白僵菌天然產物及其藥理活性和生物合成研究進展

謝麗媛，尹文兵，李 偉,3*，高 偉*

1首都醫科大學 中醫藥學院，北京 100069；2中國科學院微生物研究所，真菌學國家重點實驗室，北京 100101；3河南省科學院生物研究所有限責任公司，鄭州 450008

白僵菌屬(Beauveria)真菌屬于子囊菌門(Ascomycotina)糞殼菌綱(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)蟲草菌科(Cordycipitaceae)，是一類常見的昆蟲寄生菌。該屬中的球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant)感染或人工接種于蠶蛾科昆蟲家蠶(BombyxmoriLinnaeus)4～5齡的幼蟲后使其死亡而形成的干燥體稱為僵蠶，是一味傳統中藥，可用于肝風夾痰，驚癇抽搐，小兒急驚，破傷風，中風口，風熱頭痛，目赤咽痛，風疹瘙癢，發頤痄腮等。研究發現，白僵菌次級代謝產物是僵蠶活性的重要物質基礎，且具有較好的藥理活性和生物活性。研究人員對該屬真菌中的次級代謝產物及其生物合成途徑進行了廣泛的研究，迄今為止，已從該屬真菌中分離得到了多肽類、聚酮類、生物堿類、苯丙素類、萜類、核苷類等多種結構類型的化合物約158個，NCBI數據庫中公開了17個白僵菌菌株的基因組測序數據，白僵菌素、白僵菌交酯、球孢交酯、卵孢素及纖細素等活性分子的生物合成基因簇及其生物合成途徑也已得到闡明。本文就白僵菌屬真菌產生的天然產物、藥理活性及生物合成途徑等方面的最新研究成果進行全面的總結，為白僵菌來源的新結構活性天然產物的基因組挖掘以及已知重要活性分子資源的深入開發應用提供參考。

1 化學成分和藥理活性

1.1 多肽類化合物

多肽類化合物是白僵菌屬真菌產生的一類主要化合物類型，目前已發現大約78個多肽類化合物，包括核糖體多肽類(ribosomal peptides)和非核糖體多肽類(non-ribosomal peptides，NRPs)，研究較為廣泛的有白僵菌素(beauvericins)、白僵菌交酯(beauverolides)、球孢交酯(bassianolide)等。

1.1.1 核糖體多肽類化合物

核糖體多肽類化合物是核糖體以mRNA作為模板，利用20種常見的蛋白源氨基酸進行合成得到的產物(個別生物可利用硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸)?；衔?～14為從球孢白僵菌中分離發現的核糖體多肽類化合物(見圖1)，這些化合物為鐵載體及相關的衍生物，但其中僅含兩個(1、3～8)或三個異羥肟酸基團的化合物(14)顯示出鐵結合的活性[1]。

1.1.2 非核糖體多肽類化合物

非核糖體多肽類化合物是不依賴mRNA或其他RNA模板，利用蛋白源氨基酸或非蛋白源氨基酸，通過非核糖體肽合成酶進行催化合成，非核糖體肽合成酶中每個腺苷酰化結構域的特異性決定了被選擇和激活氨基酸的種類和數量。目前已經在白僵菌中分離得到約有64個NRPS類型的化合物，其中多為環縮肽類，代表性的六元環縮肽類化合物有白僵菌素(beauvericins)、isaridins、破壞素(destruxins)和isariins及其衍生物(見圖2)。

