基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的大黃治療阿爾茨海默病作用機(jī)制研究

張運(yùn)輝，周小青，伍大華，楊夢(mèng)琳，鄭彩杏，童天昊

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)；22011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新，長(zhǎng)沙 410208；3重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校中醫(yī)學(xué)院，重慶 404120；4湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)多發(fā)生于老年和老年前期，是一種以進(jìn)行性記憶力喪失、認(rèn)知功能下降、精神行為功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]，是當(dāng)今全球醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)之一[2]。隨著全球老齡化進(jìn)程加快，AD患病數(shù)逐年增加，今后將以每20年遞增1倍的速度增加，預(yù)計(jì)到2050年全世界AD患者將達(dá)1.315億，嚴(yán)重威脅著老年人的健康與生命安全，同時(shí)給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3,4]。目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的抗AD藥物主要是N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(NMDA)受體阻滯劑和乙酰膽堿酯酶(ACHE)抑制劑，但由于上述兩類(lèi)藥物作用靶點(diǎn)廣泛，雖可適度改善患者的癥狀，但仍不能根治、逆轉(zhuǎn)AD的發(fā)展，且長(zhǎng)期服用會(huì)引起嚴(yán)重的副作用[5]。目前，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注中藥及其活性成分抗AD效應(yīng)，中醫(yī)藥具有整體性和多樣性的特點(diǎn)，可發(fā)揮多成分、多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、雙向調(diào)節(jié)的綜合作用，且毒性明顯小于化學(xué)藥，與AD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和綜合性的特征非常契合。

大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是蓼科植物藥用大黃、唐古特大黃、掌葉大黃的干燥根和根莖，性寒,味苦，歸脾、胃、大腸、肝、心經(jīng)。具有瀉下攻積、清熱瀉火、解毒、活血祛瘀之效。中醫(yī)對(duì)AD的病機(jī)認(rèn)識(shí)，認(rèn)為“腦消髓減”為疾病基礎(chǔ)，“痰瘀阻絡(luò)”為標(biāo)，近年更發(fā)展AD的“毒損腦絡(luò)”的病機(jī)。Wang等[6]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，(1)AD大鼠伴有腸源性?xún)?nèi)毒素，其腦組織及血漿中TNF-α、IL-lβ、IL-10含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明可能腸源性?xún)?nèi)毒素參與了AD的病理反應(yīng)過(guò)程，促成慢性炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)；(2)AD模型大鼠血腦屏障下降，通透性增高，使得正常情況下不能通過(guò)血腦屏障的內(nèi)毒素進(jìn)入腦內(nèi)，引發(fā)局部炎癥；研究結(jié)果提示腸源性?xún)?nèi)毒素在AD形成中有重要作用。大黃具有“以通為補(bǔ)”的作用，并能通腑降濁、活血祛瘀、清熱解毒，有“蕩滌腸胃”、“推陳致新”的作用，減少體內(nèi)腸源性?xún)?nèi)毒素的集聚，能針對(duì)AD“腦消髓減、痰瘀阻絡(luò)、毒損腦絡(luò)”的病機(jī)，可以很好的運(yùn)用于認(rèn)知功能的改善。因此，深入探討大黃的作用靶點(diǎn)，分析其可能抗AD的作用機(jī)制，對(duì)于闡述大黃的科學(xué)內(nèi)涵具有重要作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可研究藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系，可通過(guò)整合中藥化學(xué)成分、疾病靶標(biāo)構(gòu)建“化學(xué)成分-作用靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[7]”，將相互作用關(guān)系可視化為網(wǎng)絡(luò)模型，并從分子層面和整體的角度研究藥物對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)的影響。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建有效成分-靶標(biāo)作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)深入探討大黃治療AD的作用機(jī)制，為今后治療AD中藥研究提供方向和思路。

