內嵌納凝膠陰離子交換聚甲基丙烯酸羥乙酯復合晶膠分離苯乳酸研究

賀亞維，張頌紅，黃杰，劉流，李國華，贠軍賢

（1 陜西能源職業技術學院，陜西咸陽712000； 2 浙江工業大學化學工程學院，綠色化學合成技術國家重點實驗室培育基地，浙江杭州310032）

引 言

苯乳酸（PLA）是一種天然、安全、無毒副作用的有機酸，其水溶性良好，理化性質穩定，具有廣譜抑菌性[1-3]。PLA 不僅可作為新型生物防腐劑，還是藥物中間體和合成新型高分子材料聚苯乳酸的關鍵單體。因此，在食品、醫藥和化工等行業中有很好的應用潛力[4-6]。PLA 可經乳酸菌、植物乳桿菌、芽孢桿菌、白地霉菌等多種微生物發酵或轉化合成[7-12]，但其在發酵液和轉化液中的濃度不高，而且該過程中會形成其他有機酸副產物。因此，從發酵液或轉化液中分離獲得高純度的PLA，顯得尤為關鍵。

晶膠是一種由單體經低溫冷凍聚合和結晶致孔得到的新型分離介質，其內部有尺寸數微米至數百微米的相互連通超大孔隙，具有傳質阻力小、對流傳質效果好、生物相容性優良和分離操作簡單等優點[13-17]。晶膠基質孔壁表面經接枝功能基團或引入配基后，可用于細胞、蛋白、酶、抗體等分離[18-26]。但是，晶膠介質內部的超大孔隙導致其比表面積較小，經常規接枝修飾后其吸附容量較低。針對此不足，許多學者致力于制備內嵌微/納米粒的復合晶膠，利用微/納米粒子的高比表面積來增大晶膠的吸附量[27-33]。

納凝膠是一種由物理或化學交聯而成的納米級三維網狀聚合物體系，具有尺寸可控、比表面積大、分散穩定等優點[34-35]，其良好的生物相容性和功能化修飾方便的特點使其在藥物靶向輸送方面也受到廣泛關注[36-40]，此外，在酶固定化方面也有一定的應用[41]。但是，納凝膠作為獨立分離介質方面的應用鮮有報道。如果將疏水性納凝膠內嵌于晶膠介質中得到新型復合晶膠介質，不但可以保持晶膠的超大孔隙特征，有利于微生物細胞或生物大分子通過，同時還可以彌補晶膠介質有效吸附面積小的不足，并借助納凝膠的吸附優勢提高對目標物的吸附容量。將疏水性納凝膠內嵌于親水性晶膠之中，還可以實現對不同疏水性能蛋白質或小分子的選擇性吸附。

本文以疏水性甲基丙烯酸丁酯為單體，通過超聲乳液聚合反應制備得到尺寸較小、粒度均勻、分散穩定的聚甲基丙烯酸丁酯納凝膠；然后以甲基丙烯酸羥乙酯和所得納凝膠為基材，通過低溫結晶致孔和聚合反應，得到內嵌納凝膠的納晶膠介質；再采用原位接枝法接枝功能單體N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨，得到內嵌納凝膠的陰離子交換復合晶膠，即納晶膠。測定了不同配比納晶膠的基礎性能，并對其從發酵液中層析分離苯乳酸的性能進行了考察。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA，97%）、聚乙二醇二丙 烯 酸 酯（PEGDA，Mn=250）、四 甲 基 乙 二 胺（TEMED，99%），Sigma-Aldrich；甲基丙烯酸丁酯（BMA，99%）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，98%）、十二烷基硫酸鈉（SDS，98%）、過硫酸銨（APS，98%）、N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨（VBTAC，99%）及其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗儀器

激光粒度儀（Zetasizer Nano ZS90），英國馬爾文儀器有限公司；低溫恒溫槽（THD-3030）、數控超級恒溫槽（SC-15），寧波天恒儀器廠；紫外檢測儀（HD-21-88），上海琪特分析儀器有限公司；臺式掃描電鏡（SEM）（Hitachi S-4700），日本日立高新技術公司；透射電子顯微鏡（TEM）（JEM-1200EX），日本電子株式會社。

