桂皮醛對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的保護作用研究

吳柯楠，梁艷妮，張東博，任浪浪，李璐含，于金高，張 珍，唐志書，王 征

陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心 省部共建秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室(培育) 陜西省創新藥物研究中心，咸陽 712083

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種發展緩慢、非特異性炎癥性腸病，主要臨床癥狀為腹痛、腹瀉、黏液血便等，或伴有體重減輕、里急后重感、嘔吐等癥狀[1]。主要是侵及結腸黏膜，破壞黏膜形成潰瘍，常始自左半結腸，可由結腸近端發展至全結腸。UC的病因與發病機制目前尚未明確，隨著近年來各學科的發展以及各學科間相互滲透，人們對UC的認識也在不斷深入。研究表明UC的發生與患者腸道炎性因子的失衡和免疫反應的異常密切相關，炎癥信號的激活導致促炎細胞因子和抗炎細胞因子分泌失衡，活性氧過度積累，進一步加速炎癥的發展。而核轉錄因子(NF-κB)和信號傳導及轉錄激活因子3(STAT3)在介導這一異常的免疫反應中起著重要作用，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[2]、白細胞介素-6(IL-6)[3]、白細胞介素-8(IL-8)等多種促炎因子的過量分泌以及抗炎因子白細胞介素-4(IL-4)[4]、白細胞介素-10(IL-10)[5,6]等的釋放減少導致UC患者腸道發生炎癥反應，因此臨床治療UC可以從抑制促炎因子的釋放和促進抗炎因子的分泌來實現。

桂皮醛(cinnamaldehyde，CA)又名肉桂醛、苯丙烯醛、桂醛，是從肉桂樹中提取的烯醛類有機化合物，是其揮發油中主要成分[7]。國內外對CA的大量藥理研究表明，其具有抗炎[8,9]、抗潰瘍、解熱鎮痛[10]、抗腫瘤[11]、抗菌、降糖、抗肥胖、降血壓、抗抑郁[12]等多種藥理活性。課題組前期對馬齒莧-肉桂治療UC的作用進行研究發現，兩者聯用可以顯著改善UC小鼠的健康活動狀況，且與腸道微生態平衡的改善密切相關[13]。據報道，CA可以抑制巨噬細胞中促炎癥因子的表達，包括TNF-α、IL-1β和一氧化氮(NO)[14]。也有文獻研究CA可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活以及結腸和巨噬細胞中的miR-21和miR-155水平改善DSS誘導的結腸炎[15]，故本課題組對CA治療UC的作用進行研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TS100-F熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；低溫冷凍離心機(美國Thermo公司)；低溫保存箱(-80 ℃，美國Thermo公司)；TGL-20B低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；CPA225D電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；BIO-RAD電泳槽(042BR16330，美國)；GEL DocXR+伯樂凝膠成像系統(721BR11053，美國)；Thermo熱點Multiskan FC 酶標儀(美國Thermo公司)；微量冷凍離心機Micro 17R(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試劑

桂皮醛(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq19031207，純度：≥98%)；葡聚糖硫酸鈉(DSS，MP Biomedicals生物醫學公司，批號：160110)；柳氮磺胺吡啶片(上海信誼嘉華藥業，批號：09170611)；無菌PBS(博士德生物有限公司，批號：0030319)；小鼠 IL-4(批號：M191028-003b)、IL-6(批號：M190322-004a)、IL-8(批號：M190322-104a)、IL-10(批號：M190322-003a)、TNF-α(批號：R200107-102a)ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；NF-κB/P65(#8242S)、IκBα(#4812S)、STAT3(#12460S)和p-STAT3(#9145S)兔抗鼠單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(博士德生物有限公司)；marker蛋白(Thermo Scientifi)；RIPA裂解液(博士德生物有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(博士德生物有限公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(博士德生物有限公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)；化學發光HRP底物ECL發光液(默克密理博)。

1.3 動物

SPF級雄性昆明種小鼠60只，4～6周齡，體重20±2 g，購于西安交通大學醫學部實驗動物中心，實驗動物質量合格證許可證號：SCXK(陜)2017-003。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.1 實驗分組及給藥方法