白僵菌素及其衍生物的核心結構由三個氨基酸殘基與三個羥基酸殘基交替連接構成，從白僵菌中分離得到的白僵菌素類化合物包括白僵菌素(15)、白僵菌素A～F(16～19、23、24)及其衍生物allobeauvericins A～C(20～22)。白僵菌素(15)從球孢白僵菌的菌絲體中首次分離得到，因其具有抗腫瘤、殺蟲、抗菌、抗病毒等多種藥理活性而得到廣泛研究。例如，白僵菌素對人乳腺癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤細胞均具有較好的藥理活性[2]，其抗癌作用機制與氧化應激[3]、刺激細胞內鈣離子濃度升高[4]、誘導細胞周期停滯[4-6]及細胞凋亡[2,5]、抑制腫瘤細胞遷移及腫瘤中新血管生成[2]等有關。白僵菌素還具有較好的殺蟲活性，可有效殺滅Aedesaegypti、Calliphoraerythrocephala、Leptinotarsadecemlineata、Lygusspp.等多種害蟲[7]。白僵菌素A～B(16、17)也是從球孢白僵菌中首次分離得到的，白僵菌素D～F(19、23、24)則是Beauveriasp.FKI-1366中分離得到，白僵菌素C(18)以及allobeauvericin A～C(20～22)則于Beauveriasp.中分離得到，這些化合物均具有較好的殺蟲活性，可有效殺滅蚊子幼蟲、蒼蠅、有色甲蟲等害蟲，白僵菌素A～B(16、17)和allobeauvericin A～C(20～22)對瘧原蟲均有較好的殺滅作用，其IC50分別為2.3、2.8、2.5、3.0和1.9 μM[8]。白僵菌素對人、動物和植物的多種病原菌均具有很強的抗菌活性，且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌無選擇性，其抗菌作用機制與細菌細胞壁無關，可能與細菌細胞器或某些酶系統有關[2]。白僵菌素雖無抗真菌活性，但當其與酮康唑或咪康唑合用時具有顯著的抗Candidaparapsilosis活性[2]；還可通過阻斷多藥外排和抑制全局調節劑TORC1激酶增強吡咯類抗真菌藥對耐唑類念珠菌的活性[9]。白僵菌素A、D～F(16、19、23、24)還可增強咪康唑的抗真菌活性，其中白僵菌素D(19)和白僵菌素E(23)可顯著增強咪康唑對氟康唑耐藥型白色念珠菌的活性[10]。白僵菌素還是一種強抗炎劑，可通過抑制Src和Syk來減弱NF-κB依賴性炎癥反應[11]，并通過抑制炎癥反應并誘導炎癥細胞凋亡來減輕哮喘[12]。此外，白僵菌素可通過有效抑制ACAT活性降低膽固醇[13]，還可通過抑制HIV-1整合酶來發揮抗HIV活性[14]。

Isaridin及其衍生物是由α-羥基酸、β-丙氨酸和另外四個α-氨基酸組成的六元環縮肽類化合物。目前從B.felina中分離得到isaridins A、B(25、26)、isaridin C2(27)、isaridins E-G(28、31、32)、desmethylisaridins C1、C2(29、33)、desmethylisaridin E(30)和desmethylisaridin G(34)10個isaridins類化合物[15,16]。研究發現，desmethylisaridin C1(33)具有一定的抗大腸桿菌活性，其MIC值為8 μg/mL[15]；而desmethylisaridin E(30)和desmethylisaridin C2(29)則可分別通過抑制超氧陰離子產生和抑制彈性蛋白酶釋放來發揮抗炎作用，其IC50值分別為10.00 ± 0.80 μM和10.01 ± 0.46 μM[16]。

