異槲皮苷對(duì)Aβ25-35導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

鄭傳癡，周旭美，高健美*

1遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科；2遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遵義 563000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見(jiàn)于老年期的以進(jìn)行性認(rèn)知能力下降和社會(huì)功能障礙為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。據(jù)報(bào)道，預(yù)計(jì)到2050年AD患者總數(shù)預(yù)計(jì)達(dá)1億3 150萬(wàn)，不僅嚴(yán)重影響中老年人身體健康和生活質(zhì)量，而且給患者和家庭帶來(lái)了沉重的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。而隨著我國(guó)人口老齡化加速，AD在老年人疾病譜中的地位日益突顯。因此，對(duì)AD的防治研究是全球關(guān)注的重點(diǎn)。AD的典型病理特征為β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)沉積形成的老年斑，細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失[2]。但是其作用機(jī)制復(fù)雜，目前尚不清楚。其中，Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致AD的重要因素之一[3]。因此，研發(fā)抗Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的藥物意義重大。但目前尚無(wú)理想的防治AD的藥物。

我國(guó)中草藥資源十分豐富，某些記載的具有抗衰老和促智的傳統(tǒng)中藥已被證明可以改善AD動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)和記憶能力[4]。因此，從中草藥及其活性成分等天然產(chǎn)物中尋找有效的防治AD的藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。異槲皮苷是多種中藥(例如多穗石柯、紅景天、桑葉、白花蛇舌草)的黃酮醇苷類活性成分之一，具有抗人肝癌細(xì)胞HepG2增殖作用[5]、抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用[6]、保護(hù)叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞氧化損傷的作用[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，異槲皮苷能夠抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的保護(hù)作用[8]，但是，其對(duì)AD細(xì)胞模型是否具有保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞建立體外AD模型，從氧化應(yīng)激的角度探討異槲皮苷的神經(jīng)保護(hù)作用并初步分析其作用機(jī)制，為異槲皮苷臨床用于防治AD提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

異槲皮苷(成都普思生物科技股份有限公司，純度>98%，批號(hào)PS000510)。試驗(yàn)藥物用DMSO溶解，-20 ℃凍存，臨用前用DMEM培養(yǎng)液稀釋，采用0.22 μm微孔濾器過(guò)濾除菌，備用。

1.2 細(xì)胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12來(lái)源于American Type Culture Collection (ATCC，Rockville，MD，USA)。接種于含10%胎牛血清，2%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)；Aβ25-35(Sigma公司)；甲基噻唑藍(lán)(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、p-AMPK、過(guò)氧化物增殖體受體輔激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1α，PGC-1α)、沉默信息調(diào)節(jié)因子3(sirtuin3，Sirt3)和異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH2)抗體(Abcam公司)。

1.4 主要儀器

FormaTMSteri-CycleTMi250型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific)；CX31型倒置顯微鏡(日本Olympus)；IX73型熒光顯微鏡(日本Olympus)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)；全自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。

1.5 方法

1.5.1 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

從RSCB 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中下載 AMPK蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：2UV5)，使用AutoDockTools1.5.6軟件將晶體結(jié)構(gòu)中的水分子刪除，進(jìn)行加氫處理后保存為pdbqt格式文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載異槲皮苷化合物2D及3D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件。利用Pymol軟件進(jìn)行蛋白小分子結(jié)構(gòu)處理，運(yùn)用AutoDock vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

1.5.2 Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞毒性損傷的濃度選擇

將濃度為1×105個(gè)/mL的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12 細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后，分別加入終濃度為5、10、20、40、80 μmol/L Aβ25-35溶液，分別作用培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔加入 25 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)作用4 h后，棄上清， 每孔加入150 μL二甲基亞砜，震搖10 min后，于酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以1×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組(Aβ25-35)、異槲皮苷給藥組(1、10和100 μmol/L)。不同濃度1、10和100 μmol/L異槲皮苷預(yù)處理1 h后，再加入Aβ25-35繼續(xù)作用48 h。

1.5.4 MTT法檢測(cè)異槲皮苷對(duì)Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項(xiàng)方法經(jīng)藥物處理后，每孔加入25 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶解，振搖10 min后，于酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

1.5.5 LDH釋放率檢測(cè)異槲皮苷對(duì)Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項(xiàng)方法經(jīng)藥物處理后，以4 000 rpm在4 ℃條件下離心10 min后，取上清，嚴(yán)格按照 LDH 測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定LDH釋放率。

1.5.6 形態(tài)學(xué)觀察

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項(xiàng)方法接種于6孔板，經(jīng)藥物處理后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。

1.5.7 異槲皮苷對(duì)ROS、MDA含量、SOD和GSH-Px活力的影響

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項(xiàng)方法經(jīng)藥物作用48 h后，3 000 rpm在4 ℃條件下離心10 min后，取上清，嚴(yán)格按照試劑盒操作測(cè)定ROS和MDA含量以及SOD和GSH-Px活力。

