Wnt信號通路的復雜性。

1.2 經典Wnt信號通路主要成員

1.2.1 Wnt Wnt是一類疏水性分泌型糖蛋白，由果蠅中的 Wingless（Wg）基因和小鼠中同源基因Int共同命名［26］。自1982年Nusse首次從小鼠乳腺癌中克隆出Wnt基因以來，目前已從不同物種中分離出許多Wnt基因，由這些基因組成Wnt家族［27］。哺乳動物基因組中存在19個Wnt基因，分為12個亞家族。節肢動物中，果蠅的Wnt基因研究最為全面，它有7個Wnt基因，而凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）則有12個Wnt基因亞家族。有趣的是，Wnt3在哺乳動物中不存在，而WntA在節肢動物中不存在［28］。

Wnt蛋白含有350-400個氨基酸，其中包括22或24個保守的半胱氨酸殘基，這些殘基通過11或12個分子內二硫鍵的形成對蛋白質進行適當折疊，這對Wnt蛋白的內源性疏水很重要［28-29］。新合成的Wnt在內質網中被Porcupine（PORCN）棕櫚酰化，之后被轉運蛋白Wntless釋放到胞外。Wnt蛋白在Wnt信號通路中起配體的作用，其通過分泌作用與細胞膜上受體結合來激活Wnt信號通路。在個體不同生長、發育階段和免疫應答中Wnt基因有不同的表達模式，并且不同的Wnt蛋白可以與相同的受體發生不同的相互作用［18］，這也為Wnt信號通路的多樣化提供了條件。許多Wnt信號通路的抑制分子可通過拮抗Wnt來抑制Wnt信號通路，包括Dkk1、sFRP1-5、Wif1、Cerberus、Wise/SOST 和 Dickkopf家族蛋白［30-31］。

1.2.2 β-catenin Armdillo蛋白家族成員β-catenin是Wnt經典信號通路最為關鍵的信號轉導因子，起樞紐作用。β-catenin最先在1990年作為哺乳動物細胞黏附復合體被發現，它可與鈣黏蛋白（cadherin）相互作用，參與細胞黏附和構成細胞骨架組織，即它還具有結構功能［32-33］。在大多數動物物種中，結構功能和信號傳導功能由一種β-catenin行使。然而在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中，由不同種類的β-catenin分別行使這兩種功能［34］。有研究發現，β-catenin參與黏附或Wnt信號通路是由其分子形式所決定的，而不是簡單的TCF/LEF和cadherin對一種分子形式β-catenin的競爭［35］。

果蠅中β-catenin的同源物叫Armadillo，人類中叫CTNNB1。β-catenin的特征結構域有：N末端、中 間 12個 連 續 的 Armadillo/β-catenin-like（ARM）重復域、C末端［34］。其中，N末端富含Ser/Thr殘基，含有保守的GSK-3及CK1磷酸化位點，控制著β-catenin的穩定性。ARM重復域被證明可以與多種蛋白質結合，如TCF/LEF、ICAT、Axin、APC、E-cadherin等，是β-catenin的核心區域。ARM重復域的晶體結構表明，每個ARM重復由3個螺旋組成，分別為H1、H2、H3［36］。C末端為轉錄激活區域，可與IRF3等轉錄因子結合促進轉錄的起始和延伸［37-38］。β-catenin的這些保守結構域與它在經典Wnt信號通路中的核心作用是密不可分的。經典Wnt信號通路激活時，β-catenin在細胞質內積累并入核，細胞核內的β-catenin與TCF/LEF結合調節下游靶基因的轉錄。而當信號通路閉合時，β-catenin在細胞質內被大量降解而失活。

1.2.3 降解復合體 降解復合體由Axin、APC、GSK-3、CK1等蛋白組成。降解復合體在Wnt信號通路中通過調節關鍵分子β-catenin的磷酸化水平來調控信號傳導。在Wnt信號通路閉合時，細胞質中的降解復合體將β-catenin磷酸化來促進β-catenin的降解。而當Wnt信號通路激活時，降解復合體失活，β-catenin不能被磷酸化而在胞質中大量積累。因此，降解復合體是Wnt信號通路的關鍵負調控因子。

1.2.3.1 Axin Axin參與代謝、神經系統發育、腫瘤發生發展等多種過程［39］。Axin蛋白的N端和C端分別包含一個RGS結構域和一個DIX結構域。RGS結構域與APC結合，DIX結構域與Dvl結合。Axin中心區域包含了β-catenin、GSK-3、CK1等許多蛋白相互作用的位點。

