基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討丹參-丹皮配伍抗腦缺血損傷的作用機(jī)制

張娟利，李 驊，王文軍，黃少杰，馬 陽(yáng)，丁 一*，文愛東,*

1空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安710032；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽(yáng)712046

腦卒中(stroke)是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，以發(fā)病率、死亡率及致殘率高為特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人類健康及生活質(zhì)量[1]。目前治療方法以早期溶栓恢復(fù)血流、實(shí)現(xiàn)血管再通為主，但大多數(shù)患者因受治療時(shí)間窗或其他禁忌癥的限制不能獲得溶栓治療。而以往針對(duì)單一靶點(diǎn)、單一環(huán)節(jié)的治療藥物由于不能完全、有效地阻斷腦卒中的缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使其在臨床試驗(yàn)中屢遭失敗[2]。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)及整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，恰可以作用于腦卒中的多個(gè)病理環(huán)節(jié)，通過調(diào)整機(jī)體的自身修復(fù)功能而起到治療作用，是研發(fā)抗腦缺血損傷藥物新的突破點(diǎn)[3]。丹參(Salviae Miltiorrhizae，SM)、丹皮(Cortex Moutan，CM)藥對(duì)，源自《施今墨對(duì)藥臨床經(jīng)驗(yàn)集》，其中丹參善于活血化瘀，祛瘀生新，丹皮長(zhǎng)于清熱涼血，活血散瘀。兩者相須為用，同氣相求，是活血化瘀的經(jīng)典藥對(duì)。臨床研究表明，丹參-丹皮藥對(duì)及其組成的多種制劑(雙丹口服液，丹膝顆粒等)在防治腦血管疾病方面發(fā)揮著重要作用，但至今丹參-丹皮治療腦卒中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚未完全闡明，限制了其臨床推廣和二次開發(fā)。

近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)在國(guó)際上興起，它通過運(yùn)用各大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)信息的搜集、預(yù)測(cè)與篩選，構(gòu)建“藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從整體的角度去揭示藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性，這與中醫(yī)藥整體觀與辯證論治的原則不謀而合，因而被廣泛應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)篩選和作用機(jī)制的研究[4]。分子對(duì)接技術(shù)(molecular docking)通過模擬小分子配體與蛋白受體的相互作用方式、結(jié)合能等預(yù)測(cè)藥物與受體之間結(jié)合的穩(wěn)定性，是藥物虛擬篩選的重要手段[5]。基于此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探討丹參和丹皮有效成分配伍抗缺血性腦損傷的作用機(jī)制，為該藥對(duì)的藥效成分篩選和進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料

本研究使用的數(shù)據(jù)庫(kù)、分析平臺(tái)及軟件相關(guān)信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)、分析平臺(tái)及軟件相關(guān)信息

2 方法

2.1 丹參-丹皮化學(xué)成分的構(gòu)建與篩選

登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP，分別以“丹參”和“牡丹皮”為關(guān)鍵詞檢索其所有的化學(xué)成分，在此基礎(chǔ)上，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為活性成分的篩選條件，將符合條件的化合物信息錄入Excel表格。此外，《中國(guó)藥典》對(duì)兩味藥的質(zhì)量控制成分以及明確的生物活性報(bào)道的化合物也被作為候選成分納入分析。最后，采用ChemBioDraw Ultra軟件繪制上述候選成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并以mol2格式保存。

2.2 丹參-丹皮相關(guān)靶點(diǎn)收集

將得到的候選成分去除重復(fù)后，在TCMSP分析平臺(tái)檢索候選成分的相關(guān)靶點(diǎn)，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將候選成分的靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱。

2.3 腦卒中靶點(diǎn)獲取

以“stroke”為檢索詞分別在CTD、TTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)，為了篩選高可信度的蛋白作為候選靶點(diǎn)，分別將CTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選條件設(shè)置為inference score≥70和relevance score≥20。合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，最后通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

2.4 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將丹參-丹皮成分靶點(diǎn)與腦卒中疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入在線韋恩圖Venny 2.1，可獲得在線韋恩圖和共有靶點(diǎn)信息。再將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，minimum required interaction score≥0.7。獲取蛋白質(zhì)相互作用(PPI)信息，并導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)浞治龊蚉PI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

