花櫚木葉黃酮類化合物提取純化工藝優化

朱仕豪，凌智輝，張湘龍，唐 其,2，陸 英,2

（1.湖南農業大學園藝學院，湖南 長沙 410128；2.國家中藥材生產（湖南）技術中心， 湖南 長沙 410128）

花櫚木（Ormosia henryi Prain）為豆科紅豆屬常綠喬木，又名花梨木、臭桶柴、紅豆樹等，分布于我國安徽、浙江、江西、湖南、湖北、廣東、四川、貴州、云南等地[1]。花櫚木以根、根皮、莖及葉入藥，全年可采，曬干備用或鮮用，主治跌打損傷、腰肌勞損、風濕關節痛、產后血瘀腹痛、白帶、流行性腮腺炎、絲蟲病；根皮外用治骨折，葉外用治燒傷、燙 傷[2]。目前，花櫚木主要作為園林綠化樹種，同時因其木材致密質重，紋理清晰美麗，多用于制作高檔家具、裝飾品以及文房諸器等，故對其研究主要集中在育種、施肥等方面[3-6]，而對其化學成分及藥理作用的研究相對較少，Feng 等[7]從花櫚木根皮中分離得到23 個化合物，并對其中的2 個化合物進行了抗氧化活性和抗癌活性研究。課題組前期研究發現，花櫚木葉提取物中含有具抗抑郁活性的成分，從中分離鑒定得到8 個黃酮類化合物，采用UPLC- ESI-QTOFMS/MS 技術初步鑒定出46 種黃酮類化合物[8]。為進一步提高提取物中黃酮類化合物的含量，筆者對花櫚木葉黃酮提取工藝進行優化，并通過靜態吸附和解析對10 種大孔吸附樹脂進行了篩選，再通過動態吸附試驗對花櫚木葉總黃酮的純化工藝進行優化，旨在為花櫚木葉進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試原料花櫚木葉采于湖南省郴州市桂陽縣湖南利諾生物藥業有限公司，60℃烘干后粉碎，過20 目篩，密封保存備用。

主要試劑有蘆丁標準品（純度98%，上海源葉生物科技有限公司），無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司），HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM130、AB-8、D101、NKA-9、X-5 等10 種大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。

主要儀器有粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），101-1AB 電熱鼓風干燥箱、HH-ZK8 電熱恒溫水浴鍋（上海標和儀器有限公司），UV-2100 紫外分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線制作 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法，精密稱取干燥至恒重的純度為98%的蘆丁標準品8.14 mg，置于10 mL 容量瓶中，用70%的乙醇溶解，然后再加入70%乙醇定容至刻度，搖勻，精密吸取蘆丁標準溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加70%的乙醇補充至2 mL；加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，搖勻后放置6 min；然后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4 mL，搖勻后再放置6 min；再加入5%的NaOH 溶液4 mL，最后用70%的乙醇定容，搖勻后放置10 min，在510 nm 波長處測定吸光值，重復測定3 次。以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，獲得線性方程y=12.415x-0.003 5（R2=0.999 6）。花櫚木總黃酮得率（%）=樣品中總黃酮的質量（g）/干物料的質量（g）×100。

1.2.2 花櫚木葉總黃酮提取工藝優化 （1）花櫚木葉總黃酮提取工藝流程：取1.0 g 花櫚木葉原料加入提取溶劑后置水浴鍋中提取一定時間，趁熱過濾，定容至50 mL，取樣檢測。（2）單因素試驗。分別對乙醇體積分數（0、30%、50%、70%、90%、100%）、料液比（1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50，g/mL）、提 取 溫 度（30、50、70、80、90、100 ℃）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）4 個因素進行單因素試驗。（3）正交試驗。在單因素試驗的基礎上，分別在每個因素的最佳值附近選擇3 個水平，然后進行4 因素3 水平的L9（34）正交試驗，優化提取工藝。