Axin通過介導多種信號復合物的形成，在多種信號通路中發揮重要作用，如Wnt/β-catenin、TGF-akt、JNK和p53，尤其在Wnt/β-catenin信號通路中的作用最為突出［40］。在經典Wnt信號通路中，Axin可與復合體中的其他成員（APC，CK1和GSK-3）以及β-catenin直接結合，因此是降解復合體的中心支架，同時也是降解復合體的限速因子［23］。Axin的磷酸化會改變其構象，從而增強與降解復合物中其他組分的結合，并且可通過去磷酸化來逆轉。Wnt信號通路關閉時，Axin被磷酸化，這些磷酸激酶包括 GSK-3、CK 1、Cyclin A/CDK2和 CDK5。Wnt刺激后，Axin去磷酸化，磷酸酶包括PP2A、PP2C和PP1［40-41］。在正常細胞中，Axin在細胞質和細胞核之間不斷穿梭，這有助于β-catenin的細胞質定位［42］。

1.2.3.2 APC APC是一種腫瘤抑制因子，Wnt信號轉導異常激活導致的結直腸癌大部分是由APC的失活引起的。在Wnt信號轉導的經典模型中，APC主要是在降解復合體中起作用，靶向轉錄共激活因子β-catenin 磷酸化并使其降解［41］。

和Axin一樣，APC在細胞質和細胞核間穿梭。APC的N端和中心區域包含功能性核輸出信號和核定位信號。APC的中心區域由3個含15個氨基酸和7個含20個氨基酸的重復序列組成，其中含15個氨基酸的序列與β-catenin結合，而含20個氨基酸的序列則介導β-catenin下調［43］。當Wnt信號通路關閉時，APC被GSK-3和CK1磷酸化，磷酸化的APC對β-catenin的親和力增強，促進β-catenin募集到降解復合體上。APC與β-catenin的結合促進了 GSK-3對 β-catenin的磷酸化［44］。APC 不僅在降解復合物中是必須的，而且在Wnt刺激后促進Axin構象的快速轉變以及隨后Axin與LRP5/6/Arrow的互作［41］。

1.2.3.3 CK1 CK1是所有真核細胞共有的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶家族［45］。到目前為止，至少有7種哺乳動物CK1亞型（α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε）及其各種剪接體，它們參與細胞膜運輸、晝夜節律、細胞周期進程、染色體分離、細胞分化和凋亡等多種細胞過程［46］。所有CK1家族成員具有高度保守的激酶結構域，但在其N末端和C末端非催化結構域存在顯著差異。CK1只使用ATP作為磷酸供體，通常不依賴于輔因子［47］。

在Wnt信號通路中，CK1既是負調節因子也是正調節因子。作為負調節因子，CK1在S45位點磷酸化β-catenin，從而啟動GSK-3介導的β-catenin磷酸化，CK1也通過磷酸化修飾Axin和APC促進β-catenin的磷酸化降解。CK1通過磷酸化修飾Dvl和TCF3充當Wnt信號通路的正調節劑［46］。除了Wnt信號通路外，CK1還被認為在JNK和刺猬（Hh）信號通路中起到重要作用［47］。對于底物的調節，CK1更傾向于預先對其磷酸化促進其活化。此外，CK1還可通過自磷酸化修飾來調節自身活性［48］。

1.2.3.4 GSK-3 GSK-3是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，最初被發現可將糖原合成酶磷酸化而被鑒定為參與糖原代謝的激酶［49］。近年來，GSK-3被發現參與調節多種信號通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路、Wnt信號通路、Hh信號通路和Notch信號通路，并參與從糖原代謝到細胞周期調節以及細胞增殖等一系列細胞過程［50-51］。

GSK-3由兩個基因編碼兩種不同的亞型：GSK-3α和GSK-3β。它們的催化結構域幾乎相同，但它們的C端序列不同，并且GSK-3α包含一個富含甘氨酸的N端區域，而在GSK-3β中卻不存在。與其他蛋白激酶相比，GSK-3的一個特點是其底物通常需要被另一個激酶預磷酸化活化［52］。在細胞中，一小部分（＜5%-10%）的GSK-3參與組成降解復合物［50］。當Wnt信號通路處于非激活狀態時，CK1先將β-catenin的Ser45位點磷酸化，隨后GSK-3依次磷酸化β-catenin的Thr 41、Ser37和Ser 33位點，之后通過蛋白酶體介導的降解使β-catenin在細胞質中維持較低水平［53］。Wnt信號通路激活時，復合體中的GSK-3和CK1將LRP5/6磷酸化，隨后Axin被募集到磷酸化的LRP5/6上［54-55］。

2 非經典Wnt信號通路

不同于經典Wnt信號通路，非經典Wnt信號通路并不依賴β-catenin激活下游分子，而通過Dvl將信號傳遞給其他分子。它在調節細胞極性和遷移方面具有顯著的作用。并且一般認為，與經典Wnt信號通路通過Wnt1類型（Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a和 Wnt8b）起 始 信號不同，非經典Wnt信號通路的配體為Wnt5a類型（Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt9b、Wnt11 和 Wnt16）［30，56-58］。 其 中 一 些 Wnt分子 會參與兩種Wnt信號通路，誘導不同的細胞反應，如Wnt5a［59］。非經典Wnt信號通路一般包括Wnt/PCP信號通路和Wnt/Ca2+信號通路。

