阿里紅多糖通過激活Nrf2/ARE通路改善阿爾茨海默病大鼠海馬及腦皮層的氧化應激損傷

蘇麗燕·賽力木江，依木然·馬瑞士，叢媛媛，阿依江·哈拜克，帕麗達·阿不力孜

新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830011

阿爾茨海默病(AD)是一種以認知功能障礙、記憶和判斷喪失、推理和情緒穩定性中斷等癥狀作為主要表現的慢性進展性中樞神經系統退行性疾病[1]。目前AD發病機制尚不明確，一般認為AD是一種多病因疾病，其發病受年齡、環境、免疫因素、神經突觸功能等因素的影響[2]。Aβ沉積導致老年斑的形成是AD的主要病理標志物之一。過量的活性氧(ROS)主要來源于功能紊亂的線粒體(線粒體復合物IV)，引起核酸、脂質和蛋白等物質的過氧化損傷[3,4]損傷正常生理機能，因此，ROS的過量產生被看作神經退行性疾病病理過程的推動者之一。

NF-E2相關因子2(Nrf2)是細胞氧化后應激反應中的關鍵因子，Nrf2轉錄因子普遍存在于各種器官和組織中[5]，在穩態條件下，Nrf2轉錄受其負調節物Keapl的抑制。當機體暴露于ROS時，Nrf2從胞質Keapl游離出來并轉移到細胞核中，結合編碼抗氧化酶的基因的啟動子區域中的ARE，從而誘導內源性抗氧化酶如NOQl、HO-1、GSH等的產生[6]。由于Nrf2/ARE通路的激活可以增強緩沖自由基生成的能力，因此它為治療神經退行性疾病(nurodegenerative diseases，NDD)提供了有價值的治療靶點[7,8]。

阿里紅(FomesofficinalisAmes)為多孔菌科藥用層孔菌的干燥子實體，是新疆地區的道地藥材[11]，相關研究報道阿里紅多糖具有清除氧自由基、抗衰老、抗氧化、免疫調節、平喘祛痰等生物活性作用[12]。本課題組前期研究結果證明，阿里紅多糖對Aβ神經元損傷具有一定的保護作用[13,14]，提示阿里紅多糖在神經系統疾病治療方面具有潛在的應用價值，本研究從氧化損傷通路入手，通過雙側腦室注射Aβ建立大鼠AD模型，通過測定Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1的mRNA轉錄水平及蛋白表達水平，探討阿里紅多糖對Nrf2/ARE信號通路的調控，了解其抗氧化機制。

1 材料

1.1 動物

3月齡80只健康雄性SD大鼠，體重250±50 g，由新疆醫科大學動物中心提供，質量合格證編號：(SCXK(新)2019-0008)，實驗對象在SPF級實驗室正常飼養，保持充足的光照和通風，籠飼養(3～4只/籠)自由飲水和進食。

1.2 藥物及試劑

阿里紅粗多糖課題組自制[12]。鹽酸多奈哌齊片[衛材(中國)藥業有限公司，批號1707094]；Aβ1-42(大連美侖生物技術有限公司，批號MB3894)；熒光定量試劑盒、逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號分別為RR047A、RR820A)；Total RNA提取試劑盒(上海玉博生物科技有限公司，批號229009)；賽默飛PageRuler預染蛋白marker(美國賽默飛世爾科技公司，批號26619)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、高效RIPA組織/細胞裂解液、4×蛋白上樣緩沖液、抗體稀釋液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、10×TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為PC0020、R0010、P1016、A1800、P1200-1/P1200-2、D1060)；兔抗大鼠多克隆抗體Nrf2、兔抗大鼠單克隆抗體[EPR3309]NQO1(美國Abcam公司，批號分別為Ab929464、Ab80588)；兔抗大鼠多克隆抗體keap1(D6B12)、兔抗大鼠多克隆抗體HO-1(E3F4S)(美國Cell Signaling公司，批號分別為8047、43966)；β-actin(Affinity Biosciences，批號AF7018)；Goat anti rabbit IgG-HRP標記二抗(北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-0295G-HRP)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸(Glycine)、脫脂奶粉(德國Biofroxx公司，批號分別為 1115GR500、3250GR500、1275GR500、1172GR100)。