1.3 pBMA納凝膠的制備

將單體BMA 和交聯劑EDMA 按質量比9∶1 配制成總質量濃度為10%的溶液；再加入乳化劑十二烷基硫酸鈉（SDS），其濃度為混合溶液總質量的2%，在35℃水浴條件下超聲乳化30 min；然后再加入引發劑APS 和加速劑TEMED，其中APS 和TEMED 濃度分別為BMA+EDMA 總質量的1.5%和3.0%；繼續超聲5 min，再經過1 h 反應后得到淡藍色透明的pBMA 聚合物乳液。反應制得的納凝膠用激光粒度儀測定平均粒徑、粒徑分布和Zeta電位。

1.4 pHEMA納晶膠的制備

以單體HEMA 和納凝膠pBMA 為復合基材，PEGDA 為交聯劑，在引發劑APS 和加速劑TEMED的共同作用下，進行冷凍聚合制備納晶膠。制備過程 中，HEMA、pBMA 和PEGDA 的 總 質量 濃 度 為15%，其中HEMA 與pBMA 的質量比分別為9∶1，8∶2和7∶3 三種，HEMA 與PEGDA 的質量比為77∶23。將以上物料配比的水溶液混合均勻后置于冰水浴中預冷40 min，然后分別加入APS 和TEMED，其中APS 和TEMED 濃度均為HEMA 和PEGDA 總質量的0.8%，然后迅速移至-15℃條件下冷凍反應6 h，再放入-20℃冰箱內繼續低溫聚合反應18 h，得到內嵌納凝膠的新型復合晶膠——納晶膠。將充分反應后的納晶膠介質于室溫下解凍，然后用大量超純水沖去未聚合單體。以1 mol·L-1VBTAC為接枝單體，對納晶膠介質進行化學修飾，得到陰離子交換型納晶膠介質。納晶膠的制備、接枝機理和接枝過程與文獻[26-27]相同。

1.5 pHEMA納晶膠的基礎性能

納晶膠的基礎性能主要由孔隙結構、孔隙率、滲透率和等板高度（HETP）等體現。采用稱重法測定孔隙率，流量-壓差法測定滲透率，用掃描電鏡（SEM）分析孔隙結構，通過脈沖示蹤法測定不同流速下的停留時間分布（RTD）曲線，根據相應的公式進行計算得到HETP，測定方法同文獻[22,26-27]。

1.6 pHEMA納晶膠的層析性能

以牛血清白蛋白（BSA）為模型蛋白，研究不同配比陰離子交換型納晶膠介質的層析性能，整個過程用紫外檢測器實時監測。用0.02 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（PB,pH=7.2）平衡納晶膠，將1 mg·ml-1BSA 溶液以1 cm·min-1速度上樣至飽和，用一定體積的PB 沖洗未吸附的BSA，直到流出液的吸光值趨于穩定，再用1 mol·L-1的NaCl 溶液進行洗脫，洗脫液以每管0.39 ml 收集，用考馬斯亮藍法檢測BSA 濃度，最終獲得納晶膠介質的吸附容量，方法同文獻[22,26-27]。

1.7 pHEMA納晶膠對苯乳酸的吸附性能測試

用HEMA 與pBMA 質量比為8∶2 的納晶膠介質進行苯乳酸吸附性能測試，整個過程仍用紫外檢測器實時監測。用超純水在1 cm·min-1流速條件下平衡納晶膠，再以相同流速上樣濃度為10 mg·ml-1PLA 溶液，待上樣平衡后，用超純水沖洗，最后用1 mol·L-1NaCl 溶液洗脫，以每管0.39 ml 收集，通過HPLC 判斷洗脫液中PLA 濃度，進而檢測納晶膠對PLA 的吸附量。層析完成后先用2 mol·L-1NaCl 溶液洗去晶膠柱內的所有殘留物質，再用大量超純水清洗晶膠柱以備下次使用。

1.8 pHEMA納晶膠分離轉化液中的苯乳酸

選用上述HEMA 與pBMA 質量比為8∶2 的納晶膠介質從轉化液中分離苯乳酸。以本課題組保藏的Lactobacillus casei B3 為菌體，轉化苯丙酮酸（PPA）得到PLA 溶液，將轉化液用超純水稀釋5 倍，使信號在紫外檢測儀的合適范圍內。然后以與1.7節相同的方法上樣、沖洗、洗脫及清洗，并通過HPLC測定洗脫液中PLA濃度。