Wnt/PCP信號通路首先在黑腹果蠅中被發現，控制著翅膀上毛發和眼睛內小平面的方向［60］。在脊椎動物中Wnt/PCP又稱Wnt/Jun信號通路，控制組織極性與細胞運動，并與胚胎發生和癌變有關。Wnt/PCP信號通路通過激活RhoA、c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和Nemo樣激酶（Nemo-like kinase，NLK）信號通路將信號傳導至下游。與脊椎動物中激活Wnt/PCP信號通路需要Wnt不同的是，果蠅Wnt/PCP信號通路的激活并不需要Wnt的同源基因wg［61］。激活的Frizzled家族受體和輔受體ROR2、RYK將信號傳遞至胞內，隨后激活Dvl。Dvl可以通過兩種小GTP酶RhoA和Rac傳遞信號，其中RhoA是細胞骨架結構的關鍵調控因子。從Dvl到RhoA的信號傳導需要Formin同源蛋白Daam，Daam結合Dvl和RhoA，介導Dvl-RhoA復合物的形成。RhoA繼而激活Rho相關蛋白激酶，影響細胞骨架的形成和細胞運動。另外，Dvl還可激活另一種小GTP酶Rac，隨后通過Rac -PAK-MAP3KMAPKK4/7信號級聯磷酸化激活JNK信號通路，最終影響靶基因轉錄［56，62-63］。除了依賴Dvl的RhoA和JNK信號通路外，NLK信號級聯可通過不依賴Dvl的方式被Wnt/PCP信號通路激活。與Frizzled偶聯的G蛋白介導Ca2+釋放，之后激活TAK1，繼而激活NLK信號級聯。由于激活的NLK負調節經典Wnt信號通路，因此Wnt/PCP信號通路的激活導致經典Wnt信號通路被部分抑制。此外，PCP信號通路還包括許多其他成分，如Vangl、Celsr、PTK7等，這些分子在脊椎動物中的具體作用尚未確定。在 果 蠅 中，Frizzled、Vang、Stan、Dvl、Prickle和Diego是Wnt/PCP的核心分子，它們組成了Frizzled-Dvl-Diego-Stan和Vang-Prickle兩種復合體。這兩種復合體在翅膀或眼睛中的不對稱分布導致了組織極性的建立。另外，Diego和Prickle競爭性結合Dvl，Diego通過與Dvl結合正向調節Wnt/PCP信號通路，而Prickle通過阻止Diego與Dvl的結合負向調節Wnt/PCP 信號通路［64］。

Ca2+作為一種普遍存在的第二信使，調控著廣泛的細胞生物學過程，包括肌肉收縮、神經傳導、細胞生長或增殖和酶活性調節等［65］。Wnt/Ca2+信號通路以G蛋白依賴的方式刺激細胞內Ca2+的釋放并激活一些激酶，以調節細胞運動和細胞黏著性，但G蛋白在信號通路中的作用尚不清楚［66］。Wnt/Ca2+信號通路主要由Wnt5a和Wnt11激活，并且Frizzled-2比Frizzled-1更能誘導Ca2+的釋放。首先，Wnt5a/Wnt11與細胞膜上的Frizzled結合后導致Dvl活化，之后激活磷脂酶C（phospholipase，PLC），PLC水解質膜上的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸導致三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）的濃度增加。IP3通過胞質溶膠擴散，與內質網上的鈣通道互作，促進Ca2+的釋放。此外，5HTIC也以G蛋白依賴的方式刺激細胞內Ca2+的釋放［67］。Ca2+和鈣調蛋白一起激活兩種鈣敏感激酶——鈣調蛋白激酶II（Ca2+-calmodulindependent protein kinase II，CaMKII）和蛋白磷酸酶calcinurin（Cn）。其中，CaMKII已被認為在許多生物過程中發揮作用，如哺乳動物卵母細胞成熟，神經遞質合成和釋放。CaMKII被激活后自磷酸化，之后顯示出Ca2+獨立的自主活性［59］。激活的CaMKII和Cn之后又激活核轉錄因子NF-κB和NFAT。另外，當質膜上DAG濃度升高，細胞質中的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）被結合到質膜上，然后在Ca2+的作用下被激活，激活的PKC繼而激活NF-κB和CREB。Ca2+內流和PKC激活又進一步反饋調節Dvl的磷酸化，使Wnt/Ca2+信號通路被持續激活［68］。之后，NFAT、NF-κB和CREB轉移到細胞核并調控下游基因的轉錄。值得注意的是，NFAT、NF-κB和CREB均被發現在免疫調節中起關鍵作用［69-71］。此外，Wnt/Ca2+信號通路可能還以鈣依賴的方式激活磷酸二酯酶6，導致環鳥苷單磷酸的降低［72］。