1.2.3 花櫚木葉總黃酮純化工藝優化 （1）花櫚木葉總黃酮的制備。取花櫚木葉粉末，按1.2.2 中所得最佳工藝條件進行提取，55℃旋轉蒸發濃縮至無乙醇味，然后用等體積石油醚萃取3 次，分離石油醚層后，取水相在55℃旋轉蒸發，除去殘留石油醚后測定總黃酮含量，冷藏備用，使用時用水稀釋至所需濃度。（2）樹脂預處理。將新購的大孔吸附樹脂用95%乙醇充分浸泡溶脹24 h，濕法裝柱，用蒸餾水洗滌至無乙醇味，備用。（3）樹脂篩選。將10 種預處理好的大孔吸附樹脂去除表面水分后，各精密稱取2.0 g 至于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL 濃度為2.14 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液，置于30℃恒溫搖床，100 r/min 條件下振蕩24 h，計算各型號樹脂的吸附量。將充分吸附后的各型號樹脂用少量蒸餾水沖洗，除去表面水分后，加入50 mL 70%的乙醇溶液，置于30℃恒溫搖床，100 r/min 條件下振蕩解吸24 h，計算解析量。根據吸附量和解吸量，選擇最合適的樹脂。（4）上樣液濃度的確定。取濃度分別為0.43、0.86、1.29、1.71、2.14 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液各150 mL，以3 BV/h 的流速分別通過裝有50 mL AB-8 樹脂的層析柱，進行動態吸附，收集流出液，對其中的總黃酮含量進行檢測，篩選出最佳上樣液濃度。（5）上樣液pH 值的確定。取150 mL 濃度為1.71 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液5 份，分別用冰乙酸或者NaOH 調節pH 值至2、3、4、5 和6，以3 BV/h 的流速分別通過裝有50 mL AB-8 樹脂的層析柱，進行動態吸附，收集流出液，對其中的總黃酮含量進行檢測，篩選出最佳上樣液pH 值。（6）上柱流速的確定。取150 mL 濃度為1.71 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液5 份，將pH 值調節至3，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速通過裝有50 mL AB-8 樹脂的層析柱，進行動態吸附，收集流出液，對其中的總黃酮含量進行檢測，篩選出最佳上柱流速。（7）上柱體積的確定。將pH 值為3，濃度為1.71 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液，以4 BV/h 的流速通過裝有50 mL AB-8 樹脂的層析柱，進行動態吸附，收集流出液，每50 mL 為一個流分，共收集16 個流分，對其中的總黃酮含量進行檢測，確定最佳的上柱體積。（8）洗脫劑濃度的確定。取AB-8 大孔吸附樹脂5 份，每份50 mL，按上述得到的最佳條件進行上樣吸附，上樣完畢后靜置30 min，用150 mL 蒸餾水洗去雜質，用5 BV 體積分數分別為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液以3 BV/h 的流速洗脫，收集洗脫液，檢測總黃酮含量，篩選出最佳洗脫劑濃度。（9）洗脫流速的確定。取AB-8 大孔吸附樹脂5份，每份50 mL，按上述得到的最佳條件進行上樣吸附，上樣完畢后靜置30 min，用150 mL 蒸餾水洗去雜質，分別用5 BV 體積分數80%的乙醇溶液以1、2、3、4、5 BV/h 的流速進行洗脫，收集洗脫液，檢測總黃酮含量，篩選出最佳洗脫流速。（10）洗脫體積的確定。取AB-8 大孔吸附樹脂50 mL，按上述得到的最佳條件進行上樣吸附，上樣完畢后靜置30 min，用150 mL 蒸餾水洗去雜質，用體積分數80%的乙醇溶液以3 BV/h 的流速洗脫，每50 mL 收集一份洗脫液，檢測總黃酮含量，篩選出最佳洗脫體積。（11）純化效果驗證。按上述所得最佳純化工藝進行5 次重復試驗，將洗脫液濃縮后冷凍干燥得花櫚木葉總黃酮純化產品，測定其總黃酮含量，以驗證優化后工藝條件的純化效果。