1.5.8 Western blot法檢測(cè)AMPK、PGC-1α、Sirt3、IDH2蛋白表達(dá)

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項(xiàng)方法經(jīng)藥物處理后，提取PC12細(xì)胞總蛋白后，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加熱使之變性后，每孔上樣30 μg，經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉凝膠電泳后，將蛋白采用半干法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，封閉2 h后，加入相應(yīng)一抗：p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、Sirt 3(1∶1 000)、IDH2(1∶1 000)，于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后3次后，以辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗封閉孵育1 h后，采用ECL發(fā)光法經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，條帶灰度值分析采用Image J軟件。

1.5.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 異槲皮苷作用于AMPK蛋白的分子對(duì)接結(jié)果

通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)分析異槲皮苷與AMPK結(jié)合情況的研究結(jié)果顯示：異槲皮苷與AMPK蛋白的結(jié)合能為﹣9.48 kJ/mol，其結(jié)合能≤﹣5 kJ/mol說(shuō)明異槲皮苷能夠與AMPK蛋白結(jié)合。其氨基酸結(jié)合位點(diǎn)主要包括：ASN256、LEU249和LYS253(圖1)。以上結(jié)果提示AMPK可能為異槲皮苷對(duì)Aβ25-35導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的潛在靶點(diǎn)。

圖1 異槲皮苷與AMPK對(duì)接模式圖Fig.1 The molecular docking pattern diagram of isoquercitrin with AMPK注：A：異槲皮苷與AMPK結(jié)合表面3D可視化圖；B：異槲皮苷與AMPK結(jié)合位點(diǎn)的3D可視化結(jié)果；C：異槲皮苷與AMPK結(jié)合位點(diǎn)的2D模式圖。Note:A:3D visualization bingding surface of isoquercitrin with AMPK;B:3D visualization bingding sites of isoquercitrin with AMPK;C:2D visualization bingding sites of isoquercitrin with AMPK.

2.2 Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞損傷的濃度選擇

通過(guò)MTT法檢測(cè)Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較，5、10、20、40、80 μmol/L Aβ25-35能夠顯著抑制PC12細(xì)胞的活力(P<0.05)。由于20 μmol/L Aβ25-35作用48 h存活率接近50%，因此確定20 μmol/L Aβ25-35作用48 h為最佳作用濃度和時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞損傷的影響Fig.2 The effect of Aβ25-35 on PC12 cell 注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；** P<0.01。Note:Compared with control,*P<0.05;**P<0.01.

2.3 異槲皮苷對(duì)Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞存活率和LDH含量的影響

模型組(Aβ25-35)細(xì)胞活力較空白對(duì)照組顯著降低，LDH含量明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，異槲皮苷(1、10和100 μmol/L)作用48 h能夠濃度依賴性的增加細(xì)胞存活率，降低LDH含量(P<0.05，P<0.01)(圖3、圖4)。

圖3 異槲皮苷對(duì)Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞存活率和LDH含量的影響Fig.3 The effect of isoquercitrin on cell viability of 注：A：正常對(duì)照；B：模型；C：異槲皮苷1 μmol/L；D：異槲皮苷10 μmol/L；E：異槲皮苷100 μmol/L。 與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，下同。Note:A:Control;B:Model;C:Isoquercitrin 1 μmol/L;D:Isoquercitrin 10 μmol/L;E:Isoquercitrin 100 μmol/L.Compared with normal group,**P < 0.01;Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01,the same below.

圖4 異槲皮苷對(duì)Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞LDH含量的影響Fig.4 The effect of isoquercitrin on LDH level of

2.4 異槲皮苷對(duì)Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

模型組(Aβ25-35)細(xì)胞較正常對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)皺縮、變圓且部分漂浮在培養(yǎng)液中；異槲皮苷(1、10和100 μmol/L)作用后較模型組細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)均有所改善(圖5)。

圖5 異槲皮苷對(duì)Aβ25-35導(dǎo)致?lián)p傷的PC12細(xì)胞形態(tài)的影響(200 ×)Fig.5 The effect of isoquercitrin on cell morphology of Aβ25-35-induced PC12 cell injury (200 ×)

2.5 異槲皮苷對(duì)ROS、MDA含量和GSH-Px、SOD活性的影響

結(jié)果顯示，Aβ25-35模型組較正常對(duì)照組ROS和MDA含量顯著增加；而異槲皮苷(1、10和100 μmol/L)組較模型組ROS和MDA含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。同時(shí)，Aβ25-35模型組較正常對(duì)照組SOD和GSH-Px活力顯著降低；異槲皮苷(1、10和100 μmol/L)組較Aβ25-35模型組SOD和GSH-Px的活性明顯增加(P<0.05，P<0.01)(表1)。