也有研究發現，Wnt9b可與受體PKD1/TRPP2復合體的胞外域結合激活Wnt/Ca2+信號通路，之后PKD1與Dvl相互作用將信號傳遞至下游，而TRPP2可介導Ca2+內流而不依賴于Frizzled和LRP5/6［58］。這種差異可能是由Wnt分子不同而造成的。雖然一般認為LRP5/6不參與非經典信號通路，但也有報道LRP5/6可能參與非經典Wnt信號通路，并可能以復雜的方式抑制或協同作用［73-74］。

除了上述兩種非經典Wnt信號通路外，還有Wnt-RAP1、Wnt-ROR2、Wnt-PKA、Wnt-GSK3MT、Wnt-aPKC、Wnt-RYK和Wnt-mTOR 等非經典Wnt信號通路類型。不同Wnt信號通路之間由于共用一些受體和胞內信號傳導蛋白而可能互相交叉或重疊，且能通過對Dvl的競爭而互相拮抗［75］。

3 Wnt信號通路在無脊椎動物天然免疫中的功能

近年來，病原與宿主的相互作用，特別是宿主對外來入侵物的免疫應答受到了越來越多的關注［76］。不同于脊椎動物，無脊椎動物缺乏適應性免疫系統，僅依靠天然免疫系統抵御病原體的侵染。因此，天然免疫也成為了脊椎動物和無脊椎動物所共有的第一道防線，有時也是最重要的一道屏障，它包含復雜的信號通路網絡來調控免疫應答。

對于無脊椎動物參與天然免疫的信號通路，以Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路、免疫缺陷（immune deficiency，IMD）信號通路和Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信號通路研究較多，而Wnt信號通路鮮有報道。然而，在脊椎動物中已有大量研究表明Wnt信號通路在宿主和病原體的博弈中發揮了關鍵作用。其中，Wnt信號通路不僅有助于增強宿主對病原體侵染的抵抗力，并且由于病原體與宿主的協同進化，病原體也已經進化出了脅迫Wnt信號通路的相關策略，以促進感染和提高在宿主中的生存能力［77-78］。

3.1 病毒免疫

目前，Wnt信號通路在脊椎動物病毒免疫中的研究已經較為深入。現有研究表明，在人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type3，BPI-V3）、人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）等多種病毒感染中，Wnt信號通路都扮演了重要角色。而在無脊椎動物中，Wnt信號通路參與的抗病毒天然免疫研究主要集中在對抗白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）中［4，79-80］。

WSSV是一種主要的蝦類病原體，在世界范圍內造成巨大的經濟損失［81］。目前，Wnt信號通路參與WSSV天然免疫的研究主要集中在凡納濱對蝦中。Zhang等［3］發現WSSV侵染凡納濱對蝦后，參與免疫防御的對蝦組織（血細胞、肝胰腺、鰓）中的LvWnt表達均受到不同水平調控，說明Wnt基因在凡納濱對蝦的天然免疫中發揮了重要的調控作用。最近有學者發現日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）受到WSSV侵染，Wnt基因表達譜也發生了顯著變化，這可能涉及到它的免疫防御［78］。除了Wnt之外，β-catenin也被證實參與凡納濱對蝦WSSV的免疫。有研究發現WSSV刺激凡納濱對蝦導致其體內Lv-β-catenin的表達先上調后略下調，敲除Lv-β-catenin增強了其對WSSV侵染的敏感性，表明β-catenin作為Wnt信號通路的關鍵調節因子在凡納濱對蝦抗病毒免疫中起到了積極作用［82］。隨后的研究又發現，宿主本身可通過調控促進Lv-βcatenin進入細胞核發揮抗病毒免疫功能。一旦利用GSK-3抑制劑IX激活Lv-β-catenin，則可顯著抑制病毒極早期基因WSSV069的轉錄。此外，研究還發現WSSV可以通過增加Lv-β-catenin的泛素化來影響Lv-β-catenin的表達水平，并通過其所編碼的極早期蛋白IE1與Lv-β-catenin相互作用，抑制其進入細胞核，從而限制其抗病毒免疫調控功能［83］。Chibby是Wnt/β-catenin信號通路的重要抑制劑分子，它能與TCF/LEF競爭結合β-catenin并抑制β-catenin的活性。Ruan等［84］采用實時熒光定量PCR檢測發現，WSSV可下調凡納濱對蝦體內Lv-Chibby基因的轉錄水平。進一步的研究證實Lv-Chibby能夠與Lv-β-catenin相互作用，并且Lv-Chibby增強了Lv-βcatenin與WSSV069之間的相互作用。此外，Ruan等［85］也發現在WSSV侵染后，調控Lv-β-catenin降解的上游分子Lv-GSK3β的轉錄和表達水平受到抑制，并且磷酸化水平下調。當Lv-GSK3β沉默時，WSSV基因ie1的轉錄受到抑制，WSSV誘導的血細胞凋亡也顯著上調，說明凡納濱對蝦通過抑制Lv-GSK3β的表達，促進細胞凋亡，進而抑制WSSV感染。綜合以上研究表明，Lv-β-catenin是凡納濱對蝦抗病毒免疫的重要調控分子。此外，有報道稱β-catenin也參與日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）對WSSV 的免疫應答［86］。

