沙棘果渣總黃酮提取工藝優化及抗氧化活性研究

田建華，張春媛，魏 璐

山西省林業和草原科學研究院，太原 030002

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)別名酸刺、醋柳，是一種雌雄異株、生態適應性很廣的胡頹子科灌木或喬木，同時也是極為珍貴的藥食同源植物[1]，并收錄于《中國藥典》[2]。沙棘富含多種維生素[3]、脂肪類[3]、多酚[4]等多種生物活性物質，具有抗炎[5]和抗衰老[6]等作用，被廣泛應用于食品和保健品[7]等領域。沙棘黃酮主要存在于沙棘果、葉及果渣中，是重要的生物活性物質，具有扼制動脈粥樣硬化[8]、降血糖血脂[9]、治療腸道疾病[10]、抗腫瘤[11]等多種功能，同時沙棘黃酮是優良的活性氧清除劑和脂質抗氧化劑，能夠清除自由基，延緩機體衰老[12]，引起越來越多的關注和研究。

沙棘黃酮的提取方法主要有水浸提法[13,14]、有機溶劑提取法等[12]，這些傳統的提取法存在提取時間長、提取率低、溶劑消耗量大以及高溫使黃酮類物質變性等弊端。近年來，一些新型高效的提取技術及方法引起了研究人員的高度關注。其中，超聲波萃取法[15]具有提取溫度低、時間短、提取率較高的優勢；酶法[16]提取可以在常溫和非有機溶劑下進行，得到的產物純度、穩定性及活性都較高，同時酶法具有能耗和投資成本較低、性價比高的優勢。果膠酶能降解植物材料使細胞壁結構松散，甚至能完全水解植物材料，將活性成分釋放。但是利用果膠酶協同超聲波輔助提取法從沙棘果渣中提取黃酮類化合物的研究還鮮有報道。因此，本試驗以沙棘果渣為研究材料，利用果膠酶協同超聲波法提取沙棘總黃酮，通過Design-Expert 8.06軟件優化試驗，確定其最佳提取條件；其次通過對DPPH自由基清除、羥自由基清除和超氧陰離子自由基清除指標進行分析，評價其抗氧化活性，旨在為沙棘果渣總黃酮的研究及開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘果渣(山西省某沙棘飲料廠)；蘆丁(CAS153-18-4，HPLC ≥ 98%，成都曼斯特生物科技有限公司)；果膠酶、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、過氧化氫、濃鹽酸、二丁基羥基甲苯(BHT)、鄰二氮菲、磷酸鹽緩沖液(PBS)、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑皆為市售國產分析純試劑；試驗用水為雙蒸水。

JYL-C020E粉碎機(九陽股份有限公司)；Explorer pro分析天平(奧豪斯儀器有限公司)；BXH-65S精密可程式烘箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；HH數顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司)；KQ-200VD型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV3100PC紫外-可見分光光度計(美普達儀器有限公司)；SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理

將沙棘果渣于60 ℃鼓風干燥箱中干燥24 h，粉碎，過80目篩，備用。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制

配置0.2 mg/mL蘆丁標準溶液，分別吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4%NaOH溶液10 mL，加30%乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min。于510 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 沙棘果渣總黃酮提取及含量測定

準確稱取沙棘果渣干粉1.000 g，置于100 mL錐形瓶中，按一定比例的酶添加量、液料比、一定乙醇濃度、提取溫度、提取時間、一定功率超聲提取總黃酮，提取液在室溫下離心，取上清液于100 mL容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液，每個樣品重復三次。分別量取各供試品溶液3 mL，按制作標準曲線的同樣方法，測定樣品溶液的吸光度。根據標準曲線計算出總黃酮的質量濃度，再按以下公式計算沙棘果渣總黃酮提取率：

總黃酮提取率(mg/g)=

1.2.4 單因素試驗

以酶添加量、液料比、乙醇濃度、超聲時間、超聲提取溫度、超聲功率6個因素進行單因素設計，設定酶添加量1%、2%、3%、4%、5%、6%(占沙棘果渣干重)；液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1；乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；超聲提取時間30、40、50、60、70、80、90、100 min；提取溫度40、50、60、70、80 ℃；超聲功率50%、60%、70%、80%、90%(總功率500 W)，分析各單因素對沙棘果渣黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應面設計方案