破壞素及其衍生物基本結構中含一個羧基酸殘基和五個氨基酸殘基，從白僵菌B.felina中分離得到的破壞素及衍生物有destruxin A(35)、destruxin A1(36)、destruxin A4(37)、roseotoxin B(38)、[β-Me-Pro] destruxin E chlorohydrin (39)、chlorohydrin destruxin A4(40)、destruxin E chlorohydrin(41)、destruxin E diol(42)、destruxin Ed1(43)、desmethyldestruxin C(44)、destruxin C(45)、roseotoxin C(46)、destruxins B、B1(47、48)、homodestruxin B(49)、roseotoxin A(50)、destruxin C2(51)、destruxin D2(52)、destruxin E1(53)、destruxins D、D1(54、55)、destruxin F(56)、hydroxydestruxin B(57)、hydroxyhomodestruxin B(58)、[Phe3,N-Me-Val5] destruxin B(59)、pseudodestruxins B、C(60、61)在內的27種破壞素類化合物[17-19]。破壞素類化合物具有廣泛的殺蟲、植物毒性活性，例如：destruxin A(35)和destruxins B、B1(47、48)對白血病細胞和脾淋巴細胞具有較好的細胞毒性作用[20]，destruxin B(47)對大鼠心肌組織具有正性變力作用和負性變時作用，destruxin B(47)和homodestruxin B(49)可抑制乙型肝炎病毒表面抗原，destruxin B(47)還可作為液泡型ATP酶的特異性、劑量依賴性和可逆性抑制劑，chlorohydrin destruxin A4(40)則可作為促紅細胞生成素誘導劑[21]。綠僵菌Metarhiziumrobertsii也可產生破壞素及其衍生物，且其生物合成途徑已經闡明[22]，通過生物合成簇的骨架基因DtxS1的BlastP 分析比對，在已測序的白僵菌基因組中沒有發現合成破壞素的相似功能基因，但與白僵菌中的環孢菌素C合成酶(cyclosporin synthase)、球孢交酯合成酶(bassianolide synthase)、白僵菌素合成酶(beauvericin synthetase)和恩鐮孢菌素成酶(enniatin synthase)的相似性達40%左右。

從白僵菌中還產生具有多種活性的isariin、scopularide、isarfelin、球孢交酯和bassiatin等多種其他非核糖體多肽類化合物。例如：Baute等[23]從Isariafelina(=B.felina)中分離得到化合物isariin和isariins B～D(62～65)，其中僅isariin C(64)和isariin D(65)具有較好的殺蟲活性；Langenfeld等[24]從B.felina中分離得到的化合物iso-isariin B(66)對象蟲類害蟲有一定殺滅作用，其LD50為10 μg/mL；而iso-isariin D(67)具有很強的鹵蟲致死性，其LD50為26.58 μΜ[17]；Elbanna等[25]從Beauveriasp.CMB-F585 中分離得到的scopularides C-G(68～72)，但并沒有明顯的抗細菌、抗真菌或抗癌活性；有研究從白僵菌中分離得到了的環孢菌素A(73)，環孢菌素A作為免疫抑制劑被廣泛應用于器官移植以及自身免疫病的治療，還具有一定的抗腫瘤、抗寄生蟲、抗真菌、抗HIV和丙型肝炎病毒等活性[26]。Guo等[27]從I.felina中分離得到的isarfelins類化合物isarfelins A、B(74、75)具有一定的殺蟲、抗菌等活性；Geng等[28]則從Beauveriaamorpha中分離得到了具有酪氨酸酶抑制活性的槲寄生酰胺(76)；從B.bassiana中分離得到的球孢交酯(77)具有一定的抗癌、抗瘧原蟲、抗分枝桿菌[29]、殺蟲[30]等活性；從B.bassianaK-717中分離得到的血小板聚集抑制因子bassiatin(78)對HeLa細胞、L929細胞和MDA-MB-231乳腺癌細胞均具有細胞毒性作用[31]，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)也有效[32]。

圖2 非核糖體多肽類化合物15～78的結構Fig.2 Structures of the nonribosomal peptides 15-78

1.2 聚酮類化合物

聚酮類化合物(polyketides，PKs)是通過聚酮合酶利用乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A作為構造單元合成的一類化合物，其終產物來源于聚酮中間體。目前已從白僵菌中分離得到了31個聚酮類化合物(見圖3)，而且具有一定的藥理活性和生物活性。