1 材料與方法

1.1 大黃有效成分及其靶點(diǎn)的篩選

以“Radix et Rhizoma Rhei”為關(guān)鍵詞，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查詢(xún)大黃的有效成分，本研究基于ADME(藥物吸收、分布、代謝、排泄)模型，運(yùn)用OBioavail 1.1來(lái)預(yù)測(cè)有效成分的口服利用度(oral bioavailability，OB)，對(duì)大黃的化學(xué)成分進(jìn)行OB和類(lèi)藥性(drug likeness，DL)篩選，并設(shè)置OB≥30%及DL≥18%作為篩選條件[8]。最后，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)并借助Perl語(yǔ)言，將靶點(diǎn)的“蛋白名(protein name)”統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“基因名(genename)”，得到的信息用于后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析。

1.2 AD疾病相關(guān)基因檢索

在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https//www.drugbank.ca/)、Dis Ge NET數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.disgenet.org/)和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(https//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)中篩選治療阿爾茨海默病的相關(guān)靶點(diǎn)，以“Alzheimer”為檢索關(guān)鍵詞，并對(duì)檢索到的靶點(diǎn)進(jìn)行處理，之后將三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)項(xiàng)去除從而獲得最終的疾病靶點(diǎn)。

1.3 大黃有效成分與AD共同靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將大黃有效成分的相關(guān)靶點(diǎn)和AD的靶點(diǎn)導(dǎo)入OmicShare平臺(tái)(https://www.omicshare.com/)找出大黃有效成分與AD的交集靶點(diǎn)，再將這些交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”(人源)進(jìn)行操作，最小相互作用閥值設(shè)為“medium confidence=0.4”，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，即“大黃-靶點(diǎn)-阿爾茨海默病”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 關(guān)鍵靶基因的篩選

應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯?jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)整體的點(diǎn)度中心性(degree centrality，DC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和中介中心性(betweenness centrality，BC)”，以betweenness、closeness和degree的均數(shù)為“閾值”，選取betweenness、closeness和degree同時(shí)在閾值之上的靶點(diǎn)為“關(guān)鍵靶基因”，明確PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶基因。

1.5 關(guān)鍵靶基因的代謝通路與生物過(guò)程分析

為進(jìn)一步研究大黃抗AD的作用情況，采用Metascape平臺(tái)對(duì)大黃的AD靶點(diǎn)群進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，研究大黃靶點(diǎn)的主要抗AD代謝通路；再進(jìn)行GO生物過(guò)程富集分析，詮釋大黃靶點(diǎn)的抗AD生物過(guò)程，Metascape的平臺(tái)列表與背景均選擇“Homo Sapiens”(人源)進(jìn)行操作。篩選出AD與大黃有效成分相關(guān)性前20的分子功能和前10的信號(hào)通路。

1.6 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將大黃有效成分、對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建大黃有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.7 體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.7.1 細(xì)胞與試劑

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜絡(luò)細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞(長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司)；Aβ25-35(美國(guó)Sigma公司)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(均購(gòu)自南京建成生物研究所)；ELISA測(cè)定試劑盒、生化試劑(南京建成生物研究所)；Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(晶美公司)；PI3K、Akt、Nrf2、HO-1、NF-κBp65引物合成(由上海生工生物工程有限公司提供)；TB Green Premix Ex Taq PCR試劑盒(TAKARA公司);總RNA抽提試劑(Trizol)(寶生物工程(大連)有限公司)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)；10%新生小牛血清(Hyclone Lab)；PBS(北京索萊寶科技有限公司)；FBS(吉泰遠(yuǎn)成生物科技有限公司)。大黃，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)鑒定為蓼科植物大黃的干燥塊根，取100 g經(jīng)水提、蒸發(fā)、濃縮至不流動(dòng)的清膏，使用時(shí)稱(chēng)取適量，溶解，過(guò)濾膜除菌后于-20 ℃保存。

1.7.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù)

