螺旋藻多糖對子宮內膜異位大鼠血清指標及PI3K/Akt/mTOR信號通路基因表達的影響

王 猛，馬浩天，關思宇，于 杰，狄建兵，王 愈，李潤植*，崔紅利*

1山西農業大學農學院分子農業與生物能源研究所；2山西農業大學食品科學與工程學院，太谷 030801

近年來，子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)發病率明顯增加。EMs指具有活性的子宮內膜組織出現在子宮腔被覆黏膜以外的部位[1]。EMs好發于育齡期婦女，可能與雌激素的過多分泌相關，其雖為良性病變，但呈局部浸潤生長、好侵襲，婦科癥狀明顯，治療后容易多次復發，給女性身心健康帶來極大危害。然而治療EMs的方法卻十分有限，除了外科手術之外，常用的內科治療多為長時間使用孕激素類藥物。隨著治療時間的延長，患者可出現各種副作用，如骨量流失、免疫系統失控和內分泌紊亂等[2]。因此，尋找一種新的無副作用的EMs治療藥物是迫在眉睫的。

天然產物具有豐富的生物學活性以及可作用于不同的生物靶點的優勢，因而其開發利用領域取得了極大的進步。來源于黃花蒿的青蒿素是目前全世界治療瘧疾作為有效的手段，并已被用作免疫調節、抗炎和部分癌癥藥物等先導化學物[3]。紅豆杉提取物也被用于治療乳腺癌和卵巢癌，目前已成為化學抗腫瘤藥物的研究重點[4]。在眾多天然產物治療疾病的研究中，我們發現來源于陸生植物及水生植物的其他提取物如兒茶素、白藜蘆醇、蝦青素等海藻提取物，都表現出多種治療效果，如抗炎、抗菌抗腫瘤等[5]。因此，尋找有利于治療子宮內膜異位癥的天然大分子化合物，為藥學庫提供新的理論基礎及藥物資源的思路變得可行。Tang等[6]發現紫草提取物可以有效治療EMs,并且顯著影響異位內膜組織的炎性因子和凋亡基因活性；Zhang等[7]發現蠲痛飲可以有效緩解大鼠EMs癥狀；Liu等[8]發現藏紅花素可通過抑制細胞增殖和炎性因子來改善EMs。

螺旋藻是開發較早的微藻產品，具有很高的市場知名度。螺旋藻多糖(polysaccharide fromSpirulina，PSP)是一類來源于原核生物螺旋藻,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等多重功效的天然生物大分子[13]。近年來，PSP因其不同于抗腫瘤活性常用藥物的特點而被廣泛研究。而目前已經有較多研究發現PSP可以通過作用于某些腫瘤信號通路上的分子達到調控下游基因表達的作用，Xu等[9]發現復合PSP抑制人類乳腺癌細胞的增殖。Yu等[10]研究PSP對宮頸癌細胞的影響發現，PSP可通過周期性阻滯而抑制Hela細胞的增殖。Sheng等[11]通過體外、體內實驗證明，硫酸酯化的PSP對小鼠S180肉瘤有顯著抑制作用。Chen等[12]研究表明，PSP通過提高免疫細胞活性來增強機體抗H22細胞能力。此外，大量的體外研究表明，PSP不僅可直接作用于某些腫瘤細胞，還可預防腫瘤患者在化療和放療時對細胞的損傷。因此我們推測PSP可以介導部分通路來緩解EMs的產生及增殖，但還未有任何天然多糖治療EMs的研究報告，因此本課題擬基于PI3K/Akt/mTOR信號通路，探究PSP對子宮內膜異位癥大鼠的治療作用，為開發新型的EMs治療方案和后續治療藥物提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

螺旋藻藻粉購買自福清市新大澤螺旋藻有限公司，并由本實驗室保管，腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor-α，TNF-α)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)試劑盒(南京建成)；基質金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP-2)試劑盒購自武漢華美。Trizol試劑(上海生工)；PrimeScript RT試劑盒(Takara);1 TAE電泳buffer(Tris 4.84 g，Na2EDTA·2H2O 0.744 g，CH3COOH 1.142 mL，pH 8.5)、BCA蛋白試劑盒(南京建成)；anti-PI3K、AKt、mTOR rabbit(Abcam)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PSP的制備及純度鑒定