昆明種雄性小鼠60只，隨機分6組，(每組小鼠體重進行方差分析，P>0.05)適應性飼養一周。分為空白組、UC模型組、柳氮磺胺吡啶組[16]、CA低、中、高劑量組(150、250、500 mg/kg)。空白組小鼠飲用純凈水，其他小鼠自飲3%DSS 9天誘導UC模型[17]，自第10天起空白組及模型組小鼠灌胃蒸餾水，其余組灌胃相應劑量的藥物，灌胃體積均為10 mL/kg；連續灌胃7天，最后一天禁食不禁水16 h后，摘眼球取血，小鼠處死后，剪取結腸組織，4%多聚甲醛固定。造模第一天起記錄小鼠的體重，大便質地，潛血或便血特征[13,18,19]，根據表1進行疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分。

DAI=(體重下降評分+大便性狀評分+

大便隱血情況評分)/3

2.1.2 石蠟包埋和H&E染色

將保存在4%多聚甲醛的結腸組織取出后在流水中沖洗1 h，后置入濃度梯度乙醇中脫水1 h，再用二甲苯透明，然后將透明后的標本放置在65 ℃熔解狀態的石蠟中1 h，浸透取出放置于包埋模具內包埋成蠟塊，并放于病理冷凍臺待其冷卻固定于切片機切成4 μm切片，4 ℃冷藏備用。

表1 DAI評分表

病理HE染色，將切片用二甲苯脫蠟，再移入蘇木精染色5 min，然后用流水洗去蘇木素染液終止染色，待其干后放入1%鹽酸乙醇溶液分化，然后放入伊紅液染色2 min并快速水洗以終止染色，最后將切片放入梯度酒精中脫水5 min后，放入二甲苯透明處理，滴加中性樹膠并蓋玻片封片固定。在微鏡下觀察比較各組大鼠HE染色結腸組織損傷的病理變化，并給予評分[20,21]比較(HAI=上皮組織破壞分數+炎性浸潤分數)(見表2)。

表2 大鼠結腸組織HAI病理變化評分標準

2.1.3 IL-6、IL-8、IL-4、IL-10、TNF-α含量測定

對各組小鼠進行采取血液樣本1.5 mL，4 ℃下以3 000 rpm離心10 min，收集上層血清。按照小鼠ELISA試劑盒說明書測定小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的含量。

2.1.4 Western blot法檢測結腸組織中NF-κB/P65、STAT3蛋白表達

在病變明顯處取結腸組織放入1.5 mL的EP管中，加裂解液勻漿，離心后吸取上清，4 ℃保存備用；配制BSA濃度梯度標準液及BCA工作液，進行蛋白質定量分析；將提取的蛋白電泳(90 V，30 min后轉120 V)、轉膜(100 V，90 min)后，封閉2 h，孵育一抗(4 ℃，過夜)，辣根過氧化物酶標記的二抗與一抗結合(37 ℃，1 h)；將PVDF膜平鋪于保鮮膜上，加入ECL發光液避光反應2 min，采用BIO-RAD凝膠成像系統對PVDF膜進行曝光。

2.2 統計學方法

3 結果

3.1 DAI評分結果

根據表1小鼠DAI評分表，得出圖1評分結果，小鼠以3% DSS飲水9天后各實驗組DAI評分均升高，表明小鼠造模成功，第10天灌胃治療開始，給藥組小鼠DAI評分均逐漸下降，且隨給藥濃度的增大，小鼠DAI評分下降趨勢更明顯，表明CA對UC有療效。

圖1 小鼠的DAI評分Fig.1 DAI of mice注：CON：對照組；COLITIS：模型組；POSITIVE CON：柳氮磺胺吡啶組；CA-L：CA低劑量組(150 mg/kg)；CA-M：CA中劑量組(250 mg/kg)；CA-H：CA高劑量組(500 mg/kg)；下同。Note:CON:Control group;COLITIS:Model group;POSITIVE CON:Sulfasalazine group;CA-L:CA low-dose group (150 mg/kg);CA-M:CA middle-dose group (250 mg/kg);CA-H:CA high-dose group (500 mg/kg);the same below.

3.2 炎癥因子的變化

由圖2可知，模型組血清中抑炎因子IL-4、IL-10的含量較空白組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α含量較空白組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。給藥后，CA低、中、高劑量組IL-4、IL-10的含量較模型組均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，且高于陽性對照組；CA低、高劑量組IL-6、IL-8及TNF-α含量較模型組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，且高于陽性對照組；CA中劑量組IL-6、IL-8及TNF-α含量較模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，較柳氮磺胺吡啶組差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明CA能顯著改變UC小鼠炎癥因子的含量。

圖2 炎癥因子的含量變化Fig.2 Changes in the levels of inflammatory cytokines注：與UC模型組比較，**P <0.01，*P <0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。Note:Compared with the model group, **P <0.01,*P <0.05.Compared with the control group,##P<0.01,#P<0.05.