在單因素試驗的基礎上，選定酶添加量(A)、液料比(B)、超聲提取時間(C)3個因素為響應變量，總黃酮提取率為響應值，進行響應面優化試驗。采用Design Expert 8.06軟件，進行Box-Behnken試驗方案，設計三因素三水平試驗方案，以二次多元回歸方程擬合各因素和總黃酮提取率之間的函數關系。試驗因素水平見表1。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測定

參照Sun等[17]的方法，取質量濃度不同的沙棘果渣黃酮提取液1.0 mL，加入0.004%的DPPH溶液4 mL，充分混勻，黑暗條件下靜置30 min，以無水乙醇作空白對照，相應濃度的BHT作陽性對照，于517 nm處測定其吸光值。每一樣品平行測3次，取其平均值。清除率公式可表示為:

DPPH自由基清除率=(A2-A1)/A2×100%

式中：A1為樣品或陽性對照的吸光度值；A2為空白對照的吸光度值。

表1 響應面試驗因素水平表

1.2.7 羥自由基的清除能力測定

參照Hou等[18]的方法改進，于若干比色管中分別加入7.5 mmol/mL硫酸亞鐵溶液1 mL，7.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，不同濃度待測總黃酮提取液1 mL(空白對照以蒸餾水代替總黃酮提取液)，最后加8.8 mol/L過氧化氫溶液1 mL，35 ℃水浴35 min，于510 nm波長處測其吸光度，測其本底值時用蒸餾水代替過氧化氫，同時以相應濃度的BHT作陽性對照。根據以下公式計算其清除率：

羥自由基清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×

100%

式中：A0是空白對照吸光度；Ax是加入樣品溶液或BHT后的吸光度；Ax0是本底吸光度。

1.2.8 超氧陰離子的清除能力測定

參照Wang等[19]的方法改進，于若干比色管中分別加入0.05 mol/L的Tris-HCl溶液(pH 8.2)4.5 mL并于25 ℃下水浴保溫20 min，加入0.1 mL不同濃度總黃酮提取液，加入0.3 mL的3 mmol/L的鄰苯三酚(用10 mmol/L的HCl配置)，混勻后20 ℃水浴6 min，隨即加入2滴8 mol/L HCl終止反應，320 nm處測定吸光度。空白對照以蒸餾水取代總黃酮提取液，其余步驟相同。本底測試時以0.3 mL蒸餾水取代鄰苯三酚，其余步驟相同。同時以BHT作為陽性對照。按照以下公式計算其超氧陰離子自由基清除率：

超氧陰離子自由基清除率=[A0-(A1-A2)]/

A0×100%

式中：A0為空白對照吸光度；A1為樣品或陽性對照的吸光度；A2為本底吸光度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制及回歸方程的建立

從圖1可知，其吸光度在510 nm處與蘆丁濃度相關，其相關系數R2=0.999。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶添加量對沙棘黃酮提取率的影響

由圖2可知，總黃酮提取量隨著果膠酶添加量的提高不斷增加。當果膠酶添加量達到5%時，黃酮提取量達到最高；繼續增加酶添加量，黃酮提取量反而下降；這主要是因為果膠酶添加量少時，酶解不完全，果膠酶添加量為5%時，酶解濃度達到最大飽和，繼續添加果膠酶為6%時，底物濃度不能對酶達到飽和；因此最佳果膠酶添加量為5%。

圖2 果膠酶添加量對沙棘果渣黃酮含量的影響Fig.2 Effect of pectinase concentration on yield of total flavonoids

2.2.2 液料比對沙棘黃酮提取率的影響

由圖3可知，不論超聲輔助提取、酶法輔助提取還是超聲酶法雙輔助提取，液料比均在40∶1時，黃酮提取量最佳；這主要因為液料比低時，溶出一部分黃酮就達到了飽和，不能使黃酮全部溶出，液料比為50∶1和60∶1時，溶出的黃酮類物質被稀釋，使得提取率下降。

圖3 液料比對沙棘果渣黃酮含量的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of total flavonoids