圖3 聚酮類化合物79～109的結構Fig.3 Structures of the polyketides 79-109

白僵菌能產生包括oxirapentyns A～L(79～90)在內的12個oxirapentyns類化合物，并展示了重要的活性。Oxirapentyn A(79)從B.felinaSANK 13682中首次分離得到，具有一定的細胞毒性[33]；Smetanina和Yurchenko等[33-35]先后從I.feline中分離得到了oxirapentyns B～D(80～82)、oxirapentyn L(90)和oxirapentyns E～K(83～89)，其中oxirapentyn E(83)可作為植物生長促進劑來促進玉米和大麥的生長。卵孢素(91)是從B.bassiana中分離得到的一種紅色素，具有一定的細胞毒性，可通過誘導氧化應激使ROS和丙二醛水平升高影響線粒體膜電位，造成DNA損傷而誘導細胞凋亡[36]。卵孢素具有一定的殺蟲作用，在球孢白僵菌將宿主殺死后，卵孢素還可以發揮其抗菌作用，抑制其他微生物生長，以保證球孢白僵菌更好地利用宿主營養進行生長繁殖[37]。Smetanina等[38]從I.felinaKMM 4639中分離得到了化合物isariketides A和B(92、93)和isariketide A acetate(94)，其中isariketide A(92)和isariketide A acetate(94)對22Rv1、PC-3 和LNCaP細胞具有一定的細胞毒性。Gao等[39]從油松毛蟲病原真菌布氏白僵菌B.brongniartii中分離得到具有殺蟲活性的小分子毒素物質間甲基苯甲酸甲酯(95)和對甲基苯甲酸甲酯(96)，這兩個化合物都對油松毛蟲現出很高的注射毒性，但其飼喂毒性和表皮接觸毒性不高。Hu等[40]通過活性導向的分離從B.amorpha中分離得到了具有自由基清除活性的(-)-terredionol(97)和6-methyl-2,4-dihydroxyphenyl 4-O-methyl-beta-D-glucopyranoside(98)，后者具有與TroloxTMC、抗壞血酸或槲皮素相當的自由基清除活性和脂質過氧化抑制活性。Yamazaki等[41]從B.bassianaTPU942中分離得到了1-hydroxy-10-methoxy-dibenz[b,e]oxepin-6,11-dione(99)、chrysazin(100)和globosuxanthone A(101)，其中后兩種化合物具有抗白色念珠菌活性，globosuxanthone A(101)還可以抑制HCT-15(結腸)和Jurkat(T細胞淋巴瘤)的生長，其IC50值分別為10.7 和2.3 μM。Oller-López等[42]從B.bassiana中分離得到了(+)-bassianolone(105)，該化合物為抗菌化合物cephalosporolides E和cephalosporolides F的前體，具有一定的抗革蘭氏陽性菌和抗真菌等活性。Zenitani等[43]從B.felineQN22047中分離得到化合物gerfelin(106)，該化合物可以非競爭性地抑制hGGPP合酶介導的香葉基二磷酸的合成。Lee等[44]從B.bassiana中分離得到了beauvetetraones A～C(102～104)，其獨特的結構特點暗示了該類化合物可能在B.bassiana抗氧化應激過程中起作用。此外，Krasnoff等[1]從B.bassiana中分離得到了鐵載體相關化合物mevalonolactone(107)，Luo等[45]從B.bassianaΔBbPacC突變體中分離純化到了黃色化合物bassianolone B(108)，de Souza Daniel等[46]則從B.bassiana中分離得到了具有抗菌活性的化合物5-hydroxymethyl-2-furanoic acid(109)。

1.3 聚酮-非核糖體多肽雜合類化合物

PK-NRP(polyketide-nonribosomal peptides)雜合化合物是經過聚酮合酶和非核糖體多肽合酶協同作用催化形成的一類化合物，目前在白僵菌屬真菌中分離得到的PK-NRP雜合化合物約有36個，其中多數為白僵菌交酯類化合物(見圖4)，該類化合物也展示了優良的藥理活性和生物活性。