近年來，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）作為一種無脊椎動物的模式生物，其天然抗病毒免疫涉及Wnt信號通路已被證實。Du等［87-88］根據克氏原螯蝦轉錄組測序結果，通過對實驗組（WSSV侵染）與對照組的差異表達基因進行KEGG通路分析，篩選出一些與天然免疫相關的經典信號通路，如Wnt信號通路、JAK-STAT信號通路、胰島素信號通路等。之后，Yi等［89］使用RNA-seq對克氏原螯蝦WSSV感染的易感個體、病毒抗性個體進行比較轉錄組分析，發現易感個體中下調、抗性個體中上調的基因在Wnt信號通路中明顯富集，即克氏原螯蝦Wnt信號通路參與WSSV侵染后的免疫應答。

除甲殼類動物外，WSSV也能被果蠅的S2細胞系識別并吞噬。研究發現，活的WSSV能被果蠅S2細胞吞噬而不能被消化，說明WSSV本身能夠破壞宿主細胞免疫系統，阻止其吞噬體的成熟。然而肽聚糖和脂多糖可激活S2細胞表面的受體，促進吞噬體成熟，從而使WSSV病毒粒子被完全成熟的吞噬體吸收和消化。dally作為一種細胞表面蛋白多糖，可調節Wnt信號通路［90］。基因表達譜顯示，dally介導Wnt信號通路參與了S2的吞噬作用。dally的沉默顯著抑制了果蠅S2細胞系中吞噬體的成熟，表明dally介導的Wnt信號通路可能是吞噬作用的關鍵［91］。

值得一提的是，在對家蠶（Bombyx mori）核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedro virus，BmNPV）的研究中也發現Wnt信號通路參與了抗病毒免疫過程。Zhang等［92］使用全基因組和轉錄組分析，檢測在有或沒有BmNPV感染的家蠶細胞中長鏈非編碼RNA（IncRNA），microRNA（miRNA）和mRNA的表達情況，在差異表達的RNA之間構建了IncRNA-miRNA-mRNA的調控網絡，并采用KEGG分析來預測差異表達miRNA的靶基因，結果顯示差異表達的IncRNA參與調節49條信號通路，其中前20位信號通路中包括Wnt信號通路。

另外，非經典Wnt信號通路也被證實參與無脊椎動物的先天免疫調節。Wnt5b作為非經典Wnt信號通路的配體，啟動非經典Wnt信號通路。Wang等［93］發現凡納濱對蝦感染WSSV后，LvWnt5b轉錄水平下調，敲低LvWnt5b可抑制WSSV基因ie1的轉錄水平，提示LvWnt5b介導的Wnt信號通路可能在WSSV感染的防御中發揮作用。在HEK293T細胞中過表達LvWnt5b可抑制caspase3/7的活性，進一步證明了LvWnt5b在抑制細胞凋亡中的作用。該研究表明，凡納濱對蝦可能通過下調LvWnt5b的表達，促進細胞凋亡來抵御WSSV的侵染。Cdc42作為Rho GTP酶的一個重要成員，參與Wnt非經典信號通路的調控［94］。在日本囊對蝦受到WSSV侵染時，MjCdc42的表達顯著上調。通過RNA干擾和注射Cdc42抑制劑抑制MjCdc42的表達可使WSSV的復制增加。由此證明MjCdc42具有抑制WSSV增殖的功能。進一步實驗發現MjCdc42通過抑制精氨酸激酶（MjAK）來抑制宿主體內病毒的復制和擴增［95］。

3.2 細菌免疫

Wnt信號通路最近已被證明可以控制與人類細菌感染相關的過程，并發現了一些激活或抑制Wnt信號通路的藥物來調節Wnt信號通路，以此增強宿主免疫［96］。在無脊椎動物中，無論在抗革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌中，Wnt信號通路都在其中起到關鍵作用。

3.2.1 革蘭氏陰性菌免疫 副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）是一種常見的革蘭氏陰性菌，是多種水生生物的主要病原菌。Wnt受體Frizzled、Wnt轉運蛋白Wntless均被報道在副溶血弧菌侵染羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）中參與天然免疫應答［97-98］。另外，Zhang等［82］通過副溶血弧菌侵染凡納濱對蝦發現，Lv-β-catenin在抗副溶血弧菌侵染中起積極作用，并且首次證實了對蝦中β-catenin可調節抗菌肽（AMP）的轉錄。此外，2020年，Jin等［99］用副溶血弧菌感染擬穴青蟹（Scylla paramamosain），在感染后進行了小RNA測序，并比較了無弧菌和受弧菌感染的青蟹中miRNA的表達譜，以表征差異表達的miRNA。結果顯示差異表達的46個miRNA中，其中5個miRNA靶向Wnt信號通路。