2.2.3 乙醇濃度對沙棘黃酮提取率的影響

由圖4可知，不論超聲輔助提取、酶法輔助提取還是超聲酶法雙輔助提取，乙醇濃度為40%時，黃酮提取量達到最大值，乙醇濃度為30%或高于40%時黃酮提取量均降低；這主要是因為黃酮與提取液乙醇的極性越相似，黃酮溶出就越多，當乙醇濃度40%時，與黃酮極性最相似。

圖4 乙醇濃度對沙棘果渣黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ethanol percentage on yield of total flavonoids

2.2.4 超聲提取時間對沙棘黃酮提取率的影響

由圖5可知，超聲提取時間為80 min時，黃酮提取量最佳，超聲提取時間低于80 min或高于80 min時，黃酮提取量均下降；這主要是因為超聲提取時間太短時，黃酮只能溶出一部分，不能完全溶解于乙醇溶液中，超聲提取時間太長，容易使黃酮與溶液中其他物質發生反應，使得黃酮提取率降低。

圖5 超聲提取時間對沙棘黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on yield of total flavonoids

2.2.5 提取溫度對沙棘黃酮提取率的影響

由圖6可知，在50 ℃時黃酮提取量最佳，這主要是因為溫度太低時，黃酮不能完全溶出；而溫度超過50 ℃時，容易使黃酮結構發生破壞，提取量降低。因此最佳提取溫度為50 ℃。

圖6 提取溫度對沙棘黃酮含量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic extraction temperature on yield of total flavonoids

2.2.6 超聲功率對沙棘黃酮提取率的影響

由圖7可知，超聲功率為80%時(總功率500 W)，黃酮提取量達到最大值，這主要因為隨著超聲功率的增大，超聲的空化作用使沙棘果渣分子發生振蕩，加速黃酮的溶出；而超聲功率太大時，使一些雜質溶出增多，阻礙了黃酮的溶出，提取量下降。

圖7 超聲功率對沙棘黃酮含量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on yield of total flavonoids

2.3 響應面優化試驗結果分析

2.3.1 響應面試驗設計及結果

采用Design Expert 8.06軟件，對沙棘果渣總黃酮的提取進行Box-Behnken設計，響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design Expert 8.06統計軟件，對表2中的試驗數據進行多元回歸分析，獲得黃酮提取量對果膠酶添加量(A)、液料比(B)、超聲提取時間(C)的二次多元回歸模型為：

黃酮提取量=8.45+0.30A+0.085B+0.29C-0.31AB+0.59AC+0.22BC-1.40A2-0.69B2-1.74C2。

對該二次多元回歸模型進行方差分析，結果如表3。

表3 響應面試驗方差分析表

由表3可知，F回歸值=17.49>F0.05=6.94，P<0.05，說明該回歸模型顯著，即各因素果膠酶添加量、液料比、提取時間與黃酮提取量之間的線性關系顯著，實驗模型是可靠的，能夠用來分析和預測沙棘總黃酮的提取率；F失擬值=3.070.05，表明失擬不顯著，說明該實驗有良好的穩定性，實驗誤差較小，該模型對試驗擬合較好[20]。由P值可知，二次型A2、B2和C2均對測定黃酮提取量的實驗結果顯著；交互項AB和BC顯著，而AC不顯著；由單因素F值可知單因素對黃酮提取量的影響順序依次為：A>C>B，即果膠酶添加量>超聲提取時間>液料比。

2.3.3 兩因素間的交互影響

果膠酶添加量與液料比、果膠酶添加量與超聲提取時間、液料比與超聲提取時間之間交互作用的三維空間響應面圖，如圖8。

圖8 兩因素相互作用對沙棘果渣黃酮提取量影響的響應面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the extraction yield of total flavonoids

由圖8可知，果膠酶添加量、超聲提取時間相對于液料比的曲線較陡峭，說明果膠酶添加量、超聲提取時間對黃酮提取量的影響比液料比顯著，而果膠酶添加量與超聲提取時間的曲線都比較陡峭，說明果膠酶添加量與提取時間的相互作用不明顯。等高線圖為響應面圖在底面的投影，其形狀反應兩交互作用的顯著性。果膠酶添加量與液料比、液料比與超聲提取時間等高線圖的形狀是橢圓形，說明果膠酶添加量與液料比、液料比與超聲提取時間之間交互作用顯著，而果膠酶添加量與超聲提取時間等高線圖的形狀是圓形，說明果膠酶添加量與液料比交互作用不顯著[21]。