PSP的制備參照我們實驗室已經發表的研究進行[13]。提取PSP后，使用Sephacryl S-100 HR為固定相裝填中壓特制玻璃層析柱(1.5 cm×60 cm)進行純化。過柱時流動相為超純水，以0.5 mL/min的流速洗脫。在過濾器濃縮后獲得純化的PSP。隨后進行純度、分子量的檢測。使用苯酚-硫酸法檢測PSP的總糖。按照Chen等[14,15]描述的方法，使用高效液相凝膠滲透色譜法(HPGPC)檢測PSP的分子量。

1.2.2 大鼠EMs模型的制備

清潔級SD大鼠(無生育史)24只購自山西醫科大學實驗動物中心，8周齡，體重160±15 g。實驗大鼠于標準條件下飼養在山西農業大學分子農業與生物能源研究所動物房的隔離籠中，適應性培養兩周后開始實驗。

采用自體異位種植術[16]構建大鼠模型。簡要步驟如下：術前一天各組大鼠灌胃戊酸雌二醇，禁食不禁水6 h。種植術在超凈工作臺中進行，大鼠腹腔注射水合氯醛(5%，0.6 g/kg)麻醉，以鑷子刺激足部無反射為麻醉成功標準。腹部剃毛，75%酒精消毒備皮，待干。恥骨水平中線開口，沿腹中線縱向剪開皮膚，鈍性鑷子分離皮膚與腹膜壁；沿腹中線切開3～4 cm(上至劍突)，逐層分離肌肉，打開腹腔。進入腹腔后，檢查腹腔整體情況，找到子宮及卵巢。分別于近卵巢端、近子宮末端使用0.6不可吸收縫線結扎，切除中段子宮，立刻置于無菌生理鹽水中，眼科鑷子保定，縱向切開，將子宮內膜剝離并切成面積約0.3 cm×0.3 cm的方塊，分別于腹壁處、卵巢處進行對角線縫合。縫合完畢后，檢查有無出血情況，使用慶大霉素注射液進行沖洗，連續縫合關腹，術畢，待蘇醒。術后兩天青霉素皮下注射，防止感染。

造模4周后，開腹檢查，如若發現移植處囊狀增大，新生血管形成且與周邊組織粘連，即造模成功。

1.2.3 PSP治療大鼠EMs的實驗設計

本實驗共設四組處理，分別為空白對照組、模型組及兩個梯度的多糖治療組(50 mg/kg PSP和100 mg/kg PSP)，多糖組濃度的確定依據參考文獻[13]。空白對照組(control group，CK)、模型組(model group，M)的大鼠灌胃等劑量生理鹽水。兩個治療組(50 mg/kg PSP和100 mg/kg PSP)大鼠首先灌胃等劑量的生理鹽水(50 mg/kg)，并于灌胃生理鹽水1 h后分別灌胃50 mg/kg 和100 mg/kg的PSP溶液(實驗處理設置見表1)。灌胃操作于每天下午1∶00進行，每天一次，持續四周后將所有大鼠腹主動脈采血，并使其失血性休克死亡，使用游標尺測定病灶大小并采集樣本。

表1 基于EMs治療實驗的處理分組表(n=6)

1.2.4 EMs大鼠PI3K、Akt、mTOR基因轉錄及蛋白表達分析

開腹采集樣本，使用Trizol試劑盒提取大鼠子宮內膜異位組織total RNA，經瓊脂糖凝膠電泳(觀察是否出現28、18、5 s三條帶)、核酸儀檢測OD260/OD230與OD260/OD280比值質檢合格后，按照Takara PrimeScript RT試劑盒說明書步驟進行反轉錄實驗，合成cDNA后置于-20 ℃保存。

qPCR引物設計：在NCBI數據庫中，根據PI3K、Akt、mTOR基因轉錄本序列開放式閱讀框(ORF)設計PCR擴增引物；在NCBI數據庫中，根據大鼠管家基因β-actin設計內參引物β-actin-F和β-actin-R，引物序列見下表。

反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；退火30 s；72 ℃延伸40 s，循環數25。PCR結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。使用SYBR Premix Ex Taq II(Takara)在CFX 96實時PCR檢測系統進行qPCR，使用2-△△Ct法分析數據。

按照蛋白提取試劑盒說明書提取子宮內膜異位組織樣本中的總蛋白后，測定蛋白含量。取20 μg待測樣品與上樣緩沖液混勻后，進行蛋白凝膠電泳(SDS-page)實驗，電泳后轉模，分別加入PI3K、Akt、mTOR抗體孵育，選擇合適的二抗，ECL發光液發光后顯影，以β-actin作為內參。