2 結果與分析

2.1 花櫚木葉總黃酮提取工藝優化

2.1.1 單因素試驗結果 如圖1 所示，在乙醇體積分數70%、料液比1 ∶40（g/mL）、提取溫度80℃、提取時間1.0 h條件下，各單因素試驗的總黃酮得率最高，以此為基礎，設計表1 的正交試驗方案。

表1 正交試驗設計因素及水平

圖1 不同提取因素對花櫚木葉黃酮得率的影響

2.1.2 正交試驗結果 如表2 所示，從K 值可以看出，各因素不同水平對花櫚木葉總黃酮化合物浸出的影響大小為A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C1＞C3＞ C2、D3＞D2＞D1。從極差（R）值可以看出，不同因素對花櫚木葉總黃酮化合物浸出的影響大小為料液比＞乙醇體積分數＞提取時間＞提取溫度。綜合以上條件，確定花櫚木葉總黃酮的最佳提取工藝為A1B2C1D3，即乙醇體積分數60%，料液比1 ∶40（g/mL），提取溫度80℃，提取時間1.5 h。

由于最佳提取工藝組合未在正交試驗設計的9 個組合中，因此需要對最佳提取工藝進行試驗驗證，重復5 次，花櫚木葉總黃酮得率分別為2.81%、2.82%、2.85%、2.85%、2.84%，平均值為2.83%，相對標準偏差（RSD 值）為0.73%，高于其他試驗結果，表明正交試驗獲得的最佳工藝組合是有效且可靠的。對該工藝制備得到的花櫚木葉提取物經溶劑回收，冷凍干燥成粉末，測得提取物中總黃酮含量為15.95%。

表2 正交試驗結果

2.2 花櫚木葉總黃酮純化工藝優化

2.2.1 樹脂篩選 試驗考察了10 種大孔吸附樹脂的吸附/解吸性能，從表3 可以看出，HPD-100、HPD-400、AB-8、X-5 這4 種樹脂都具有很好的吸附性能，吸附量均大于41 mg/g，這4 種樹脂中AB-8 樹脂的解吸量和解吸率均較高，最終選擇AB-8 大孔吸附樹脂純化花櫚木葉總黃酮。

表3 10 種大孔吸附樹脂的吸附/解吸性能

2.2.2 上樣液濃度對總黃酮吸附率的影響 由圖2 可知，隨著上樣液濃度增加，吸附率不斷增大，是因為隨著濃度增加，分子越來越密集，與樹脂接觸并被吸附的概率越大；當上樣液濃度為1.71 mg/mL 時，吸附率為87.54%，達到最高；而繼續增加上樣液濃度，吸附率開始下降，是因為濃度過大，上樣液中的黃酮類物質還未被充分吸附即被濾出，導致吸附率降低。因此最佳上樣液濃度為1.71 mg/mL。

圖2 不同上樣液濃度處理總黃酮的吸附率

2.2.3 上樣液pH 值對總黃酮吸附率的影響 由圖3可知，隨著pH 值不斷增大，吸附率呈下降趨勢。黃酮類化合物因含有多個酚羥基而呈弱酸性，因而在酸性或者弱酸性條件下更容易與樹脂產生氫鍵，從而被吸附。隨著pH 值不斷增大，黃酮類化合物容易轉變成鹽，因而不容易被樹脂吸附，導致吸附率下降。由于pH 值為3 和pH 值為2 時的吸附率相差甚微，從經濟角度考慮，選擇將上樣液的pH 值調為3。

圖3 不同上樣液pH 值處理總黃酮的吸附率

2.2.4 上樣流速對總黃酮吸附率的影響 由圖4可知，隨著流速加快，吸附率越來越低。因為流速越慢，上樣液流過樹脂的時間越長，黃酮類物質與樹脂接觸更充分，從而更容易被吸附。流速為4 BV/h 與流速為1 BV/h 的吸附率相差不到1%，為了提高純化效率，選擇4 BV/h 的流速上樣。