1.3 儀器

腦立體定位儀(TSE Systems JAPAN)；Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(成都泰盟科技有限公司)；全波長酶標儀、實時熒光定量 PCR儀、核酸蛋白定量儀(美國賽默飛世爾科技公司)；化學發光凝膠成像系統(美國ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 動物模型的建立及干預

實驗前先將所有實驗動物進行第一次行為學測試，剔除先天愚鈍的大鼠，選取72只作為實驗用。無菌條件下，將1 mg Aβ1-42溶于50%的DMSO中，再用無菌生理鹽水將其溶解稀釋成2 μg/μL，37 ℃恒溫箱孵育7天，使其變為聚集態的Aβ1-42。1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉后，固定大鼠立體定位，使用微量注射器緩慢注射凝聚態Aβ1-42各5 μL于雙側海馬內以誘導AD模型。根據大鼠腦立體定位圖定位注射部位，前囟后3 mm，矢狀縫左右旁開2.5 mm，硬膜下3 mm。注射完畢后縫合皮膚，肌肉注射8萬單位青霉素防感染。72只健康雄性SD大鼠稱體質量并按隨機原則分為空白組、模型組、鹽酸多奈哌齊組(0.5 mg/kg)，阿里紅多糖高、中、低劑量組(100、50、25 mg/kg)，每組12只。各組大鼠Aβ1-42注射三天后進行灌胃給藥(1.0 mL/100g)，每日一次，連續30天。正常對照組和模型組大鼠給予蒸餾水灌胃；陽性對照組給予鹽酸多奈哌齊溶液進行灌胃；阿里紅高，中，低劑量組使用不同濃度阿里紅灌胃治療。由于腦部手術對動物健康損害較大，造模和恢復期各組均有少數大鼠死亡。因此為了更好的運用統計方法分析資料最后每組取9只大鼠進行下一步實驗。

2.2 Morris水迷宮行為學測試

灌胃治療結束后使用Morris水迷宮測量SD大鼠學習記憶能力。定位航行試驗進行連續5天，每天訓練2次，圓形水池壁上標有東西南北的四個入水點，它們將水池分為四個象限(A、B、C、D象限)，每次從固定的C平臺象限及平臺對側象限為入水點將大鼠面向池壁放入水中，然后計算機分析處理系統記錄每只大鼠找到安全平臺所需的時間(逃避潛伏期)。第六天為空間探索實驗，歷時1天。移走平臺后任選一個入水點將大鼠放入水中，時間為1 min，由計算機分析處理系統記錄大鼠原平臺所在象限滯留時間百分比和有效區域進入次數等數據。

2.3 RT-qPCR法檢測各組大鼠海馬和腦皮層中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1 mRNA表達水平

取-80 ℃保存的大鼠海馬組織及大腦皮質層，用trizol試劑盒抽提獲取總RNA。利用逆轉錄酶逆轉錄得到cDNA。然后利用各目的基因序列設計特異性引物，進行熒光定量PCR實驗。引物序列見表1。最后根據各反應孔的ct值，采用2-ΔΔCt法計算各組mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

2.4 Western blotting法檢測各組大鼠海馬和腦皮質層中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋白的表達水平

將SD大鼠麻醉后快速斷頭，冰上取出大鼠新鮮海馬組織及大腦皮質層，-80 ℃凍存。取各組大鼠海馬組織和大腦皮質層，剪切成細小的碎片，按照每200 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入RIPA組織裂解液。將裂解后的樣品10 000～14 000g在4 ℃ 12 000 rpm條件下，離心10 min，取上清，然后用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據蛋白定量標準曲線計算各樣本內蛋白含量。每組取10 μL進行聚丙烯酰胺凝膠電(SDS-PAGE)，將蛋白轉移至PVDF膜上，加入含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液，室溫搖床封閉1 h。將封閉的PVDF膜浸泡在以抗體稀釋液稀釋的Keap1(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)和NQO1(1∶10 000)一抗中，4 ℃孵育過夜，洗滌后浸泡在以TBST(1∶10 000)稀釋的二抗中，室溫孵育1 h。最后將PVDF膜至于凝膠成像儀上加入ECL化學發光劑顯色成像并保存。用Image J軟件進行灰度分析，以Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達含量。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 對大鼠行為學的影響