表2 PCR引物的核酸序列

續表2(Continued Tab.2)

設計RT-PCR反應體系如下：

表3 RT-PCR反應體系

1.3 統計學方法

2 結果與分析

2.1 PSP的純度及化學組成

如表4所示，PSP的得率約為1.95%，總糖、總蛋白質和灰分的含量分別為89.72%、5.07%和2.11%，PSP的相對分子量為29.6 kDa。

表4 螺旋藻多糖組分及分子量

2.2 各組處理大鼠的一般觀察

造模期間每日觀察大鼠表型，如毛色、精神狀態、攝食情況、活動能力等。術后48 h每日皮下注射青霉素，因而各組大鼠體溫正常，未見感染；相比于空白組，前一周手術組大鼠活動能力減弱，一周后活動能力恢復；手術組大鼠均發生了咬線情況，對縫合處使用75%酒精消毒，未再進行縫合。各組大鼠攝食差異較大，灌胃組攝食量較少，可能與灌胃溶液較多有關；術后PSP-H組一只大鼠因體溫過低死亡，灌胃過程中PSP-L組因藥液誤入氣管嗆死2只，模型組(M)意外死亡一只，其余生存良好。本次造模成功率達到83.3%。實驗四周后測定各組大鼠體重，未發現明顯差異(圖1)。

圖1 PSP對大鼠體重的影響Fig.1 The effect of PSP on body weight in rats

2.3 PSP對大鼠異位子宮內膜生長的影響

通過使用游標卡尺對組織塊的高度、表面積進行測量(圖2)，結果發現相較于模型組，不同劑量的PSP灌胃治療均顯著使異位子宮內膜組織高度降低、表面積減少，這表明PSP可有效減小異位子宮的病灶，例如高劑量多糖可以使病灶高度降低約42%，表面積減少52.8%，差異顯著(P<0.05)。

圖2 PSP對EMs病灶生長情況的影響Fig.2 The effect of PSP on the growth of EMs注：與模型組相比，*P < 0.05；**P < 0.01。Note:Compared with model,*P < 0.05;**P < 0.01.

2.4 PSP對大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2含量的影響

與空白對照組相比，模型組EMs可顯著增加大鼠血清中TNF-α的水平，TNF-α增加了近27%，差異顯著(P<0.05)；而使用多糖干預后，大鼠血清TNF-α的含量有所下降，低、高劑量多糖分別使TNF-α減少了約19%和17.6%，效果呈現劑量依賴性；與TNF-α的趨勢相似，EMs均顯著增加了血清VEGF和MMP-2的水平，而PSP可顯著降低以上兩種細胞因子的含量，治療效果呈現劑量依賴性(圖3)。

圖3 PSP對大鼠TNF-α、VEGF和MMP2含量的影響Fig.3 Effects of PSP on the content of TNF-α,VEGF and MMP2 in rats注：與對照組相比，*P < 0.05；**P < 0.01。Note:Compared with control,*P < 0.05;**P < 0.01.

2.5 PSP對大鼠PI3K、 Akt、mTOR基因轉錄及蛋白表達的影響

qPCR分析(圖4)表明，與模型組相比，對照組、PSP-L和PSP-H組中PI3K的表達下調，且具有顯著性差異(P<0.05)。在所有治療組中均檢測PI3K、Akt和mTOR的相似表達模式，即模型組中這些基因的表達上調，而空白對照及治療組中的表達下調，并且這些結果均具有顯著性差異，由此可見EMs可顯著提高PI3K/Akt/mTOR的表達，而PSP均可以顯著抑制該信號通路上關鍵分子的表達。

蛋白免疫印跡分析圖4表明，所有實驗組均出現條帶，且不同濃度多糖處理后，PI3K、Akt和mTOR蛋白相對表達差異具有統計學意義。與對照組相比，模型組中PI3K、Akt和mTOR蛋白表達相對較高，而治療組中PSP可抑制蛋白的表達，特別是高劑量的PSP作用效果更加顯著。

3 討論與結論

EMs的發病率逐年增高，但是其治療方法卻十分有限，往往會采用長時間的內科藥物干預，這樣不僅影響病人的治療信心，同時也導致極大的副作用。此外，開發新型有效的EMs治療藥物是迫在眉睫的，隨著功能食品產業的發展，具有藥理學功能的新型天然產物引起了人們廣泛的重視。PSP是一類具有多重功效的天然生物大分子，目前已經有較多研究發現PSP可以通過作用于某些腫瘤信號通路上的分子達到調控下游基因表達的作用，而EMs的形成及發展與大多數腫瘤細胞的信號通路相似，因此我們推測PSP可以介導部分通路來緩解EMs的產生及增殖。

圖4 qPCR分析PI3K/Akt/mTOR基因轉錄水平及蛋白免疫印跡分析Fig.4 The qPCR analysis of PI3K/Akt/mTOR gene transcription level and Western blot analysis注：與模型組相比，*P < 0.05；**P < 0.01。Note:Compared with model,*P < 0.05;**P < 0.01.