圖4 PKS-NRPS雜合化合物110～145的結構Fig.4 Structures of the NRPS-PKS hybrids 110-145

白僵菌交酯類化合物屬于四元環縮肽類化合物，由一個羥基酸和三個氨基酸組成，并偶聯一個多烯烴鏈。目前已從白僵菌中分離得到27個白僵菌交酯類化合物。Elsworth等[47]從B.bassiana中先后分離得到了白僵菌交酯類化合物beauverolide A(110)、beauverolide B(129)、beauverolide Ba(123)、beauverolide C(130)、beauverolide Ca(121)、beauverolides D、E(111、112)、beauverolide Ea(119)、beauverolide F(113)、beauverolide Fa(118)、beauverolides H～I(127、128)；Grove等[48]從B.bassiana中分離得到了beauverolide Ba(123)、beauverolide Ca(121)、beauverolide Ja(114)和beauverolide Ka(115)；Jegorov 等[49]從B.tenella中分離得到了beauverolide L(131)和beauverolide La(120)； Kuzma等[50]從B.bassiana中分離得到了beauverolide M(132)、beauverolide N(126)和beauverolide P(133)；Mochizuki和Namatame等從Beauveriasp.中分別分離得到了beauverolide I(125)、beauverolide II(124)[51]和beauverolide III(117)[52]；Matsuda等[53]則從Beauveriasp.FO-6979中分離得到beauverolide IV(136)、beauverolide V(116)、beauverolides VI、VII(134、135)和beauverolide VIII(122)。上述白僵菌交酯類化合物具有廣泛的藥理活性，例如：beauverolide L(131)可以通過靶向MCP-1、MMP2和CTGF途徑抑制成肌纖維細胞分化來減輕肺纖維化[54]；beauverolide I(125)具有一定的抗衰老作用，可作為抗衰老劑的潛在先導化合物[55]； beauverolide III(117)可有效抑制脂滴形成，從而對動脈粥樣硬化的早期事件產生影響[56]。

球孢菌素(137)和纖細素(138)為從B.tenella和B.bassiana中分離得到的兩種黃色化合物，它們均具有較好的殺蟲作用。此外，纖細素還可作為鐵螯合劑防止球孢白僵菌中因鐵過載誘導產生的活性氧的毒性[57]。Andrioli等[58]從白僵菌中分離得到pyridovericin-N-O-(4-O-methyl-β-d-glucopyranoside)(139)、pretenellin B(140)、pyridovericin(141)、1-methyl-11-hydroxylumichrome(142)和lumichrome (143) 等化合物，其中pyridovericin(141)具有一定的細胞毒性。此外，Neumann和Takahashi等[59,60]分別從B.bassiana中分離到了具有中等細胞毒性的tetramic acid衍生物beauversetin(144)和活性未知的化合物pyridomacrolidin(145)。

1.4 其他類型化合物

白僵菌還產生生物堿、苯丙素類、萜類和核苷類等其他類型的化合物，其中146～149為生物堿類化合物，150～152為苯丙素類化合物，153～155為萜類化合物，156～158為核苷類化合物(見圖5)，這些化合物也具有多樣的生物活性。例如：Fan等[61]從B.tenella發酵液中分離純化出2-哌啶酮(146)、六氫化-吡咯環[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(147)和2-香豆滿酮(150)多個化合物，其中2-哌啶酮和2-香豆滿酮對油松毛蟲具有顯著的殺滅活性；Du等[17]從B.felinaEN-135中分離得到了felinones A、B(151、152)，其中felinone B(152)對銅綠假單胞菌具有一定的抑制活性；Baek和Geng等[62,28]分別從B.bassianaCS1029和中B.amorpha分離得到的dhFAME(153)和2′-氨基-2′-脫氧鳥苷(156)均具有抑制黑色素生成的活性；Liu等[63]首次從B.bassiana中分離得到了N6-(2-羥乙基)腺苷(HEA)(158)，該化合物是第一個生物來源的鈣拮抗劑，具有抑制腫瘤細胞增殖、抗炎、殺蟲、保護腎臟和鎮靜等藥理活性，說明該白僵菌菌株可作為HEA的來源，具有廣闊的研究前景。此外，de Souza Daniel等[46]從B.bassiana的乙酸乙酯提取物中分離得到了pyridine-2,6-dicarboxylic acid(148)和monomethyl dipicolinate(149)，從丁醇提取物中分離得到了β-adenosine(157)；而Yang等[64]則從白僵菌中分離得到了高效糖皮質激素地塞米松合成的中間體16α-甲基-RSA(154)及其11α-羥基化產物(155)。