PC12細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、1% P/S)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為5組。對(duì)照組：加入不含 FBS、P/S的DMEM中孵育24 h；模型組：予Aβ25-35(20 μmol/L)孵育24 h[9]；大黃低劑量組(1 mg/mL)、大黃中劑量組(2 mg/mL)、大黃高劑量組(4 mg/mL)孵育24 h。

1.7.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將5×MTT用稀釋液稀釋成1×MTT溶液；每孔加50 μL 1×MTT溶液，37 ℃孵育4 h；棄上清液，每個(gè)孔加入200 μLDMSO，在平板搖床上搖2～3分鐘使其均勻。酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每個(gè)孔PC12細(xì)胞的吸光度值。

根據(jù)公式計(jì)算PC12細(xì)胞的存活率：

100%

1.7.4 ELISA檢測(cè)PC12細(xì)胞上清液IL-1β、IL-6和TNF-α含量

PC12細(xì)胞以1×107接種于96孔板中，100 μL/孔，當(dāng)80%融合時(shí)，分別給予各組處理因素，每組3個(gè)復(fù)孔。按實(shí)驗(yàn)要求處理完成后，收集上清液留作待測(cè)標(biāo)本。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)，按照 ELISA測(cè)定試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.7.5 比色法檢測(cè)PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清SOD、GSH-Px和MDA

冰上裂解細(xì)胞，離心，取上清，制成樣品溶液，按谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.7.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡率

按凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，培養(yǎng)的PC12細(xì)胞經(jīng)不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶消化處理,冰上裂解、離心收集細(xì)胞,沉淀加入結(jié)合緩沖液后加入FITC-AnnexinV和PI,室內(nèi)避光孵15 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞,用凋亡分析軟件計(jì)算PC12細(xì)胞凋亡率,每一時(shí)相點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)5次。

1.7.7 熒光定量法檢測(cè)PC12細(xì)胞上清PI3K、Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)

采用Trizol抽提各組總RNA，超微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定總RNA濃度，利用Ta Ka Ra試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)為cDNA，SYBR Premix Ex Taq II 10 μL、上下游引物各1μL、DNA模板2 μL、雙蒸水6 μL，共20 μL，混合均勻，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將得到的c DNA產(chǎn)物根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制如下反應(yīng)體系：預(yù)變性95 ℃、30 s；PCR反應(yīng)95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，反應(yīng)重復(fù)35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

1.7.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 24.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，方差齊者用LSD檢驗(yàn)(方差不齊者先將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后使之方差齊)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 大黃有效成分的篩選

如表2所示，本研究共篩選出大黃中含有的17個(gè)有效成分(M1～M17)。

表2 大黃有效成分

2.2 有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選后的17個(gè)有效成分及276個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1構(gòu)建“大黃有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”(圖1)。17個(gè)紅色菱形表示大黃的活性成分，276個(gè)綠色三角形為活性成分作用靶點(diǎn)，共有1 211條邊代表靶點(diǎn)和化學(xué)成分之間的相互作用， 體現(xiàn)了大黃多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖1 大黃有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The gene target network of the effective components of Radix et Rhizoma Rhei注：紅色菱形：大黃活性成分；綠色三角形：靶基因。Note:Red diamond:Active components of Radix et Rhizoma Rhei;Green triangle:Target gene.

2.3 阿爾茨海默病相關(guān)基因

在Drugbank、Dis Ge NET和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索AD的靶基因，共得到2 245個(gè)基因。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

在Drugbank、Dis Ge NET和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索AD的靶基因與大黃作用的靶基因有107個(gè)重復(fù)，這107個(gè)靶基因可能為大黃抗阿爾茨海默病的靶點(diǎn)。為研究各靶點(diǎn)在體內(nèi)的相互作用關(guān)系，尋找核靶點(diǎn)，將潛在靶點(diǎn)蛋白群進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(見(jiàn)圖2)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)107個(gè)靶蛋白發(fā)生相互作用，產(chǎn)生786條代表蛋白之間相互作用的邊。