2 實驗結果與討論

2.1 pBMA納凝膠的制備與表征

2.1.1 pBMA 納凝膠的FT-IR 表征 圖1 為分別對BMA、EDMA 和pBMA 進行紅外表征得到的結果，從圖1 中可以看出，2958 cm-1的峰為pBMA 納凝膠中碳氫鍵的伸縮振動引起的紅外吸收峰，在1732 cm-1處有一個明顯的吸收峰，來自于酯基的羰基伸縮振動引起的強紅外吸收峰，1465 cm-1處為碳氫鍵的面內彎曲振動吸收峰，1152 cm-1處為酯基的碳氧鍵的伸縮振動吸收峰，而在1600～1680 cm-1之間的碳碳雙鍵的振動吸收峰消失，說明BMA 與EDMA 均通過碳碳雙鍵斷裂發生了聚合反應，pBMA 納凝膠得以成功合成。

圖1 BMA、EDMA、pBMA的紅外譜圖Fig.1 FT-IR spectra of BMA,EDMA,pBMA

2.1.2 pBMA 納凝膠的粒徑表征 圖2 為通過DLS測量的pBMA 納凝膠粒徑大小分布，其平均粒徑約為36 nm。同時，DLS 測量結果顯示其多分散系數（PDI）為0.1，Zeta 電位在-60 mV 以下，表明該納凝膠具有較好的分散性和穩定性。

圖2 pBMA納凝膠粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of pBMA nanogels

2.2 pHEMA納晶膠的基礎性能

2.2.1 孔隙結構和孔隙率 圖3為不同配比納晶膠介質的掃描電鏡圖，從圖中可以看出，晶膠內部為孔徑分布均勻的超大孔隙，孔隙間連通性好，與傳統晶膠介質具有相同的結構特性。各配比納晶膠的孔隙率數據可見表1，其中有效孔隙率在80%左右，絕干孔隙率在84%以上，該孔隙率與內嵌SiO2的HEMA 晶膠柱[33]及未內嵌納凝膠的HEMAVBTAC 晶膠介質都非常接近[42]。因此HEMA 與pBMA 納凝膠的配比未對晶膠骨架的孔隙微觀結構產生明顯影響，所得納晶膠可作為蛋白質等生物大分子的層析分離介質。

2.2.2 滲透率 實驗測定了納晶膠介質內壓降與流量的關系，并根據Darcy 定律，回歸計算得到晶膠柱的滲透率，如表2 所示。由表2 可知，隨著復合單體溶液中pBMA 納凝膠含量的增加，納晶膠的滲透率呈現下降趨勢，究其原因可能是由于部分孔隙表面被納凝膠所占據，在一定程度上增加了管壁粗糙度，同時也降低了孔隙率，從而增大了流體在其中的流動阻力。不過，從納晶膠的滲透率數值來看，其值處于0.35×10-12～1.77×10-12m2范圍，與文獻中未添加納凝膠時的普通晶膠介質[42]及包埋了顆粒的晶膠介質[28,32-33]都比較接近，表明制備所得新型納晶膠仍具有較好的傳質性能。

表1 納晶膠介質孔隙率Table 1 The porosities of nano-cryogels

表2 不同配比的納晶膠長度和滲透率Table 2 Permeability and length of the composite cryogel matrix with different mass ratios of HEMA to pBMA nanogels（column inner diameter：10 mm）

2.2.3 停留時間分布 圖4 為流速從1 cm·min-1增大到8 cm·min-1時不同配比納晶膠介質停留時間分布。由圖4 可知，實驗中所用不同配比的納晶膠RTD 峰形都表現了較好對稱性，說明晶膠介質內部孔隙結構分布均勻，孔隙間連通性很好。計算所得各配比納晶膠的HETP 見圖5，從圖中可以看出，當納晶膠中納凝膠含量較高時，相應的HETP 值也較大，說明將納凝膠嵌入晶膠介質之后在一定程度上影響了傳質性能。不過，從總體來看，HETP 值處于0.1～0.4 cm 之間，相應軸向擴散系數范圍為1×10-7～8×10-5m2·s-1，這些均與之前的晶膠介質相近[27,33,42]，說明了以HEMA 和pBMA 納凝膠作為復合晶膠基材的納晶膠具有較好的柱效性能，可實現良好的傳質效果。

圖3 陰離子交換型納晶膠介質掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope photographs of anion-exchange nano-cryogels

圖4 納晶膠介質停留時間分布HEMA與pBMA納凝膠質量比：(a)9∶1;(b)8∶2;(c)7∶3Fig.4 Residence time distribution curves in nano-cryogels

圖5 納晶膠介質在不同流速下的HETP值Fig.5 HETP values of nano-cryogels at various liquid velocities