結果表明，與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增長，原平臺所在象限滯留時間百分比和有效區域進入次數顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和阿里紅多糖高，中劑量組逃避潛伏期均顯著減短，原平臺所在象限滯留時間百分比和有效區域進入次數顯著增加(P<0.01)，結果提示阿里紅多糖能夠改善Aβ1-42誘導的AD大鼠模型學習記憶能力損。

圖1 各組大鼠第五天定位航行軌跡圖Fig.1 Location trajectory of rats in each group on the fifth day

圖2 各組大鼠第六天空間搜索軌跡圖Fig.2 The spatial search trajectory of rats in each group

表2 FOPS對大鼠定位航行實驗中逃避潛伏期的影響

表3 FOPS對大鼠空間搜索實驗結果的影響

3.2 對大鼠海馬和腦皮層Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1 mRNA表達量的影響

結果表明，與空白組比較，模型組Keap1表達量顯著升高(P<0.01)，而Nrf2、HO-1及NQO1表達量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和FOPS高、中劑量組可降低AD大鼠海馬組織和腦皮質層中Keapl基因的mRNA表達水平(P<0.01)，增加Nrf2基因的激活，從而升高其下游抗氧化反應元件HO-1、NQO1基因的mRNA表達水平(P<0.05，P<0.01)。結果提示阿里紅多糖可抑制Keap1的表達量，并提高Nrf2、HO-1及NQO1表達量。

表4 FOPS對大鼠海馬區中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1 mRNA表達的影響

表5 FOPS對大鼠腦皮層中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1 mRNA表達的影響

3.3 對大鼠海馬和腦皮層Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1蛋白表達量的影響

結果表明，與空白組比較，模型組Keap1蛋白表達量顯著升高(P<0.01)，而Nrf2、HO-1及NQO1蛋白表達量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和FOPS高、中劑量組可降低AD大鼠海馬組織和腦皮質層中Keapl蛋白的表達水平(P<0.05，P<0.01)，增加Nrf2蛋白的激活，從而升高其下游抗氧化反應元件HO-1、NQO1蛋白的表達水平(P<0.01)。結果提示阿里紅多糖可激活Nrf2/ARE抗氧化應激通路發揮抗氧化作用。

表6 FOPS對大鼠海馬組織中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1蛋白表達的影響

表7 FOPS對大鼠腦皮層中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1蛋白表達的影響

4 討論與結論

淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)由γ分泌酶和β分泌酶裂解后，成Aβ，大量的Aβ在腦內異常沉積形成老年斑是阿爾茨海默病最具特征的病理改變，與大腦認知障礙密切相關并且有實驗表明，在體外培養海馬神經元時，低濃度的Aβ1-42寡聚體可以直接導致神經元的損傷，且隨著濃度的升高表現出線性關系[15]。由此本研究中將Aβ1-42注射入大鼠雙側海馬以模擬Aβ在腦組織內的沉積，建立大鼠AD模型。并在注射前先將Aβ1-42于37 ℃水浴一周使其老化形成聚集態，從而使其毒性顯著增強。Morris水迷宮實驗可敏感反映動物空間認知能力變化，是AD行為學評價的常用方法。此研究通過Morris水迷宮實驗研究發現，模型組大鼠較空白組逃逸潛伏期顯著增加，原平臺象限滯留時間百分比和有效區域進入次數顯著減少，表明AD大鼠模型建立成功；經阿里紅多糖高，中劑量組治療后AD大鼠的逃逸潛伏期明顯縮短，原平臺象限滯留時間百分比和有效區域進入次數顯著升高，證實阿里紅多糖能夠提高AD大鼠的學習和記憶能力。

圖3 大鼠海馬組織(a)和大腦皮質層(b)中Nrf2、Keap1、HO-1及NQO1蛋白表達電泳Fig.3 Nrf2,Keap1,HO-1 and NQO1 protein expression electrophoresis in rat hippocampus(a) and cerebral cortex(b)注：A.空白組；B.模型組；C.鹽酸多奈哌齊組；D.FOPS低劑量組；E.FOPS中劑量組；F.FOPS高劑量組。Note:A.Control group;B.Model group;C.Donepezil group;D.FOPS-L group;E.FOPS-M group F.FOPS-H group.