2.5 基因富集分析

為了進(jìn)一步了解共有靶點(diǎn)的功能以及在信號(hào)通路中的作用，利用R語(yǔ)言中的“ClusterProfiler包”對(duì)篩選的共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析(P<0.05)。

2.6 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

準(zhǔn)備候選成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，以探究丹參-丹皮活性成分的藥理學(xué)作用機(jī)制；基于KEGG富集的前15條通路，反向篩選得到其對(duì)應(yīng)的腦卒中靶點(diǎn)和活性成分，制作“成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建丹參-丹皮治療腦卒中的“成分-靶點(diǎn)-通路”圖，以分析丹參-丹皮藥對(duì)治療腦卒中的作用機(jī)制。

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證核心成分和靶點(diǎn)

以“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較大的靶點(diǎn)及靶向成分為研究對(duì)象，進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。對(duì)接步驟如下：①?gòu)腜DB數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心靶蛋白3D結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PyMoL軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子(如水分子)，配體和蛋白均保存為pdb格式文件；②采用AutoDock Vina將靶蛋白、配體和mol2格式的化合物均轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件；③以配體為中心尋找靶蛋白活性位點(diǎn)，記錄設(shè)置Grid Box坐標(biāo)和盒子大小，采用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接；④選取與靶蛋白對(duì)接結(jié)合能最高的成分，采用PyMoL軟件可視化結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 “丹參-丹皮”活性成分的篩選

本實(shí)驗(yàn)共檢索出丹參化學(xué)成分202個(gè)，牡丹皮化學(xué)成分55個(gè)，去除3個(gè)重復(fù)成分(咖啡酸、齊墩果酸和油酸)后，共得到丹參-丹皮相關(guān)成分254個(gè)。經(jīng)OB≥30%，DL≥0.18篩選和《中國(guó)藥典》檢索質(zhì)控成分，剔除無靶點(diǎn)成分后，總共得到66個(gè)丹參-丹皮候選成分，其中59個(gè)來自丹參，7個(gè)來自丹皮(表2)。

表2 “丹參-丹皮”經(jīng)篩選得到的66個(gè)候選成分信息

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3.2 “丹參-丹皮”成分靶點(diǎn)的篩選

通過對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，共得到66個(gè)候選成分的相關(guān)靶點(diǎn)。其中56個(gè)丹參活性成分獲得118個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，7個(gè)丹皮活性成分獲得160個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，去除兩藥77個(gè)共有靶點(diǎn)，共得到“丹參-丹皮”成分靶點(diǎn)201個(gè)。最后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。

3.3 “丹參-丹皮”成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

如圖1所示，丹參-丹皮藥對(duì)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共含有267個(gè)節(jié)點(diǎn)(66個(gè)候選成分和201個(gè)相關(guān)靶點(diǎn))和921條邊。運(yùn)用Cytoscape中的NetworkAnalyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯?jié)點(diǎn)的度值(degree)為描述網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的重要指標(biāo)。每個(gè)化合物的平均靶點(diǎn)為13.95個(gè)，每個(gè)靶點(diǎn)平均與3.05個(gè)化合物相互作用。從化合物角度分析，有17個(gè)成分的作用靶點(diǎn)≥20個(gè)，其中排名前10的分別是槲皮素(MOL000098)、山柰酚(MOL000422)、木犀草素(MOL000006)、丹參酮IIA(MOL007154)、丹皮酚(MOL000874)、隱丹參酮(MOL007088)、4-亞甲丹參新酮(MOL007049)、鼠尾草酚酮(MOL007145)、二氫丹參內(nèi)酯(MOL007100)和異隱丹參酮(MOL007108)。從靶點(diǎn)的角度分析，有24個(gè)靶點(diǎn)與10個(gè)以上的化合物相互作用，其中排名前10的分別是PTGS2、ADRB2、NCOA1、SCN5A、CHRM1、PTGS1、ACHE、OPRM1、ADRA1A和RXRA。因此，丹參-丹皮藥對(duì)存在單個(gè)成分與多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，同時(shí)也存在單個(gè)靶點(diǎn)與多個(gè)成分相互作用的現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)了丹參-丹皮藥對(duì)具有多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同增效的作用。

