響應面法分析煙草花藥胚狀體誘導的最佳條件

黃子彧，劉昭偉，周 毅，劉 勝，羅 亮，胡博尊，羅 柱，戴林建

（1.株洲煙草公司茶陵分公司，湖南 茶陵 412400；2.湖南農業大學，湖南 長沙 410128）

自1967 年，Bourgin 和Nitsch 成功利用煙草花藥得到單倍體植株以來，國內外開展了許多對煙草花藥培養的研究工作，不斷優化培養過程[1-2]?；ㄋ幣囵B的誘導頻率受多個因素的影響，如基因型、培養條件、花粉發育時期、培養基等[3-6]。陳春艷等[7]認為4℃低溫預處理48 h 能顯著提高花藥胚狀體的誘導率。賈永炯[8]的研究發現在含0.4～0.8 mg/L 2,4-D 的Nitsch培養基上胚狀體發生頻率有所提高。李春玲等[9]與王立浩等[10]考察了不同碳源及其濃度對花藥胚狀體誘導的影響，結果發現，3%的蔗糖對花藥的誘導率最高。劉仁祥等[11]對活性炭、大量元素與微量元素之間的關系做了研究，發現活性炭能平衡大量元素和微量元素之間的關系，從而促進胚狀體的形成。

響應面法（Response surface methodology，RSM）是一種優化反應條件的有效方法，RSM 是數學方法和統計方法結合的產物，用于對受多個變量影響的問題進行建模和分析，其最終目的是優化響應值。RSM 最先應用于化學工業領域，后來隨著研究的深入和擴展，逐漸應用于生物學、醫學以及食品學領域[12-14]。響應面法能系統地優化反應條件，分析各因素間的互作效應。前人的試驗多是研究某單一因素對花藥誘導頻率的影響，并且關于采用響應面法優化煙草花藥培養的報道尚不多見。因此，筆者在前人研究的基礎上，以IAA、6-BA 以及大量元素濃度為考察對象，采用響應面法，試圖找到誘導煙草花藥胚狀體的最佳條件，為優化煙草花藥培養體系提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種為雜交品種♂凈葉黃×♀HKDN-5，其中HKDN-5 是由湖南農業大學農學院煙草專業戴林建副教授自育的高鉀烤煙材料。雜交組合于2019年3 月移栽至湖南農業大學耘園基地，采用常規田間管理方法，2019 年5 月下旬開始現蕾。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌材料獲得 晴天摘取花冠與花萼等長或花冠微微露出的花蕾（此時花藥中的小孢子處于單核靠邊期），4℃冰箱中預處理一定天數后，將花蕾放入超凈臺進行消毒。消毒步驟：無菌水沖洗2 次；75%酒精漂洗30 s，無菌水沖洗3 次；20%次氯酸鈉和少量吐溫20 浸泡15 min，無菌水漂洗4 次；置于無菌濾紙上除濕。用已消毒的鑷子撥開花冠，小心取出花藥，接種于培養皿中。

1.2.2 大量元素濃度與外源激素添加量對花藥胚狀體誘導的影響 為了優化煙草花藥胚狀體誘導的培養基體系，在前期預試驗基礎上，根據Box-Behnken 中心組合設計對IAA 濃度（A）、6-BA 濃度（B）、大量元素濃度（C）各取3 個水平進行響應面設計。大量元素的濃度以MS 培養基的濃度來體現，設1/4MS，1/2MS和MS這3種基本培養基，外源激素IAA與6-BA分別設0.1、0.5、1 mg/L 這3 個濃度梯度；共有17 個組合（表1），每個組合重復3 次取平均值，若產生污染，則重新接種以保持每個組合均有3 個重復。在基本培養基中加入3%的蔗糖、0.7%瓊脂，pH 值調至5.8。暗培養一周后移入光照條件下培養，在上述條件下培養45 d 后統計花藥胚狀體及愈傷組織的誘導率。

1.2.3 誘導力的測定 花藥接種后3 d 觀察其污染情況，及時清除污染的培養皿，培養45 d 調查花藥胚狀體與愈傷組織的誘導率。

1.3 統計分析

以IAA（A）、6-BA（B）、MS 濃度（C）3 個因素作為變量，以胚狀體誘導率（Y1）、愈傷組織誘導率（Y2）作為響應量，數據通過design-expert 8.0.6.1軟件處理分析并繪圖。

2 結果與分析

2.1 煙草花藥胚狀體誘導條件的優化

2.1.1 試驗結果回歸分析 對表1 的試驗數據進行多元回歸擬合，得到花藥胚狀體誘導率（Y1）對 IAA濃度（A）、6-BA 濃度（B）和大量元素濃度（C）的二次多項回歸方程模型：Y1=-6.633 72+88.919 79 A1+46.261 79 B1+50.376 26 C1-18.604 15 A1B1+26.264 18 A1C1-2.252 19 B1C1-95.993 52 A12-37.075 73 B12-55.719 37。愈傷組織誘導率（Y2）對A、B 和C 的二次多項回歸方程模型：Y2=-31.531 47+35.988 44 A1+59.713 87 B1+78.585 74 C1+42.389 21 A1B1+27.745 66 A1C1-7.013 49 B1C1-46.429 03 A12-59.566 47 B12-67.576 11 C12。