表1 異槲皮苷對(duì)ROS、MDA含量和GSH-Px、SOD活性的影響

2.6 異槲皮苷對(duì)AMPK、PGC-1α、Sirt3、IDH2蛋白表達(dá)的影響

Aβ25-35模型組較正常對(duì)照組p-AMPK水平、PGC-1α、Sirt3和IDH2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；而異槲皮苷較Aβ25-35模型組p-AMPK水平、PGC-1α、Sirt3和IDH2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05，P<0.01)(圖6、圖7)。

圖7 異槲皮苷對(duì)AMPK、PGC-1α、Sirt3、IDH2蛋白表達(dá)的影響Fig.7 The effect of isoquercitrin on AMPK,PGC-1α,Sirt3 and IDH2 protein

3 討論

最近文獻(xiàn)報(bào)道，異槲皮苷能夠減少Aβ誘導(dǎo)的小鼠大腦淀粉樣變性，但是其作用機(jī)制尚不明確[9]。值得注意的是，異槲皮苷能夠通過(guò)激活調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝的重要激酶AMPK發(fā)揮抗脂質(zhì)代謝紊亂的作用。因此，我們推測(cè)AMPK可能為異槲皮苷防治AD的作用靶點(diǎn)。分子對(duì)接是一種通過(guò)模擬配體和受體相互作用來(lái)篩選小分子化合物的藥物設(shè)計(jì)方法。可通過(guò)構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接模型，分析小分子化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用[10]。因此，本研究首先采用分子對(duì)接技術(shù)分析異槲皮苷與AMPK的結(jié)合情況。研究結(jié)果顯示，異槲皮苷能夠與AMPK結(jié)合，提示AMPK可能為異槲皮苷防治AD的作用靶點(diǎn)。

目前，Aβ沉積被認(rèn)為是AD發(fā)病的始動(dòng)因素和病理改變的重要因素，因此，本研究采用了公認(rèn)的Aβ25-35導(dǎo)致神經(jīng)元損傷模型建立體外AD模型進(jìn)一步觀察異槲皮苷的神經(jīng)保護(hù)作用[11]。本研究結(jié)果顯示，Aβ25-35明顯減低細(xì)胞活力，增加細(xì)胞LDH含量，提示Aβ25-35損傷細(xì)胞嚴(yán)重，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。而異槲皮苷能夠濃度依賴性的增加Aβ25-35損傷的細(xì)胞活力并降低其LDH含量，表明異槲皮苷具有保護(hù)Aβ25-35導(dǎo)致的細(xì)胞損傷作用，但是其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。氧化應(yīng)激損傷是指體內(nèi)的ROS(主要包括羥自由基、過(guò)氧化氫、超氧陰離子等)與體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)(主要包括SOD、GSH-Px)失平衡導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，Aβ25-35可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA明顯增加，同時(shí)降低抗氧化物酶SOD和GSH-Px的活力，表明Aβ25-35可導(dǎo)致神經(jīng)元氧化損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13,14]。而異槲皮苷能夠濃度依賴性的減少ROS和MDA含量并提高抗氧化物酶活力，提示異槲皮苷對(duì)Aβ25-35導(dǎo)致的細(xì)胞損傷作用與其提高抗氧化物酶活力而清除Aβ25-35產(chǎn)生的過(guò)多ROS有關(guān)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AMPK/Sirt3信號(hào)通路與Aβ導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而引發(fā)AD的發(fā)生關(guān)系密切[15]。其中AMPK的活化可減少腦內(nèi)Aβ的沉積[12]。Sirt3是Sirtuin家族在進(jìn)化上高度保守的成員之一，在氧化應(yīng)激導(dǎo)致的AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。值得注意的是，AMPK能夠通過(guò)磷酸化激活其下游的PGC-1α進(jìn)而活化Sirt3，Sirt3可進(jìn)一步激活其下游的IDH2發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用[16,17]。本研究結(jié)果顯示，Aβ25-35明顯降低AMPK的磷酸化水平及其下游PGC-1α的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Sirt3及其下游IDH2的表達(dá)，表明AMPK/Sirt3信號(hào)通路在Aβ導(dǎo)致的AD中發(fā)揮重要作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18,19]。而異槲皮苷可顯著增加AMPK的磷酸化水平及其下游PGC-1α的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Sirt3及其下游IDH2的表達(dá)，表明異槲皮苷通過(guò)調(diào)控AMPK磷酸化進(jìn)而激活Sirt3發(fā)揮抗Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用。盡管本研究初步明確了異槲皮苷對(duì)Aβ25-35導(dǎo)致的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，但是其具體作用機(jī)制仍需深入研究。在進(jìn)一步的研究中將采用AMPK的抑制劑或其他信號(hào)通路相關(guān)siRNA干擾手段，驗(yàn)證該信號(hào)通路是否參與其中并在體內(nèi)動(dòng)物模型中進(jìn)一步確定其藥效及其可能的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，異槲皮苷能夠抑制Aβ25-35導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷，其作用與激活A(yù)MPK/Sirt3信號(hào)通路有關(guān)，但是仍需通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定其藥效及其作用機(jī)制。