圖1 “丹參-丹皮”成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The component-target network of SM-CM注：圖中紫色節(jié)點(diǎn)為丹參活性成分；黃色節(jié)點(diǎn)為丹參成分靶點(diǎn)；紅色節(jié)點(diǎn)為丹皮活性成分；藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為丹皮成分靶點(diǎn)；綠色節(jié)點(diǎn)為丹參和丹皮的共有靶點(diǎn)。Note:The purple nodes are the active components of SM;The yellow nodes are the targets of SM;The red nodes are the active components of CM;The blue nodes are the targets of CM;Green nodes are the common targets between SM and CM．

3.4 “丹參-丹皮”治療腦卒中的靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)分析

以“stroke”為關(guān)鍵詞檢索腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)，從CTD數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶點(diǎn)152個(gè)，從TTD數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶點(diǎn)29個(gè)，從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶點(diǎn)112個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，最終得到腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)222個(gè)。再將201個(gè)丹參-丹皮候選成分的靶點(diǎn)與222個(gè)腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到67個(gè)共有靶點(diǎn)，證實(shí)丹參、丹皮可能通過多個(gè)潛在作用靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用(圖2)。為了進(jìn)一步探討丹參-丹皮的成分靶點(diǎn)與腦卒中靶點(diǎn)在蛋白水平上的作用機(jī)制，將67個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，再將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2繪制PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共涉及66個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)，586條邊(edge)，PPI網(wǎng)路圖中，節(jié)點(diǎn)根據(jù)度值從最低點(diǎn)以順時(shí)針排列為圓形，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深代表其度值越大。其中，共有29個(gè)蛋白度值高于平均值，度值較大的靶點(diǎn)為AKT1、TNF、IL6、MAPK8、MMP9、TP53等，表明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白相互作用較多，在PPI網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。

圖2 “丹參-丹皮”靶點(diǎn)與腦卒中靶點(diǎn)Venn圖Fig.2 Venn diagram of targets for SM-CM and stroke

圖3 “丹參-丹皮”共有靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The PPI network of the common targets between SM and CM注：靶點(diǎn)度值隨圖形大小和顏色深淺變化。Node:The value of target degree changes with the size and color of the figure.

3.5 GO功能和KEGG通路富集分析

GO富集分析中共得到生物學(xué)過程(biological process，BP)1891個(gè)、分子功能(molecular function，MF)76個(gè)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)31個(gè)。根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序，選擇GO富集排名前15的BP條目繪制氣泡圖，見圖4。圖中氣泡大小代表BP條目富集基因數(shù)目的多少，氣泡顏色差異代表靶基因在各BP條目富集程度的高低。富集程度高且富集基因數(shù)目較多的生物學(xué)過程主要涉及脂多糖應(yīng)答(response to lipopolysaccharide)，細(xì)菌來源的分子反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)，氧化應(yīng)激(response to oxidative stress)和營(yíng)養(yǎng)水平應(yīng)答(response to nutrient levels)等。此外，KEGG富集分析篩選得到149條(P<0.05)信號(hào)通路，主要涉及AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway)、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)和TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等(表3)。

圖4 “丹參-丹皮”GO富集分析中BP前15個(gè)功能Fig.4 TOP 15 function of BP in GO enrichment analysis of SM-CM

表3 KEGG通路富集分析排名前15的通路信息

3.6 丹參-丹皮“成分-靶點(diǎn)-通絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)分析

基于KEGG富集分析的前15條通路，反向篩選得到其對(duì)應(yīng)的49個(gè)腦卒中靶點(diǎn)和56個(gè)丹參-丹皮活性成分，制作“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建丹參-丹皮治療腦卒中的“成分-靶點(diǎn)-通路”圖(圖5)。其中度值較大的成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、丹皮酚和隱丹參酮等，度值較大的靶點(diǎn)為PTGS2、RELA、TNF和AKT1等，提示這些成分和靶點(diǎn)可能為丹參-丹皮治療腦卒中的關(guān)鍵成分和蛋白，表明丹參-丹皮可通過“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”起到抗腦缺血損傷的作用。

圖5 “丹參-丹皮”成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 The ingredient-target-pathway network of SM-CM注：圖中紫色梭形節(jié)點(diǎn)為丹參活性成分；紅色梭形節(jié)點(diǎn)為丹皮活性成分；橙色圓形節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶蛋白；玫紅色菱形節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵信號(hào)通路。Note:Purple fusiform nodes are the active components of SM;The red fusiform nodes are active components of CM;The orange circular nodes are the key target proteins;The rose diamond nodes are the key pathways.

