茶多酚-羧甲基殼聚糖水凝膠促進大鼠創面修復研究

陳 凱，柳云恩，佟昌慈，叢培芳，馬瑞珩

1.上饒師范學院生命科學學院 上饒農業技術創新研究院，江西 上饒 334000；2.北部戰區總醫院 急診醫學部，遼寧 沈陽 110016

皮膚撕裂傷是老年人和嬰兒常見的急性創傷[1]。急性創傷可發展為慢性復雜創傷，增加患者的經濟和心理負擔，降低生活質量。生長因子是治療皮膚創傷的主要藥物，但會增加瘢痕組織形成和癌癥風險[2]。因此，需要開發其他促進皮膚創面修復和再生的有效藥物或生物活性材料。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)是由殼聚糖經甲基化制得，含有陽離子(-NH3+)和陰離子(-COO-)基團。CMCS水凝膠具有抗菌活性，可防止傷口感染，促進細胞增殖，加速膠原沉積，并刺激傷口愈合過程[3-4]。有研究表明，CMCS水凝膠是一種良好的生物相容性材料，可作為創面修復的候選敷料[5]。茶多酚(epigallocatechin gallate，EGCG)具有顯著的抗炎、抗衰老、抗菌、抗癌、抗肥胖、調節腸道菌群等功效[6]，還可以降低創面的炎癥反應，加速創傷修復，促進創面表皮再生，是一種具有良好生物安全性的、能夠加速創面修復的天然原材料[7]。本研究旨在制備一款新型的EGCG-CMCS水凝膠，并探討其對大鼠創面的保護和修復作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 EGCG購自麥克林公司，CMCS由中國科學院金屬研究所提供(平均分子量為6.2×104,脫乙酰度為84%)。實驗用水為實驗室制備的雙次蒸餾去離子水，其余藥品均購自國藥。45只SPF級健康雄性SD大鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號SCXK(遼)2015-0001，體質量180～220 g，單籠飼養，自由飲水和飲食，適應環境7 d。大鼠飼養條件：室溫條件下，濕度50%～60%，燈光-黑暗12 h晝夜循環。

1.2 CMCS和EGCG-CMCS水凝膠制備 CMCS水凝膠：15.0 ml離心管中稱取0.2 g殼聚糖，置于無菌操作臺，經紫外照射1.0 h滅菌后，加入10.0 ml滅菌去離子水，充分溶解后，形成0.2% CMCS水凝膠，4.0℃避光保存。EGCG-CMCS水凝膠：15.0 ml離心管中稱取0.2 g殼聚糖+0.3 g茶多酚，置于無菌操作臺，經紫外照射1.0 h滅菌后，加入10.0 ml滅菌去離子水，充分溶解后，形成EGCG(0.3%)-CMCS(0.2%)水凝膠，4.0℃避光保存。

1.3 大鼠皮膚全缺損模型建立 大鼠腹腔注射10.0%水合氯醛(4.0 ml/kg)進行麻醉，用剃須刀剃掉大鼠背部約1 600.0 mm2的毛，用脫毛膏脫掉短毛，用75.0%酒精消毒，用滅菌后的打孔器在大鼠脊背中心劃出直徑為1.5 cm的圓形印，用滅菌后手術剪刀剪去圓形中結締組織層上的全層皮膚，完成皮膚全層缺損模型。

1.4 分組與給藥 45只大鼠被隨機分入空白組、CMCS水凝膠組、EGCG-CMCS水凝膠組，每組各15只。建模成功后，每天給予CMCS水凝膠組和EGCG-CMCS水凝膠組大鼠創面CMCS水凝膠和EGCG-CMCS水凝膠，連續3 d。給藥前，用生理鹽水沖洗創面及創面周圍，然后拍照，給藥后單籠飼養。大鼠皮膚組織分別在術后7、10、15 d取材。

1.5 創傷面積測量 每天對傷口區域(新表皮未覆蓋的區域)進行拍照，由兩位經驗豐富的研究人員獨立用Imagej1.48軟件進行分析。創傷恢復百分比用下列公式計算：

創傷恢復百分比=(第1天創傷面積-第n天創傷面積)/第1天創傷面積×100%

1.6 組織學觀察 術后7、10、15 d采集皮膚標本。皮膚組織用10%甲醛固定2～3 d，經梯度酒精脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色及改良Masson染色。在顯微鏡下觀察組織創面生長情況和膠原沉積。