圖5 其他類型化合物146～158的結構Fig.5 Structures of other compounds 146-158

由此可見，白僵菌產生的結構和種類復雜多樣的天然產物具有優良的藥理活性和生物活性(見表1)，展現出極大的應用和開發潛力。

表1 白僵菌產生具有藥理活性的主要天然產物

2 白僵菌天然產物生物合成研究

隨著基因組測序技術的發展，多種白僵菌菌株的基因組測序已經完成。目前白僵菌素、白僵菌交酯類化合物、球孢交酯、卵孢素和纖細素的生物合成基因及其功能已經得到克隆和驗證(見表2)，其生物合成途徑也得到了較為清楚的闡明。

表2 白僵菌中已知生物合成途徑的化合物及其生物合成關鍵基因

2.1 白僵菌素的生物合成

Xu等[65]從球孢白僵菌中獲得編碼白僵菌素的合成酶基因bbBeas，并通過基因敲除和異源表達等手段證實該基因負責白僵菌素的生物合成；在其合成過程中，以D-2-羥基異戊酸(D-Hiv)和N-甲基-L-苯丙氨酸(N-Me-L-Phe)為底物合成二肽中間化合物，然后將 3 個該中間化合物聚合形成低聚環狀化合物白僵菌素(見圖6)。鐮刀菌Fusariumproliferatum和Fusariumvenenatum也可合成白僵菌素，兩者白僵菌素合成基因fpBeas和fvBeas的氨基酸序列的相似性為62.9%，而球孢白僵菌bbBeas基因與鐮刀菌白僵菌素合成基因fpBeass和fvBeas的氨基酸序列的相似性分別為74%和58.4%，鐮刀菌與球孢白僵菌的白僵菌素合成基因中獨特的序列差異可能是其高產量的關鍵因素[66]。Bassiatin是白僵菌素三聚體的一個環化單體單元，參與了白僵菌素的生物合成，因此可能是該途徑的旁路產物[67]。Kim等[68]發現，白僵菌素合成酶是球孢白僵菌中一種新型的CaM結合蛋白，在白僵菌素的生物合成過程中，能夠以Ca2+依賴的方式與CaM相互作用。而球孢白僵菌2-酮異戊酸還原酶(BbKIVR)可在由環境刺激介導的白僵菌素生物合成中通過CaM信號傳導途徑發揮重要作用[69]。Yu等[70]將KIVR工程化到釀酒酵母BJ5464-NpgA中，進一步提高了白僵菌素的產量，并通過加入l-Val改善了KIVR底物的供應，增加了白僵菌素的產量；并利用該表達系統表征了來自F.venenatumNRRL 26139的白僵菌素合成酶 FvBEAS。白僵菌素合成酶催化白僵菌素合成時，在C1-A1-T1-C2-A2-MT-T2a-T2b-C3域結構中，C3和C2輪流將兩種生物合成前體D-2-羥基異戊酸(D-Hiv)和L-苯丙氨酸(Phe)加入到二肽鏈中，最后C3使鏈環化，Yu等[71]通過使C2和C3與兩個SNAC連接的前體反應重建了體外白僵菌素的生物合成。

圖6 白僵菌素生物合成基因簇(A)及其生物合成途徑(B)Fig.6 Biosynthetic gene cluster of beauvericin (A) and biosynthetic pathway (B)