圖4 不同上樣流速處理總黃酮的吸附率

2.2.5 上樣體積對總黃酮吸附率的影響 由圖5可知，隨著上樣體積增加，流出液中泄漏出來的總黃酮量越來越大，當上樣體積為5 BV 時，流出液中總黃酮濃度為0.18 mg/mL，稍大于上樣液濃度（1.71 mg/mL）的10%；當上樣體積達到13 BV 時，流出液中總黃酮濃度基本與上樣液濃度持平，說明達到吸附飽和。考慮到效率和效益，最終選擇上樣體積為5 BV。

圖5 不同上樣體積處理流出液總黃酮的濃度

2.2.6 洗脫液體積分數對解吸率的影響 由圖6可知，隨著乙醇體積分數不斷增大，解吸率越來越高，當乙醇體積分數達到80%之后，再增大乙醇體積分數對解吸率影響不大，為了節約成本，最終選擇體積分數80%的乙醇溶液作為洗脫劑。

圖6 不同洗脫劑體積分數處理總黃酮的解吸率

2.2.7 洗脫流速對解吸率的影響 由圖7 可知，隨著洗脫流速的加快，解吸率越來越低。洗脫流速過快，洗脫劑還未充分解吸樹脂上吸附的黃酮就已經流出柱外，導致解吸率低；流速太慢，雖然能充分解吸，但是 周期過長，洗脫流速為3 BV/h 與流速為1 BV/h 的解吸率相差甚微，為提高效率，確定洗脫流速為3 BV/h。

圖7 不同洗脫流速處理總黃酮的解吸率

2.2.8 洗脫液體積對解吸率的影響 由圖8 可知，當洗脫液體積為4 BV 時，洗脫液中的總黃酮濃度已經降至很低，說明此時樹脂所吸附的黃酮已基本洗脫完全，繼續洗脫成本增加而得率不高，還不利于溶液的濃縮，因此確定洗脫體積為4 BV。

2.2.9 純化效果驗證 綜合上述試驗結果，總黃酮最佳純化工藝參數如下：采用AB-8 大孔吸附樹脂，上樣液濃度1.71 mg/mL、上樣液pH 值=3，以4 BV/h流速上樣，上樣體積5 BV 進行吸附，然后以80%的乙醇溶液按3 BV/h 的流速洗脫，洗脫體積為4 BV。按最佳純化工藝條件重復試驗5 次，將洗脫液濃縮后冷凍干燥成粉末，測得粉末中總黃酮含量分別為29.94%、28.91%、29.63%、30.24%、28.85%，平均值為29.51%，相對標準偏差（RSD 值）為2.09%。這表明經AB-8 大孔吸附樹脂純化后，花櫚木葉提取物中總黃酮含量提高了約1 倍，實現了成分的富集。

圖8 不同洗脫體積處理流出液總黃酮的濃度

3 結 論

研究利用正交試驗得到回流提取法提取花櫚木葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分數60%，料液比1 ∶40（g/mL），提取溫度80 ℃，提取時間1.5 h。在此條件下，花櫚木葉總黃酮得率為2.83%，將提取液冷凍干燥成粉末后，測得其總黃酮含量為15.95%。

通過比較10 種不同型號大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率，發現AB-8 大孔吸附樹脂對花櫚木葉總黃酮有良好的吸附與解吸性能，其最佳純化工藝參數為上樣液濃度1.71 mg/mL，上樣液pH 值3，上樣流速4 BV/h，上樣體積5 BV，洗脫液為體積分數80%的乙醇溶液，洗脫流速3 BV/h，洗脫體積4 BV。經純化后，花櫚木葉提取物粉末中總黃酮含量由原來的15.95%提高至29.51%。