圖2 靶蛋白 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of target protein

2.5 核心靶點(diǎn)分析結(jié)果

Cytoscape 3.7.1計(jì)算得到，PPI網(wǎng)絡(luò)平均度值為14.32，平均介數(shù)為3.72×10-2，平均緊密度為0.67，度值、介數(shù)和緊密度均超過(guò)平均值的靶蛋白共8個(gè)，依次為APP、TNF、SOD2、CASP3、CASP7、BAX、Bcl-2、IL2，說(shuō)明以上8個(gè)靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置，很可能是大黃抗AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.6 Metascape分析的KEGG和GO結(jié)果

通過(guò)GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析，大黃有效成分靶標(biāo)與AD疾病靶標(biāo)基因功能有炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)、MAPK活性的正調(diào)控、老化、記憶、調(diào)亡過(guò)程、神經(jīng)元凋亡過(guò)程的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、cAMP生物合成過(guò)程、調(diào)節(jié)活性氧代謝過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、缺氧反應(yīng)等條目(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明大黃治療AD的機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、cAMP生物合成過(guò)程等密切相關(guān)。

圖3 有效組分-基因靶點(diǎn)-分子功能的GO富集氣泡圖Fig.3 Bubble chart of GO enrichment of effective components-gene targets-molecular functions

通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)富集大黃治療AD關(guān)鍵靶標(biāo)所參與的通路主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、Nrf2/HO-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、TLR4信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、阿爾茨海默病等(見(jiàn)圖4)，說(shuō)明大黃可能主要通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)防治AD。

圖4 前10個(gè)代表性的通路Fig.4 Top 10 representative pathways

2.7 MTT法檢測(cè)各組PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率比較

采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表3所示：與對(duì)照組比較，模型組的PC12細(xì)胞的存活率明顯減低，有顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，隨著大黃濃度增加，PC12細(xì)胞存活率顯著上升(P<0.05，P<0.01)，表明大黃對(duì)PC12細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用。

表3 各組細(xì)胞存活率的比較

2.8 ELISA檢測(cè)PC12細(xì)胞上清液IL-1β、IL-6和TNF-α含量

結(jié)果見(jiàn)表4，大黃作用PC12細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較模型組PC12細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，大黃中、高劑量組的PC12細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，表明大黃對(duì)PC12細(xì)胞的炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用。

表4 各組PC12細(xì)胞上清液中IL-1β、 IL-6和TNF-ɑ 含量比較

2.9 各組PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清SOD、GSH-Px和MDA比較

結(jié)果見(jiàn)表5，與對(duì)照組比較，模型組SOD、GSH-Px活力下降，MDA含量增高(P<0.01)。與模型組比較，大黃各組SOD、GSH-Px活力均明顯升高，MDA含量減少(P< 0.05，P< 0.01)，表明大黃對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有明顯的抑制作用。

表5 各組PC12細(xì)胞上清液中SOD、GSH-Px和MDA比較

2.10 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組PC12細(xì)胞的凋亡率比較

結(jié)果見(jiàn)表6，正常PC12細(xì)胞也有一定比例的凋亡率,與對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，隨著大黃濃度增加，PC12細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05，P<0.01)，表明大黃對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡具有明顯的抑制作用。

表6 各組PC12細(xì)胞凋亡率的比較

2.11 各組PC12細(xì)胞上清液PI3K、Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB p65 mRNA的表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)表7，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，PI3K、Akt、Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，大黃各組能夠顯著降低NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)，顯著提高PI3K、Akt、Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)。說(shuō)明大黃能夠明顯抑制NF-κB p65基因的表達(dá)，促進(jìn)PI3K、Akt、Nrf2、HO-1基因的表達(dá)。