嗜水氣單孢菌（Aeromonas hydrophila）為典型的人、獸、魚共患病原菌。受嗜水氣單孢菌感染的羅氏沼蝦，體內Wntless升高，敲低Wntless導致蝦累積死亡率顯著升高。以上結果說明Wntless參與蝦抗嗜水氣單孢菌的免疫調控［98］。Xie等［86］發現，感染鰻弧菌（Vibrio anguillarum）的日本囊對蝦組織中β-catenin的轉錄水平上升，這是首次發現蝦體內的β-catenin參與了鰻弧菌的免疫應答。王菲等［100］對家蠶免疫穩態調控分子進行了首次報道，家蠶被大腸桿菌（Escherichia coli）感染后，免疫組織如脂肪體、體壁和中腸中BmWnt1基因的轉錄水平與未感染的家蠶相比均顯著下調，提示家蠶中的Wnt1基因可能與其天然免疫調控密切相關。

除了上述經典Wnt信號通路外，非經典Wnt信號通路也被證實參與無脊椎動物抗菌天然免疫。Wnt4和Wnt16都屬于非經典Wnt信號通路的配體。最近一項研究發現，日本沼蝦受副溶血弧菌侵染后，胃中Wnt的轉錄水平升高，并且減少Wnt4和Wnt16的表達可顯著抑制副溶血弧菌侵染后蝦胃中抗菌肽的表達。這表明Wnt基因家族可能通過調節抗菌肽的合成，參與機體對弧菌感染的天然免疫應答［78］。RhoA作為非經典Wnt/PCP信號通路的重要成員，也被證實參與天然免疫。研究顯示，當日本囊對蝦感染鰻弧菌時，MjRhoA在血細胞與心臟中的表達水平顯著上調。利用RNA干擾抑制MjRhoA的表達水平后，對蝦清除細菌的能力與對蝦的存活率均明顯降低。這些結果證實MjRhoA在體內具有調控抵抗細菌感染的能力［95］。

3.2.2 革蘭氏陽性菌免疫 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革蘭氏陽性菌的代表，廣泛分布于自然界。有研究稱，感染金黃色葡萄球菌的日本囊對蝦體內β-catenin異常上調，之后通過RNA沉默實驗證實β-catenin是蝦抗菌免疫所必須的［50］。Kim等［101］研究發現，在秀麗隱桿線蟲中，β-catenin同源基因BAR-1的缺失導致了不完全的免疫反應和對糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、金黃色葡萄球菌的異常易感性。益生菌嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）NCFM菌株可顯著增強秀麗隱桿線蟲對革蘭氏陽性病原體的宿主防御反應，這種調節作用通過激活宿主相關免疫信號通路實現，這些信號通路包括 Wnt、TIR-1、PMK-1［101］。此外，在日本沼蝦中也發現Wnt基因可能參與抗金黃色葡萄球菌的免疫應答［78］。

王菲等［100］在被黑胸敗血芽孢桿菌（Bacillus bombyseptieus）感染后的家蠶幼蟲血細胞和頭部中檢測到BmWnt1基因的高水平表達，但此高水平的表達量迅速下降，并不能持續。與此形成對比的是，在其他免疫組織中所檢測到的BmWnt1的轉錄水平均為非感染時的50%以下。該研究表明家蠶Wnt家族成員參與了免疫穩態調控，并且Wnt可能通過調控抗菌肽等效應分子的產生參與免疫應答。

3.3 其他病原體免疫

除了病毒和細菌外，Wnt信號通路還參與了其他病原體的天然免疫，如真菌、線蟲和螺原體等。

受白僵菌（Beauveria bassiana）感染的家蠶，其脂肪體、體壁和中腸中的BmWnt1轉錄水顯著下降，表明Wnt1可能涉及家蠶的天然免疫應答［100］。Arefin 等［102］用異小桿線蟲（Heterorhabditis bacteriophora）及其共生菌發光桿菌（Photorhabdus luminescens）感染果蠅后對果蠅進行全基因組轉錄測序，并將所有差異調節的轉錄本映射到KEGG數據庫，發現Wnt信號通路、泛素介導的蛋白水解、卵母細胞成熟信號通路的富集最為顯著，其中泛素介導的蛋白水解也與Wnt信號通路相關。