2.3.4 響應面優化的驗證

擬合曲面有最大值，對回歸方程求偏導進行分析，得到其沙棘果渣黃酮提取量理論最佳值為8.99 mg/g，其所對應的最佳提取條件為：果膠酶添加量5.12%，液料比40.51∶1，超聲提取時間為81.07 min。考慮到實驗操作的可行性，將最佳條件調整為：果膠酶添加量5.1%，液料比41∶1，超聲提取時間為81 min，在此條件下進行三次重復試驗，測得沙棘果渣黃酮提取量為8.78、8.89、9.05 mg/g，平均值為8.91 mg/g，與理論值相差0.08 mg/g，說明該模型優化所得的提取工藝參數是可靠的。

2.4 抗氧化活性試驗

2.4.1 DPPH自由基清除能力

圖9 沙棘果渣總黃酮對DPPH自由基的清除能力Fig.9 DPPH free radical scavenging capacity of flavonoids from sea buckthorn pomace

由圖9可知，沙棘果渣總黃酮提取液和BHT都有清除DPPH自由基的作用，對沙棘果渣來說，總黃酮提取液濃度在0.02 mg/mL至0.08 mg/mL時，清除DPPH自由基的能力增長很快，清除率由28.89%迅速增長至83.17%，隨后總黃酮提取液濃度增加，但清除能力增長緩慢，總黃酮提取液濃度由0.12 mg/mL增長至0.14 mg/mL時，清除率僅增加1%，達到94.42%。整體來看，沙棘果渣總黃酮對DPPH自由基的清除能力要大于BHT。

2.4.2 羥自由基清除能力

圖10 沙棘果渣總黃酮對羥自由基的清除能力Fig.10 Hydroxyl free radical scavenging capacity of flavonoids from sea buckthorn pomace

由圖10可知，沙棘果渣總黃酮提取液和BHT都有清除羥自由基的作用，沙棘果渣總黃酮提取液對羥自由基的清除率呈現一條增長曲線，當提取液濃度由0.2 mg/mL增長至1.2 mg/mL時，清除率由42.34%增加至83.10%。和BHT相比，總黃酮提取液在低濃度時對羥自由基的清除率明顯低于BHT；但在高濃度時對羥自由基的清除率又高于BHT。

2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力

圖11 沙棘果渣總黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.11 Superoxide anion free radical scavenging capacity of flavonoids from sea buckthorn pomace

由圖11可知，沙棘果渣總黃酮提取液和BHT都有清除超氧陰離子自由基的作用。當總黃酮提取液質量濃度小于0.4 mg/mL時清除能力大于BHT；當提取液濃度為0.4 mg/mL時，總黃酮提取液和BHT清除能力相差不大，均為20%左右；當總黃酮提取液濃度大于0.4 mg/mL時，清除能力明顯低于BHT。整體來看，沙棘果渣總黃酮提取液隨濃度的增加而增加，但清除效果不顯著，僅在提取液濃度達到1.2 mg/mL時，清除率達到43.41%。

3 結論

本研究對沙棘果渣總黃酮的提取工藝進行優化，并對其抗性氧化活性進行研究。通過響應面優化試驗，建立了果膠酶添加量、液料比和超聲提取時間三因素三水平的回歸模型擬合方程，根據模型，對果膠酶添加量、液料比和超聲提取時間對沙棘果渣黃酮提取量影響的交互作用進行探討，得出沙棘果渣總黃酮最佳提取工藝條件為：果膠酶添加量5.1%，液料比41∶1，超聲提取時間為81 min，在此條件下，沙棘果渣總黃酮提取量達到8.91 mg/g，高于前人報道的沙棘果皮渣中黃酮含量[22]，并且縮短了提取時間[23]。提取液DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力的試驗，證實其比BHT有更高的抗氧化活性，可以作為抗氧化劑，為沙棘黃酮在抗氧化方面的應用提供了一定的依據。