2.2 白僵菌交酯類化合物的生物合成

白僵菌中的白僵菌交酯化合物生物合成還未有研究，但Wang等[72]闡明了蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)中白僵菌交酯的生物合成基因簇，并推測其生物合成是在PKs-NRPs雜合裝配線上完成的。BlastP分析發現了白僵菌中白僵菌交酯類化合物生物合成基因簇，與蛹蟲草中相應基因簇基因的氨基酸序列的相似性到達72.9%(見圖7A)。在其生物合成過程中，首先HR-PKS Cm3B催化乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A和SAM合成聚酮中間體，然后ATP依賴性乙酰輔酶A連接酶Cm3D將聚酮中間體轉化為硫酯的形式，乙酰基轉移酶Cm3C再將聚酮中間體轉運至NRPS Cm3A中的第一個T結構域。Cm3A將聚酮中間體、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和D-亮氨酸(或D-allo-異亮氨酸)組裝起來以形成beauverolide I(或beauverolide III)(見圖7B)。

2.3 球孢交酯的生物合成

Xu等[73]最先克隆了球孢白僵菌的bbBsls基因，該基因編碼一個非核糖體肽合成酶(NRPS)，bbBsls基因缺失突變菌株不再產生球孢交酯說明bbBsls基因參與了球孢交酯的生物合成，盡管bbBsls基因所在基因簇的其他基因的功能仍未得到進一步的驗證(見圖8A)，但可結合已知環縮肽生物合成機制和球孢交酯的結構特征和基因簇構成對球孢交酯的生物合成途徑進行推測。在其假定的生物合成過程中，首先以D-2-羥基異戊酸(D-Hiv)和N-甲基-亮氨酸(N-Me-Leu)作為底物合成二肽中間化合物，然后球孢交酯合成酶通過對該中間化合物進行遞歸縮合來催化球孢交酯的形成(見圖8B)。Boecker等[74]將bbBsls基因導入黑曲霉進行異源表達并喂養前體物質15 mMD-Hiv，將bbBsls基因成功表達且球孢交酯的產量達到378.77±59.74 mg/L。

圖7 白僵菌交酯類化合物生物合成基因簇(A)及生物合成途徑(B)[72]Fig.7 Biosynthetic gene cluster of beauverolides (A) and the putative biosynthesis pathway (B)

2.4 卵孢素的生物合成

Feng等[75]首先闡明了卵孢素的生物合成途徑，該途徑涉及一個含有七個生物合成基因的基因簇(圖9A)，其中PKS卵孢素合酶1(OpS1)催化乙酰輔酶A和3個丙二酸單酰輔酶A生成苔色酸，苔色酸被羥化酶OpS4羥化為中間體6-甲基-1,2,4-苯三酚，該中間體可被非酶促氧化為5,二脫氧-卵孢素或被雙加氧酶OpS7酶促氧化為6-甲基-1,2,4,5-苯四酚，6-甲基-1,2,4,5-苯四酚通過過氧化氫酶OpS5進一步二聚為卵孢素(圖9B)。其中OpS3編碼含有Gal4的Zn2Cys6結構域的轉錄因子，該基因的缺失會導致突變株中與卵孢素生物合成相關的其他基因表達失活，而OpS3的過表達則顯著增強了基因簇其他基因的表達。此外，Bbsmr1可通過調節OpS3實現負調節作用[37]，Bbmsn2則為pH依賴性負調節劑，可根據外界PH變化進行調整，以增加球孢白僵菌的毒力并促進菌株的生長[76]。

圖8 球孢交酯生物合成基因簇(A)及其假定的生物合成途徑(B)Fig.8 Biosynthetic gene cluster of bassianolide (A) and putative biosynthetic pathway (B)

圖9 卵孢素生物合成基因簇及其生物合成途徑Fig.9 Biosynthetic gene cluster of oosporein and the biosynthetic pathway