2 結果

2.1 3組大鼠體質量變化情況 3組大鼠術后當天飲食均有一定減少，隨后恢復正常。術后1 d，3組大鼠體質量均下降，EGCG-CMCS水凝膠組大鼠體質量降低最少；術后2 d，3組大鼠體質量均顯著增加；術后3～15 d，3組大鼠體質量均逐漸增加。同一時間點，EGCG-CMCS水凝膠組大鼠體質量略高于其他兩組。實驗過程中，3組大鼠創面及創面附近未發生腫脹、出血、起泡、局部并發癥、感染等；另外，大鼠的物理運動參數，如探索行為、行動、后腿站立等也未出現明顯的疼痛跡象。見圖1。

圖1 3組大鼠體質量變化情況

2.2 3組大鼠創面愈合情況 術后3 d，3組大鼠創面均呈干燥狀態，創面及周圍皮膚組織未見明顯的紅腫、分泌物及感染狀態；同時，創面周圍毛發開始生長。術后7 d，3組大鼠創面明顯縮小，EGCG-CMCS水凝膠組創傷恢復百分比高于其他兩組(P<0.05)。與空白組創面結痂呈堅硬狀態不同，EGCG-CMCS水凝膠組創面結痂完全脫落，出現新生肉芽組織；術后15 d，3組創傷恢復百分比接近，但空白組結痂仍未完全脫落，CMCS水凝膠組和EGCG-CMCS水凝膠組的結痂均已完全脫落，創面恢復情況顯著好于空白組(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組大鼠創面愈合情況

2.3 3組大鼠創面組織病理學變化情況 蘇木精-伊紅染色顯示：術后7 d，空白組大鼠組織中含有少量的新生肉芽組織、新生毛細血管及膠原蛋白沉積，同時伴有大量的炎癥細胞、水腫、壞死細胞及血塊，而CMCS水凝膠組和EGCG-CMCS水凝膠組均呈現出對于炎癥細胞的明顯抑制效果；CMCS水凝膠組創面觀察到大量的新生肉芽組織，伴隨大量的新生毛細血管、少量炎癥細胞及大量的膠原蛋白沉積，EGCG-CMCS水凝膠組創面處具有最多的新生肉芽組織和新生毛細血管，表面細胞大量增殖，已經出現較為致密的膠原纖維，炎癥細胞基本消失；術后15 d，CMCS水凝膠組和EGCG-CMCS水凝膠組創面處出現大量的新生血管、肉芽組織及致密的膠原纖維；EGCG-CMCS水凝膠組的上表皮化水平和膠原蛋白纖維致密水平顯著好于其他兩組(P<0.05)。見圖3。Masson染色顯示：各時間點的EGCG-CMCS水凝膠組的膠原纖維含量均為最高的，空白組的膠原纖維含量均為最低(P<0.05)。見圖4。

圖3 3組大鼠組織病理情況

圖4 3組大鼠創面膠原纖維情況

3 討論

傷口愈合是一個涉及纖維細胞、巨噬細胞、表皮細胞等多種細胞類型的動態過程[8]。創傷修復過程中的一個關鍵指標就是創面處新血管形成。創面處新血管形成和增殖可以為創面帶來營養物質，促進細胞增殖和膠原蛋白沉積[9]。本研究發現,EGCG-CMCS水凝膠組大鼠體質量略高于其他兩組，且局部創面未發現腫脹、出血、感染等癥狀；EGCG-CMCS水凝膠組創傷恢復百分比高于其他兩組(P<0.05)，且EGCG-CMCS水凝膠組創面結痂完全脫落，出現新生肉芽組織；EGCG-CMCS水凝膠組可見大量新生肉芽組織和新生毛細血管，表面細胞大量增殖，已經出現較為致密的膠原纖維，炎癥細胞基本消失；EGCG-CMCS水凝膠組的上表皮化水平和膠原蛋白纖維致密水平顯著好于其余兩組，膠原纖維含量也顯著高于其余兩組(P<0.05)。這提示，EGCG-CMCS水凝膠增強創傷修復速度可能是EGCG和CMCS協同作用的結果。CMCS水凝膠被廣泛認為是理想的傷口敷料，因其具有良好的生物安全性和多種生物活性[10]。有研究報道，CMCS水凝膠具有隔絕外界細菌的作用，可為創面愈合提供持續的濕潤環境，含有促進上皮細胞遷移、生長等作用及運載多種小分子的活性物質，是一種很好的藥物載體[11]。Huang等[12]提出，EGCG可通過靶向 Notch促進鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠創面愈合。EGCG可放大具有適當的抗張強度、孔隙度、吸收傷口滲出物的膨脹性傷口貼片的效力，通過調節生長因子和炎癥細胞因子，發揮收縮創面、促進膠原沉積、加強創面血管化的作用，加速愈合[7]。

綜上所述，EGCG-CMCS水凝膠具有良好的促進血管生成和表皮再生作用，可促進大鼠創面的膠原蛋白沉積和肉芽組織形成，加速創面愈合。