2.3 pHEMA納晶膠的層析過程

不同配比HEMA 和pBMA 的納晶膠在1 cm·min-1流速下層析BSA（1 mg·ml-1）模型蛋白的性能結果如圖6所示。由圖6可知，對于HEMA 與pBMA 質量比分別為9∶1、8∶2 和7∶3 的三種納晶膠，其吸附容量分別為3.9、4.4 和5.4 mg·ml-1，說明本實驗所得新型納晶膠介質吸附容量隨著pBMA 納凝膠含量的增加而有所上升。這是由于內嵌納凝膠使原本光滑平整的晶膠壁面變得粗糙不平，納晶膠介質的比表面積得以增大，有利于提高離子交換基團的接枝量，從而提高了離子交換吸附量；另一方面，由于pBMA 納凝膠顆粒的吸附作用，使得BSA 的吸附量得以進一步增加。

圖6 納晶膠層析BSA曲線Fig.6 Chromatographic curves of BSA in the nano-cryogels with different mass ratios of HEMA to pBMA nanogels

2.4 pHEMA納晶膠對苯乳酸的吸附性能測試

圖7 納晶膠介質對PLA的吸附層析過程Fig.7 Chromatographic adsorption process of PLA in the nano-cryogel

圖7 是以HEMA 與pBMA 質量比為8∶2 的晶膠柱為例，在1 cm·min-1流速下，PLA 在納晶膠介質床柱內穿透、沖洗和梯度洗脫的曲線。根據層析曲線計算吸附容量，得到濕納晶膠介質對PLA 的吸附容量為20.7 mg·ml-1，明顯大于未內嵌納凝膠的HEMA-VBTCA 晶膠柱對PLA 的吸附量（14.64 mg·ml-1）[42]，證明該納晶膠對小分子目標物具有較強的吸附能力，在內嵌的pBMA 納凝膠的疏水性和因高比表面積產生的高吸附性共同作用下，該納晶膠的吸附苯乳酸的能力得以明顯提升。

2.5 pHEMA納晶膠分離轉化液中的苯乳酸

以Lactobacillus casei B3轉化PPA得到的PLA溶液作為分離對象，分析得到轉化原液組成為PLA 3.924 mg·ml-1（74.66%），PPA0.017 mg·ml-1（0.31%），其他雜質25.03%。層析前，用超純水將轉化液稀釋5倍，層析過程中，上樣量為床柱體積的2倍，上樣結束后用超純水沖洗，然后用0.1 mol·L-1NaCl 洗脫液進行洗脫，圖8 是層析轉化過程中PLA 濃度和純度隨過柱液體體積的變化。由圖8 可見，上樣液中的PLA 和PPA 在穿透過程和沖洗階段均未被檢測到，所吸附的PLA 被0.1 mol·L-1NaCl 溶液洗脫下來且純度較高，隨著洗脫的進行，大部分的PLA 已解吸，導致洗脫液PLA濃度和純度都有所下降。

圖8 上樣液層析過程中PLA的濃度和純度變化Fig.8 Concentrations and purities of PLA with the loading liquid volume during the chromatography process of sample solution

圖9為層析過程中典型的上樣、沖洗、洗脫階段目標產物PLA 和雜質的HPLC 分析結果。可見，由于沖洗和洗脫已除去了絕大部分雜質，洗脫流出液中能檢測到濃度和純度都較高的PLA，所得PLA 純度高達89.24%，相應的PLA回收率為93.74%。這可能是納晶膠柱效較高，且因同時具有疏水和離子交換作用，可以在靜電和疏水作用的共同作用下使目標物PLA更高效率地得到分離。

3 結 論

將疏水性pBMA 納凝膠內嵌于HEMA 基晶膠骨架得到新型納晶膠，再接枝功能單體，使納晶膠介質既具有納凝膠的疏水作用和高吸附性能，也具有晶膠介質的陰離子交換能力和良好傳質性能。制備得到的pBMA-HEMA 納晶膠介質孔隙率高、內部結構分布均勻、滲透性能和傳質性能優良，以稀釋5倍的轉化液按2 倍床柱體積上樣，再用0.1 mol·L-1NaCl 洗脫液進行洗脫，分離所得PLA 純度高達89.24%，回收率為93.74%。說明制備得到的新型納晶膠介質，可以較好地用于從苯乳酸轉化液中分離苯乳酸，而且有望應用于生物有機酸分子的分離等領域。

符 號 說 明

E——停留時間分布函數，s-1

HETP——理論塔板高度，m

kw——晶膠介質滲透率，m2

L——晶膠介質長度，m

圖9 層析轉化過程中不同階段流出液的HPLC圖Fig.9 HPLC results of PLA and other contamination contents in the effluent sample for the chromatography process of sample solution