中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma eriocheiris）是引起中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）震顫病的一種致死性病原體。Wang等［103］向中華絨螯蟹體內注射中華絨螯蟹螺原體，同時用只注射等量PBS的中華絨螯蟹作為對照組。獲得cDNA后使用Illumina HiSeq 2500測序平臺對兩組的血細胞進行轉錄組分析，并通過KEGG通路分析鑒定了一些經典的免疫相關信號通路，包括Wnt信號通路、MAPK信號通路、VEGF信號通路等。之后Hou等［65］也證實Wnt信號通路參與中華絨螯蟹的螺原體免疫。首先，使用Illumina HiSeq 2500獲得了實驗組和對照組的胸神經節轉錄圖譜，之后通過RPKM分析篩選出差異表達的基因。與對照組相比，實驗組Wnt信號通路、Ca2+調節相關過程等基因的轉錄水平發生了顯著變化。一方面，實驗組3種Frizzled的轉錄水平均發生了顯著下調，提示中華絨螯蟹螺原體的入侵可能通過抑制Wnt信號通路，降低宿主免疫應答，促進自身感染。另一方面，與Ca2+調節相關基因如IP3R、ERp44、Syt均顯著下調，而Ca2+調節與非經典Wnt/Ca2+信號通路密切相關，提示螺原體通過干擾Ca2+調節，抑制Wnt/Ca2+信號通路，影響神經遞質的釋放，從而導致神經信號紊亂［65］。因而確定經典Wnt信號通路和非經典Wnt/ Ca2+信號通路為中華絨螯蟹胸神經節應答中華絨螯蟹螺原體感染的關鍵途徑。

4 Wnt信號通路與其他信號通路的交聯及潛在功能

生物體中，各信號通路之間密切交織。這種由多條信號通路形成的網絡有利于不同分子、不同細胞之間的通訊，從而可以迅速有效地對外界變化做出快速響應。在無脊椎動物中，已有相關研究表明信號通路之間可通過相互交聯調控機體的免疫功能。在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中，Toll和IMD信號通路可協同誘導AMP的表達，激活先天免疫應答［104］。Toll、IMD和JAK/STAT是無脊椎動物參與天然免疫的3條主要信號通路，它們在進化中具有廣泛的保守性，且它們都與Wnt信號通路存在密切關聯，這可能提示Wnt信號通路參與更多的天然免疫調控。

Toll信號通路主要由革蘭氏陽性菌或真菌激活，其在無脊椎動物天然免疫中的功能已被大量報道［105］。Toll及其同源物TLR是病原體識別過程中重要的模式識別受體（PRR），由它們介導的Toll信號通路可使NF-κB活化后進入細胞核與κB結合，調控抗菌肽、干擾素等免疫相關基因的表達［106-108］。果蠅Toll信號通路能有效抑制果蠅X病毒（DXV）的復制，控制念珠菌（Candida glabrata）等真菌感染［109-110］。皺紋鮑魚（Haliotis discus）的 TLR 在副溶血弧菌、李斯特菌（Listeria monocytogenes）和出血性敗血癥病毒（hemorrhagic septicemia virus）感染后表達量上調［111］。此外，在梭子蟹（Portunus trituberculatus）、厚殼貽貝（Mytilus coruscus）、水螅（Hydra）等無脊椎動物中都有報道顯示Toll信號通路參與天然免疫［112-114］。已有一些研究證明了Wnt信號通路與Toll信號通路之間存在交聯。有研究表明，介導Toll信號通路的NF-κB轉錄因子p65在受刺激的巨噬細胞中促進Wnt5a的表達［115］。巨噬細胞的天然免疫功能至少部分是通過Wnt5a-Frizzled5-NF-κB（p65）信號級聯來實現的，p65又反饋維持Wnt5a的表達。該信號級聯不僅維持基礎水平的免疫防御，還調節免疫相關蛋白CD14的表達，CD14與TLR2共同作用，有助于識別和控制李斯特菌的感染［116］。而且p65作為IRF3的轉錄共激活劑可誘導IFN的合成［1］。此外，Wnt1通過與Scavenger受體A結合，增加NF-κB蛋白水平，促進IL-6，TNF-α 和 iNOS的分泌［117］。Wnt3a和 Wnt5a分別是經典和非經典Wnt信號通路的配體。在鼠巨噬細胞內發現，Wnt3a和Wnt5a均有能力誘導炎癥細胞因子的產生，其對炎癥反應的影響呈TLR4依賴性。但Wnt3a和Wnt5a抑制TLR2和TLR9刺激下的細胞因子的產生。有趣的是，使用Wnt信號通路抑制劑并不能抑制Wnt3a和Wnt5a誘導的巨噬細胞因子的產生，這說明Wnt3a和Wnt5a誘導的巨噬細胞炎癥反應可能不是典型Wnt與Wnt受體相互作用的結果［118］。WntD為果蠅Wnt家族的一員，在調節抗菌基因轉錄中有積極作用。但WntD不是經典Wnt信號通路的配體，其可能通過非經典Wnt信號通路發揮作用。Gordon等［119］證明了WntD的表達是由Toll信號通路誘導的。通過基因敲除發現，WntD功能缺失突變體具有免疫缺陷并且Toll/Dorsal信號升高，說明WntD負反饋調節Toll信號通路。激活Toll信號通路可使果蠅更容易受到病毒感染，因此我們推測，WntD可能通過抑制Toll信號通路，在果蠅抗病毒免疫中發揮積極作用。