表7 各組PC12細(xì)胞PI3K、Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較

3 討論與結(jié)論

AD是老年癡呆中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，是神經(jīng)系統(tǒng)至今仍未解決的重大難題，目前仍缺乏有效的治療方法。隨著全球人口老齡化進(jìn)程加快，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)老年人健康和生活質(zhì)量造成巨大威脅，并給全世界帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。Su等[10]研究發(fā)現(xiàn)，“毒損腦絡(luò)”己經(jīng)成為AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，貫穿于整個(gè)AD的病理演變過(guò)程。大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歸脾、胃、大腸、肝、心經(jīng)。具有瀉下攻積、清熱瀉火、解毒、活血祛瘀之功。Tian[11]認(rèn)為大黃有以通為補(bǔ)的功效，促進(jìn)胃腸系統(tǒng)降濁受納，并認(rèn)為“濁”是腸道內(nèi)毒素，可能損傷機(jī)體，大黃能夠促進(jìn)補(bǔ)益藥物的補(bǔ)益作用，更好的發(fā)揮“補(bǔ)腎填精”的作用，而且大黃具有活血化瘀的功效，能消痰濁瘀血通絡(luò)，能通腑降濁，解火熱毒邪，對(duì)應(yīng)中醫(yī)“腦消髓減、痰瘀阻絡(luò)、毒損腦絡(luò)”的AD病機(jī)。

本研究通過(guò)TCMSP平臺(tái)的OB和DL篩選，共篩選出大黃17個(gè)有效成分，涉及107個(gè)AD 靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路162個(gè)。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明大黃可能通過(guò)作用于APP、TNF、SOD2、CASP3、CASP7、BAX、Bcl-2等關(guān)鍵靶點(diǎn)。

在本研究篩選出的信號(hào)通路中，與大黃有效靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度最高的是PI3K-Akt信號(hào)通路，其次是Nrf2/HO-1信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路。PI3K/Akt通路是一條經(jīng)典且重要的信號(hào)途徑，參與了包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞調(diào)亡、炎癥反應(yīng)等重要的細(xì)胞活動(dòng)。許多研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元的氧化損傷是AD發(fā)病極早期的重要病理事件，AD患者腦內(nèi)PI3K/Akt 通路抑制，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12,13]，而激活PI3K/Akt信號(hào)通路可抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)[14,15]。Qi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt 信號(hào)途徑可降低AD模型小鼠tau蛋白磷酸化水平，提高其學(xué)習(xí)記憶能力。Nrf2/HO-1信號(hào)通路是調(diào)控AD過(guò)程中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的重要信號(hào)通路，Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活可以顯著增加大腦皮質(zhì)和海馬組織的抗炎和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)能力，抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17-20]。近年來(lái)關(guān)于PI3K/Akt信號(hào)通路的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其信號(hào)通路途徑與HO-1的表達(dá)存在密切關(guān)系，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活能明顯促進(jìn)Nrf2、HO-1基因表達(dá)上調(diào)，激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的作用[21-24]。NF-κB信號(hào)通路不僅參與學(xué)習(xí)記憶、機(jī)體免疫、神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)，還參與神經(jīng)系統(tǒng)中多種基因的調(diào)控、細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程[25,26]，在一定程度上影響AD的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Nrf2/HO-1與NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，Nrf2和NF-κB在保持細(xì)胞氧化還原平衡及對(duì)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中是兩條關(guān)鍵的信號(hào)通路，兩條信號(hào)通路借由一序列復(fù)雜的分子間作用互相影響[27]。NF-κB與Nrf2負(fù)性相關(guān)，Nrf2的增多會(huì)致使NF-κB表達(dá)下調(diào)，從而拮抗炎癥反應(yīng)。

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，本研究選擇了大黃對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率、凋亡率、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明大黃能有效抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和提高其細(xì)胞存活率，上調(diào)PI3K、Akt、Nrf2、HO-1基因，下調(diào)NF-κB基因。

綜上，大黃具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同治療阿爾茨海默病的作用。本文基于系統(tǒng)藥理學(xué)研究大黃對(duì)阿爾茨海默病的具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制，對(duì)今后臨床運(yùn)用大黃治療阿爾茨海默病具有重要指導(dǎo)意義。