圖6 “丹參-丹皮”核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接示意圖Fig.6 Molecular docking pattern of main ingredients with key targets of SM-CM注：圖6中A-D分別為山奈酚與PTGS2，丹參酮IIA與RELA，隱丹參酮與TNF，木犀草素與AKT1的分子對(duì)接圖。Node:A-D in Figure 6 are kaempferol and PTGS2,tanshinone IIA and RELA,cryptotanshinone and TNF,luteolin and AKT1,respectively.

3.7 “丹參-丹皮”關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合能越低，結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，≤-4.25 kcal/mol說明兩者有一定的結(jié)合活性，≤-5.0 kcal/mol說明兩者有較好的結(jié)合活性，≤-7.0 kcal/mol說明兩者有強(qiáng)的結(jié)合活性[6]。為驗(yàn)證本研究網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較大的靶點(diǎn)PTGS2、RELA、TNF、AKT1為受體，分別以6個(gè)核心成分和4個(gè)靶蛋白的原始配體為對(duì)象，采用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。對(duì)接結(jié)果如表3所示，丹參-丹皮6個(gè)核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能均≤-5 kcal/mol，其中81%的成分與其靶點(diǎn)的結(jié)合能<-7.0 kcal/mol，表明成分與其靶點(diǎn)均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，特別是隱丹參酮和丹參酮IIA與RELA，木犀草素和槲皮素與AKT1比其與原始配體的結(jié)合活性還強(qiáng)。對(duì)接結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果的可靠性(表4)。最后，我們利用Pymol軟件對(duì)核心成分與PTGS2、RELA、TNF和AKT1靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能較高的結(jié)果進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖6。

表4 “丹參-丹皮”核心成分與關(guān)鍵靶蛋白的對(duì)接結(jié)果

4 討論

腦卒中屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，中醫(yī)認(rèn)為中風(fēng)之證有風(fēng)、火、痰、瘀、虛之別，但瘀阻腦絡(luò)是貫穿中風(fēng)病始終的病理核心，故常用活血化瘀類中藥治療腦卒中，以消散體內(nèi)瘀血，使新血復(fù)生、血脈暢通[7]。丹參、牡丹皮均為臨床常用活血化瘀類藥物，二者配伍具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，由其組成的多種方劑在腦血管疾病的治療中取得了較好的療效，但具體藥效物質(zhì)和作用機(jī)制仍不清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法對(duì)丹參-丹皮治療腦卒中的藥效物質(zhì)、潛在作用靶點(diǎn)和作用通路進(jìn)行深入探究。