IMD信號通路主要被革蘭氏陰性菌激活，它是除Toll信號通路外另一條介導NF-κB的信號通路。IMD 與 Toll信號通路在功能上互補［108］。Yokoi等［120］發現，赤擬谷盜（Tribolium castaneum）中IMD信號通路有助于防御陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。又有研究發現，大腸桿菌DH5α注射侵染后會迅速激活橘小實蠅IMD信號通路的免疫反應［121］。另外，還有許多研究均證實IMD信號通路在不同無脊椎動物天然免疫中的重要功能。Wnt/PCP信號通路中的TAK1可以激活IMD信號通路關鍵組分Relish，這為Wnt和IMD信號通路的交聯提供了直接證據。此外，已有不少證據表明Wnt與NF-κB存在密切聯系。β-catenin除了調節Wnt信號通路外，還參與NF-κB靶基因的調控，如IL-6和Wnt16［122］。由非經典Wnt信號通路成員Rac1激活NF-κB可驅動腸道干細胞增殖和結直腸癌的發生［123］。并且IMD和與Wnt信號通路密切交織的Toll信號通路之間的串聯已被報道。Nishide等［124］通過RNAi實驗揭示了IMD和Toll信號通路之間顯著的功能交聯。IMD信號通路和Toll信號通路的RNAi均抑制了這兩條信號通路效應分子的上調。另一方面，Wnt信號通路與JNK信號通路之間存在信號級聯。在非經典Wnt/PCP信號通路中，Wnt可通過激活小GTP酶Rac將信號傳導至JNK信號通路。而JNK信號通路介導IMD通路。有研究發現JNK可以通過PDGFP和Pvr反饋抑制IMD信號通路。并且IMD信號通路的激活促進了Pvr配體Pvf2和Pvf3的JNK依賴性表達，進而通過Pvr-ERK減弱IMD信號通路［125］。此外，由此判斷Wnt信號通路與IMD信號通路的密切關聯，也因此推斷Wnt信號通路在天然免疫中有很大的潛能。

JAK/STAT是另一條涉及天然免疫的重要信號通路。研究表明，在波紋巴非蛤（Paphia undulate）中，JAK/STAT信號通路在細菌清除方面起著至關重要的作用［126］。另外，JAK/STAT信號通路還參與果蠅虹彩病毒6（Iridescent virus 6）、寄生蜂（Leptopilina boulardi）等多種病原體天然免疫［127-128］。STAT3是JAK/STAT信號通路的關鍵分子。先前的研究表明，Wnt信號可以刺激早期斑馬魚發育過程中STAT3的活性。之后，STAT3被證明是Wnt信號通路通過TCF4和LEF1的直接轉錄靶點，并且STAT3與LEF1存在直接相互作用。此外，在APC突變體中STAT3的表達和磷酸化水平增加［129］。在原代棕色前脂肪細胞中，STAT3在分化誘導期是必須的，STAT3的缺失會導致Wnt1、Wnt3a和Wnt10b的表達增加，STAT3的缺失可以通過抑制經典Wnt信號通路或敲除β-catenin來挽救。另有研究表明，Wnt3a可促進STAT3的核定位，Wnt1和Wnt3a可以提高胚胎干細胞中STAT3的基因表達和蛋白水平［130］。這兩條信號通路的交聯在癌癥中也有報道。AKT/β-catenin驅動的肝癌細胞中富含活化的STAT3，用JAK/STAT信號通路的小分子抑制劑處理肝癌細胞，可以使活性β-catenin減少，并且能夠有效地減輕 AKT/β-catenin 驅動的肝癌細胞形成和增殖［131］。以上研究均有力證明了JAK/STAT與Wnt信號通路之間的互作，這有助于更深入地了解Wnt信號通路的免疫調控功能。

除了上述信號通路，Wnt信號通路還與PI3K/AKT、MAPK/PKC、Hippo等多條信號通路存在交聯，共同組成免疫信號調控網絡［61，132-136］。

5 結語

Wnt信號通路在多種天然免疫相關過程中發揮重要作用，其正常的功能和調控對宿主至關重要。目前國內外對無脊椎動物Wnt信號通路涉及天然免疫的研究甚少，并且主要通過基因篩選的方法證明Wnt信號通路在天然免疫中的作用。即使有部分Wnt信號通路中的基因在體內得到了功能驗證，但其具體的功能機制仍不清楚，需要更深入的研究。Wnt信號通路與其他信號通路的串聯和合作有利于進行有效的免疫應答。現有研究發現Wnt與其他免疫相關信號通路如Toll、IMD、JAK/STAT等均有交聯。這些信號通路在無脊椎動物天然免疫中的研究較為廣泛和成熟，這有利于更好地發掘Wnt信號通路在無脊椎動物天然免疫中的功能。