2.5 纖細素的生物合成

早在2007年白僵菌纖細素的生物合成基因簇和生物合成途徑就已經得到初步闡明(見圖10A)，PKS-NRPS合成酶TenS與NRPS合成酶TenS3的共同作用產生前體pretenellin-A[77]。Halo等[78]利用基因敲除、反義RNA和基因共表達等方法對卵孢素生物合成途徑中最后一步進行驗證，從而完善了纖細素的生物合成途徑，其中TenS1編碼的細胞色素P450氧化酶催化pretenellin-A發生氧化環擴展，使五元環結構形成2-吡啶酮六元環，形成化合物pretenellin-B，TenS2編碼的細胞色素P450單加氧酶使2-吡啶酮環上的氮原子羥基化從而形成纖細素(見圖10B)。BlastP分析表明TenS2屬于細胞色素P450 N-單加氧酶的相對罕見類別，其作用機理與已知的氮原子羥基化的方式均不相同。此外，prototenellin-D是纖細素的支路代謝途徑產物，可能是由基因組中未知基因編碼的氧化酶催化的；15位羥基化的產物pyridovericin和15-hydroxytenellin的存在表明在球孢白僵菌中可能存在對聚酮化合物側鏈的羥基化有選擇性的其他細胞色素P450酶發揮作用，13-hydroxypretenellin-B可能與pyridovericin是同一或其他P450氧化酶的產物。研究還發現了一個非纖細素的生物合成簇內的甲基轉移酶可催化15-hydroxyaltenellin N1-羥基的甲基化，而過表達簇內的特異性轉錄因子TenR后新發現包括甲基葡萄糖基化的產物在內的四個新結構的纖細素類化合物，纖細素 BGC外部的GT-MT(糖基轉移酶-甲基轉移酶)基因負責吡喃葡萄糖苷的形成[79]。Jirakkakul等[57]發現球孢白僵菌鐵蛋白缺乏突變體中纖細素和鐵-纖細素復合物的產量顯著增加，說明鐵蛋白和纖細素的生物合成之間的意想不到的聯系可能是鐵介導的氧化應激期間的生存策略。Heneghan等[80]通過用米曲霉amyB啟動子替換其所有四個組成基因的啟動子，在異源宿主米曲霉中實現了球孢白僵菌完整纖細素生物合成途徑的受控表達，這樣產生的纖細素的濃度是天然宿主的五倍以上。Yakasai等[81]研究了球孢白僵菌CBS110.25的代謝產物纖細素在表觀遺傳修飾劑5-氮雜胞苷和亞磺?；p異羥肟酸的存在下以及在纖細素生物合成基因簇的個別基因被沉默的條件下的生物合成，發現合成了許多新化合物，這表明纖細素可能只是這條代謝途徑上各種可能產物中的一種結果。上述研究為纖細素的生產應用奠定了理論基礎。

圖10 纖細素生物合成基因簇(A)及其生物合成途徑(B)Fig.10 Biosynthetic gene cluster of tenellin (A) and the biosynthetic pathway (B)

3 展望

白僵菌作為一類重要的昆蟲病原真菌，具有強大的合成天然產物的潛力，能夠產生結構類型多樣的活性天然產物，包括肽類、聚酮類、生物堿類、苯丙素類、萜類、核苷類等，并表現出較好的抗腫瘤、殺蟲、抗菌、抗炎等活性，其應用主要集中在生物防治、生物催化等領域。此外，在活性化合物生物合成機制方面，已在白僵菌屬真菌中發現了白僵菌素合成酶基因bbBeas、球孢交酯合成酶基因bbBsls、卵孢素合成酶基因OpS2～OpS7和纖細素合成酶基因tenS分別是白僵菌素、球孢交酯、卵孢素和纖細素骨架結構生物合成的關鍵酶基因，白僵菌交酯類化合物在蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)中的生物合成機制得到闡明，其合成酶基因cm3負責該化合物的生成，但在白僵菌屬真菌中的生物合成機制尚未得到研究證實。并且，白僵菌素和纖細素已通過異源表達策略使其產量獲得大幅度的提高。在后基因組時代，合成生物學相關研究策略和技術的發展將大大促進白僵菌天然產物在藥理活性應用和生物合成方面的研究，進而必將促進白僵菌來源的新結構活性天然產物的基因組挖掘和發現以及已知重要活性分子的開發應用。