本研究首先對PSP進行了提取和純化，本次多糖的提取率可以達到1.95%，經柱層析法測定后純度較高(89%)，可以用作活性鑒定實驗；我們采用SD大鼠進行EMs造模，因大鼠器官組織較大，便于剝離、種植等操作。EMs造模可以分為自體移植和異體移植等，在此我們為了避免產生免疫排斥，選擇自體移植術進行造模，造模成功率可以達到80%以上。PSP干預后，對大鼠進行了長期動態的觀察，發現大鼠的體重并無顯著變化，這意味PSP對正常大鼠及EMs大鼠的生長不存在負面影響。通過對腹腔移植物的高度、面積進行測量，發現PSP的干預顯著減緩了EMs的發展，即PSP或許可以用于EMs治療。

我們猜測PSP可能是通過調控與EMs形成發展相關的細胞因子而產生治療效果。由細胞因子所調控的細胞黏附、血管生成等是EMs發展的重要環節，例如MMP-2可調節細胞之間、細胞與基質之間的信息交流，也有研究證明MMP2可以增強細胞的黏附作用，進而使得子宮內膜細胞更容易在異位定植，本研究中EMs大鼠的MMP2水平較高，這與Yuan等[17]的發現一致；而PSP可以降低MMP2的活性，這意味著MMP2可能是PSP的作用靶點。在細胞增殖、侵襲的過程中，TNF-α扮演了重要的角色，TNF-α具有促進細胞增殖和分化、影響血管功能等眾多特點[18]。本研究中，PSP可顯著降低EMs大鼠血清中的TNF-α水平，并且進一步降低了TNF-α下游調控的VEGF的合成，進而抑制了EMs細胞的增殖及病變組織的血管形成，血管形成是EMs局部病灶易于轉移和免疫逃逸的重要原因。VEGF的水平還受PI3K/Akt通路調控[19]。PI3K/ Akt/ mTOR通路整合一系列的細胞外信號，調節各種細胞功能。該通路通過整合黏附素/細胞間黏附因子-1介導子宮內膜細胞黏附作用(此為子宮內膜異位的必要病理生理學條件)[20]；間接調控金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)來介導子宮內膜細胞的侵襲、轉移；調控VEGF形成新生血管，此為形成EMs的重要步驟[21]；此外，PI3K/Akt/mTOR信號通路還可調控細胞凋亡及雌激素分泌，二者也是EMs形成和發展不可缺少的因素。我們發現PI3K/Akt/mTOR在模型組小鼠中均顯著表達增強，該通路的激活意味著細胞的生長、增殖以及血管形成，這無疑加劇了EMs的發展。本研究中我們發現PSP可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，這可能是TNF-α、VEGF等細胞因子合成減少的重要原因。然而迄今為止還很少有論文報道PSP對該通路的調控作用，PSP通過何種途徑實現對PI3K/Akt的調控？這將是我們下一步的研究重點。

本研究在PSP制備及純化的基礎上，完成了對PSP的成分，并基于自體異位種植術制備了符合要求的大鼠EMs模型，基于模型探究了PSP對大鼠子宮內膜異位癥的改善作用，具體表現為可有效降低血清TNF-α、VEGF、MMP-2等細胞因子的含量，達到抑制EMs發展的作用；進一步基于PI3K/Akt/mTOR信號通路探究PSP對大鼠子宮內膜異位癥的治療機制，結果表明：與模型組相比，治療組大鼠異位子宮內膜組織PI3K、AKT、mTOR的基因表達量明顯下降，蛋白表達檢測證實PSP可抑制AKT的磷酸化進而抑制PI3K、mTOR蛋白表達，這表明PSP可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路改善大鼠EMs癥狀。本文為發現PSP的新型藥理功能及闡述相關機理提供了參考，為下一步研究開發提供了科學基礎。