在“丹參-丹皮”成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，篩選得到了66個(gè)候選活性成分，包括44個(gè)丹參酮類、13個(gè)酚酸類(含4個(gè)黃酮類)、3個(gè)甾醇類、3個(gè)萜類、呋喃香豆素類2個(gè)、巴比妥酸類1個(gè)，其中靶點(diǎn)較多的成分為丹參酮類(丹參酮IIA、隱丹參酮等)和酚酸類成分(槲皮素、山奈酚、丹皮酚等)，這與文獻(xiàn)報(bào)道丹參、丹皮的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)相一致[8-10]。同時(shí)，篩選得到了201個(gè)丹參-丹皮成分靶點(diǎn)，其中兩藥的共有靶點(diǎn)77個(gè)，涉及多個(gè)抗氧化、炎癥、凋亡因子，證實(shí)了丹參-丹皮可通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同增效作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，AKT1、TNF、IL6、MAPK8、PTGS2及RELA等炎癥相關(guān)蛋白，均具有較高的度值，處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置，可能是丹參-丹皮發(fā)揮抗腦缺血損傷作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，AKT1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)，又稱Protein Kinase B，在控制細(xì)胞增殖、存活和凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要作用，能被多種上游細(xì)胞因子(如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等)激活，進(jìn)而對(duì)缺血性損傷后的神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用[11]。TNF(腫瘤壞死因子α)和IL6(白介素6)是兩個(gè)非常重要的促炎因子，參與了機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等多種病理過程，其與腦血管疾病的炎癥過程密切相關(guān)，同時(shí)也是IL-17和TNF等信號(hào)通路的重要信號(hào)分子[12]。MAPK8(絲裂原活化蛋白激酶8，又稱JNK1)，屬于MAP激酶和JNK家族成員，激活的JNK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等生理病理過程起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[13]。PTGS2(前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2)，又稱COX-2，作為重要的炎性介質(zhì)存在于炎癥初期到炎癥形成的全過程，PTGS2的過表達(dá)可破壞內(nèi)環(huán)境平衡，參與腦損傷后的炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)腦梗死面積的擴(kuò)大[14]。RELA(轉(zhuǎn)錄因子p65)是NF-κB的一個(gè)亞單位，其翻譯后修飾能夠有效地調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而在炎癥反應(yīng)及其相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[15]。

為了進(jìn)一步說明這些關(guān)鍵作用靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究進(jìn)行了GO功能和KEGG通路富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參-丹皮可能通過參與脂多糖應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、抗凋亡及氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程，在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器部位，發(fā)生蛋白結(jié)合、磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子激活等分子反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、IL-17和TNF信號(hào)通路等發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。其中，IL-17和TNF均是重要的促炎癥細(xì)胞因子，二者所介導(dǎo)的信號(hào)通路與腦卒中后的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[16]。而炎癥反應(yīng)在腦卒中的發(fā)生、發(fā)展以及后期恢復(fù)中均扮演著重要的角色，參與腦卒中病理?yè)p傷的全過程；同時(shí)，PTGS2、RELA、TNF、IL6、AKT1等關(guān)鍵靶點(diǎn)，大部分也顯著富集在TNF信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路上，充分表明丹參-丹皮具有多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同增效作用。

基于成分-靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、丹皮酚和隱丹參酮等可能通過PTGS2、RELA、TNF和AKT1等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。研究表明槲皮素、山柰酚可通過抗腦缺血、抗自由基氧化、抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等對(duì)腦卒中患者起到神經(jīng)保護(hù)作用[17,18]。丹參酮IIA和隱丹參酮對(duì)缺血再灌注腦損傷也具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)，減輕氧化性損傷和改善血腦屏障有關(guān)[19,20]。Liao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠MCAO模型中，丹皮酚表現(xiàn)出保護(hù)缺血腦組織的作用，其機(jī)理可能與抗自由基損傷有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，我們利用分子對(duì)接考察了核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合活性。結(jié)果表明篩選的6個(gè)核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2、RELA、TNF和AKT1的結(jié)合能均<-5 kcal/mol，表明它們具有較好的結(jié)合活性。其中槲皮素、山奈酚與PTGS2，隱丹參酮、丹參酮IIA與RELA，隱丹參酮與TNF-α，木犀草素、槲皮素與AKT1的結(jié)合能均<-7 kcal/mol，部分核心成分與靶蛋白甚至比其與原始配體的結(jié)合活性還強(qiáng)，表明這些成分與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)具有強(qiáng)的結(jié)合活性。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)揭示了丹參-丹皮抗腦缺血損傷的藥效物質(zhì)、關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用通路，并通過分子對(duì)接技術(shù)對(duì)篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)丹參-丹皮可能通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、丹皮酚和隱丹參酮等活性成分，作用于PTGS2、RELA、TNF、IL6、AKT1等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、凋亡及氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程，進(jìn)而調(diào)控IL-17和TNF等信號(hào)通路發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。研究結(jié)果不僅可為下一步研究丹參-丹皮藥對(duì)抗腦缺血損傷的作用機(jī)制提供依據(jù)，也可為該藥對(duì)及其組成方劑的臨床應(yīng)用與開發(fā)提供技術(shù)支撐。