3.3 結腸組織觀察

最后一次給藥后，所有小鼠禁食24 h乙醚麻醉，處死小鼠，從肛門以上5 cm處取出小鼠結腸段約1 cm，發現空白對照組小鼠結腸顏色為淡紅色，腸管有部分成形糞便。DSS模型組小鼠結腸腸壁充血腫脹，嚴重者結腸段為血性腸內容物。給藥組小鼠腸管可見基本成型糞便，低劑量組腸壁有輕微充血。空白組鏡下可見結腸組織完整，包括腸黏膜層、肌層，有明顯的隱窩、杯狀細胞，腺體排列整齊，無炎癥細胞浸潤(圖3A)；模型組鏡下可見腸黏膜組織細胞(黑色箭頭)、腺體遭受不同程度破壞(黃色箭頭)，隱窩和杯狀細胞明顯減少(白色箭頭)，有大量炎癥因子(紅圈)，主要集中在黏膜層及黏膜下層(圖3B)，HAI評分明顯高于空白組，表明UC模型誘導成功(圖3G)；陽性對照組柳氮磺胺吡啶治療后，結腸結構相對完整，有大量杯狀細胞和隱窩出現，但黏膜層仍有少量炎癥細胞(圖3C)，HAI評分顯著降低，表明磺胺吡啶300 mg/kg可改善DSS誘導的結腸炎癥狀，但炎癥細胞浸潤對結腸組織的損傷并沒有完全消除；用濃度為150、250、500 mg/kg的CA溶液治療，可見結腸組織結構完整，隱窩排布規范，杯狀細胞清晰可見，但仍有少量炎癥細胞浸潤，粘膜結構有不同程度修復(圖3D、3E、3F)。HAI 評分較模型組顯著降低，高濃度組比陽性藥的療效更好(圖3G)，表明CA可修復UC結腸組織，但是不能完全消除炎癥因子對結腸組織的損傷(P<0.01)。

圖3 小鼠結腸組織HE染色圖(×400，橫切)及結腸組織病理切片HAI評分Fig.3 HE staining of mouse colon tissue(×400,crosscutting) and HAI in pathological sections of the colon注：A：對照組；B：模型組；C：柳氮磺胺吡啶組；D：CA低劑量組；E：CA中劑量組；F：CA高劑量組；G：HAI評分；黑色箭頭：腸黏膜組織；黃色箭頭：腺體破壞；白色箭頭：隱窩及杯狀細胞；紅圈：炎癥因子；與UC模型組比較，**P <0.01，*P <0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。Note:A:Control group;B:Model group;C:Sulfasalazine group;D:CA-L;E:CA-M;F:CA-H;G:HAI score;Black arrow:Intestinal mucosal tissue;Yellow arrow:Gland destruction;White arrow:Crypt and goblet cells;Red circle:Inflammatory factor;Compared with the model group, **P <0.01,*P <0.05;Compared with the control group,##P<0.01,#P<0.05.

3.4 結腸組織中NF-κB/P65、STAT3蛋白表達情況

從“3.1”、“3.2”、“3.3”的實驗結果來看，藥物改善不呈劑量依賴性，所以我們從藥物的三個劑量對潰瘍性結腸炎的效果綜合分析，選擇中劑量作為檢測結腸組織中NF-κB/P65、STAT3蛋白表達的實驗劑量。

在炎癥反應中，NF-κB的活化是一個中心環節，靜息狀態下，NF-κB(p50/p65)與其抑制性蛋白IκB(IκBα)結合形成三聚體穩定存在于胞質中，抑制NF-κB向細胞核內轉移。一旦胞外信號傳遞進胞內，IκB在其激酶IKK和ELKs的作用下被磷酸化或泛素化降解，NF-κB以活化的形式進入細胞核內與靶基因結合。

由圖4可知，與空白組相比，模型組NF-κB和IκBα在細胞質中的蛋白表達明顯降低，表明NF-κB被激活進入細胞核；與模型組相比，陽性對照組和CA組NF-κB和IκBα在細胞質中的蛋白水平顯著升高，另外，CA組的蛋白表達水平高于陽性對照組。總之，這些結果表明CA是通過抑制IκBα的降解從而抑制NF-κB進入細胞核來改善潰瘍性結腸炎。

圖4 小鼠結腸組織中NF-κB/p65和IκBα(細胞質)的蛋白表達Fig.4 Protein expression of NF-κB/p65 and IκBα in mice colon (in cytoplasm)注：與UC模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。Note:Compared with the model group,**P<0.01,*P<0.05.