AD發病機制的“Aβ學說”認為Aβ在特定腦區的聚集、介導氧化應激(oxidative stress，OS)損傷，而氧化還原穩態不穩定是阿爾茨海默病(AD)和帕金森氏病(PD)的共同標志在健康狀態的機體中，ROS形成的水平與抗氧化能力平衡；然而，當ROS的產生超過了機體的抗氧化能力，ROS累積，從而引發OS和細胞損傷，中樞神經系統(central nervous system，CNS)由于其高耗氧量以及含有豐富的不飽和脂肪酸，極易受到OS的攻擊，因而特別容易受到脂質過氧化作用的影響[16]。此外有研究發現，AD人群大腦中氧化蛋白的水平明顯高于與年齡相配的對照組[17]。

Nrf2被認為是調節細胞內眾多抗氧化物表達的關鍵性因子，具有維持細胞氧化一抗氧化平衡、抑制、凋亡、抗炎的多重生物活性；其與抗氧化反應序列元件(ARE)共同構成Nrf2/ARE信號通路，Nrf2/ARE信號通路的激活可誘導產生一系列內源性酶，如血紅素加氧酶(HO-1)、醌氧化還原酶(NQO1)等，這些自由基清除酶能夠參與機體的抗氧化防御機制，從而減少氧化應激和介導抗氧化的主要途徑[18]。Nrf2的轉錄活性受細胞骨架相關性抑制蛋白Keap1的調節，該調控蛋白還引導Nrf2通過蛋白酶體進行泛素化和降解，從而限制其基本細胞水平。在基礎條件下，該蛋白作為Nrf2抑制因子，與Nrf2結合并穩定存在于在細胞漿中，親電子物質或者氧化刺激引起Keap1的修飾，使Keap1-Nrf2復合體解離，從而游離出Nrf2，進而激活抗氧化反應序列元件下游的Ⅱ相解毒酶基因及產生抗氧化酶的基因轉錄，并增加細胞對氧化應激、外源性化學物質及親電子化合物刺激的抗性。許多研究表明，應激條件下，Nrf2的激活可以促進細胞存活[19]。

大腦皮質層和海馬組織是兩種具有不同結構和功能的腦組織。大腦皮質位于大腦的表層，是機體的最高級神經中樞；大腦皮層除了對外部世界感知，還具有語言、學習、記憶和思維等方面的高級功能；海馬體位于大腦丘腦和內側顳葉之間，屬于邊緣系統的一部分，主要負責長時記憶的存儲轉換和定向等功能。這兩種腦組織是AD病變最為顯著的區域，表現為老年斑的出現、NFTs的形成和神經元的大量丟失等[20]。因此本研究中我們選取了大腦皮質層和海馬組織兩種具有不同結構和功能的腦組織進行了檢測。

研究結果表明，模型組大鼠較空白組大鼠海馬區和腦皮質層Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA水平及蛋白表達水平顯著降低，而Keap1 mRNA水平及蛋白表達水平顯著升高，說明AD模型已經存在嚴重腦組織氧化損傷，同時經阿里紅多糖高，中劑量組治療后AD大鼠海馬組織和大腦皮層中Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA水平及蛋白表達顯著升高，而Keap1 mRNA水平及蛋白表達顯著減弱，表明阿里紅多糖高、中劑量組通過負向調節Keap1的表達，促進Nrf2的激活，誘導NQO1、HO-1的表達，通過增強抗氧化酶系活性，發揮提高機體抗氧化損傷作用，從而改善AD大鼠學習記憶能力。

綜上所述，阿里紅多糖治療AD的作用機制可能與激活Nrf2/ARE信號轉導途徑有關。但記憶力形成與修復的過程和機制極其復雜，阿里紅多糖改善AD患者記憶力的作用機制還有待進一步深入探討，本研究為其奠定了初步的基礎和參考。