IL-6通過“反式傳導信號” 誘導STAT3磷酸化，STAT3可誘導抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL，抗凋亡因子阻止炎性細胞凋亡，促進T淋巴細胞增殖、刺激細胞毒性T細胞反應，導致慢性炎癥的發生。IL-6/STAT3信號通路也可激活造血干細胞從G0期進入G1期，促進巨噬細胞和中性粒細胞分泌、增殖，誘發UC發生并加重發展[22]。

由圖5可得，與空白組比較，模型組p-STAT3/STAT3的蛋白表達比值明顯升高(P<0.01)。給藥后，與模型組比較，陽性對照組和CA組的p-STAT3/STAT3表達比值明顯降低(P<0.01)。這些結果表明，CA可抑制STAT3的磷酸化來阻止STAT3在細胞核中的調控作用[22]。

圖5 小鼠結腸組織中p-STAT3/ STAT3的蛋白表達Fig.5 Protein expression of p-STAT3/ STAT3 in mice colon注：與UC模型組比較，**P <0.01，*P<0.05。Note:Compared with the model group, **P<0.01,*P<0.05.

4 討論

潰瘍性結腸炎(UC)常見于經濟生活水平較好的歐美發達國家，發病率遠高于亞洲國家。但近年隨著亞洲國家經濟水平的發展和生活水平的提高，UC的發病率在我國逐年上升。UC的發病機制至今尚未明確，已知腸道內菌群失衡、內環境紊亂將對腸黏膜免疫系統進行刺激，改變黏膜通透性，進而誘發免疫反應，促使UC發生。

桂皮醛(CA)是一種有效的抗炎抗菌的藥物，能對腸道菌群進行調整并促使其穩定，有助于改善腸道屏障功能。本課題組在對馬齒莧-肉桂的前期研究發現，兩者聯用對小鼠UC有顯著效果。為了進一步明確肉桂在潰瘍性結腸炎中發揮作用的主要成分，本研究通過建立DSS誘導UC小鼠模型，給予CA治療，評估CA的治療效果。DAI評分結果顯示CA可改善小鼠體重下降、腹瀉、血便等癥狀；病理評分結果顯示CA能夠保護腸粘膜，減少隱窩細胞的損傷以及炎癥細胞浸潤，腺體紊亂和消失減輕，改善炎癥。潰瘍性結腸炎的發生很大程度與炎性因子的失衡和免疫反應的異常密切相關[23]，UC患者結腸中促炎細胞因子水平升高，抗炎細胞因子水平降低，從而產生免疫功能紊亂，導致UC的發展。本研究中，CA顯著降低了結腸組織中促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α含量(P<0.01)，這可能與抑制STAT3信號通路的表達有關，同時CA還使小鼠結腸組織中抑炎因子IL-4、IL-10含量顯著升高(P<0.01)。炎癥因子的表達變化影響因素較多，由于動物的個體差異等因素影響，我們的實驗結果沒有呈現出劑量依賴性，而病理評分卻呈劑量依賴性，這是由于炎性因子是微量指標，病理評分顯示的是腸道整體情況，所以應該主要依據動物疾病活動指數及病理評分來判斷藥物的作用效果。

促炎細胞因子都是由細胞內信號分子的復雜網絡轉錄調控,核轉錄因子(NF-κB)和信號傳導及轉錄激活因子3(STAT3)在介導這一異常的免疫反應中起著重要作用。NF-κB有明顯的促炎特性，通過Western blot技術顯示NF-κB蛋白的表達條帶，可以看到CA組NF-κB蛋白在細胞質中的表達較模型組顯著升高，且有顯著性差異(P< 0.01)；從p-STAT3及STAT3蛋白的條帶表達和灰度值得出，CA組較模型組p-STAT3/STAT3蛋白表達明顯降低，且有顯著性差異(P< 0.01)。上述實驗結果說明CA對DSS誘導的UC小鼠的保護作用與炎癥關鍵蛋白NF-κB和STAT3的激活密切相關。

綜上所述，CA可以顯著改善腸炎引發的體重減輕、腸炎疾病評分降低，和結腸組織炎性改變，減少促炎因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌，促進抗炎因子IL-4、IL-10的表達，其減輕炎癥的作用可能與抑制NF-κB及STAT3的免疫炎癥信號通路有關。本實驗僅研究了其在動物水平的療效，今后將研究其在細胞、分子和基因水平的治療機制，為我國治療UC提供更多選擇。