由表2 和表3 可知，無論是以Y1還是Y2作為響應量，模型都呈極顯著（P ＜0.01），僅有0.1%與0.29%的可能性是由未知因素對試驗結果造成干擾。這說明模型與實際情況擬合較好，可用于分析花藥胚狀體和愈傷組織的誘導情況。由表2 可知，一次項A、B 和C 均達顯著水平（P ＜0.05），二次項 A2、B2和 C2均達極顯著水平，說明IAA 與6-BA 及大量元素的濃度對煙草花藥胚狀體的誘導均有顯著影響；2 種激素濃度交互項差異顯著，說明這2 個因素的交互作用亦會對胚狀體的誘導產生顯著影響。除此之外，IAA 與大量元素濃度間也存在互作效應，二者的交互項差異也達顯著水平。分析表3 可得，對煙草花藥愈傷組織誘導而言，IAA 與6-BA 的濃度對其有顯著影響；而大量元素濃度對愈傷組織誘導的影響則沒有前二者顯著，IAA 與6-BA 交互項差異顯著，說明這2 個因素的交互作用亦對愈傷組織誘導有顯著影響。

表2 胚狀體誘導（Y1）回歸方程模型的方差分析結果

2.1.2 響應面分析 由多元回歸方程所作響應面曲線圖及等高線圖可以直觀地反映IAA、6-BA 和大量元素的濃度（MS 濃度）對煙草花藥胚狀體與愈傷組織誘導的影響。由圖1～6 可知，IAA 的濃度對胚狀體和愈傷組織誘導的影響最顯著，曲線面最陡；6-BA 濃度和大量元素濃度對胚狀體和愈傷組織誘導的影響較小，曲線面趨于平緩；在以胚狀體誘導率為響應量的分析中，各因素所選范圍內均存在極值點；在愈傷 組織誘導率為響應量的分析中，IAA 的濃度仍有上升空間。

表3 愈傷組織誘導（Y2）回歸方程模型的方差分析結果

2.3 驗證試驗

為了進一步驗證該模型及測定結果的可靠性，設定胚狀體誘導率盡可能大，對方程篩選出的最優條件（0.49 mg/L IAA+0.48 mg/L 6-BA+0.56 MS，此條件下胚狀體誘導率的預測值為40.52%）進行10 次試驗，煙草花藥胚狀體誘導率的平均值為36.80%，與預測值僅相差3.72 個百分點，說明該模型較為可靠。

圖1 IAA 濃度和6-BA 濃度對胚狀體誘導影響的響應面圖與等高線

圖2 IAA 濃度和MS 濃度對胚狀體誘導影響的響應面圖與等高線

圖3 6-BA 濃度和MS 濃度對胚狀體誘導影響的響應面圖與等高線

圖4 IAA 濃度和6-BA 濃度對愈傷組織誘導影響的響應面圖與等高線

圖5 IAA 濃度和MS 濃度對愈傷組織誘導影響的響應面圖與等高線

圖6 6-BA 濃度和MS 濃度對愈傷組織誘導影響的響應面圖與等高線

3 討 論

對于培養條件的優化，傳統常用的方法有單因素試驗法與正交試驗法。單因素試驗常用于確定某個因素的使用范圍，方法簡單，結果明了，也是其他試驗設計的基礎，但采用此種試驗方式容易忽略組分間的交互作用，導致最適宜條件丟失[15]。正交試驗法雖研究多因素、多水平的組合，但只能對一個個孤立的試驗點進行分析，并不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間一個明確的函數表達式。而該研究采用的響應面法在單因素試驗的基礎上，通過多元二次回歸模型擬合各因素與響應值之間的關系，具有試驗次數少、回歸方程精度高等特點，同時能克服正交試驗只能處理離散水平值，而無法找出最佳組合和響應值的缺陷[16-17]。

利用響應面法能精確分析幾個因素之間是否對花藥胚狀體的誘導具有互作效應。該研究結果表明，試驗選取的3 個因素的確對煙草花藥胚狀體誘導有顯著影響。其中，IAA 和6-BA 這2 種激素的濃度對胚狀體誘導的影響尤為顯著，且2 種激素間存在互作關系，同時互作關系對胚狀體與愈傷組織誘導的影響也能達到顯著水平。

關于胚狀體誘導率預測值與實測值之間相差3.72個百分點的情況，可能是由于煙草為無限花序，采集的花藥小孢子處于單核靠邊期，但不同開花時期（如現蕾期和盛花期）花藥小孢子的活力可能有所差別[18]，導致驗證試驗結果低于預測值。不過，實際值與預測值之間的差異并不大，且誘導率水平均較高，因此總的來講該模型可用于煙草花藥胚狀體誘導進行回歸分析和參數優化。

4 結 論

試驗通過響應面法得到IAA 濃度、6-BA 濃度、大量元素濃度三者對煙草花藥胚狀體誘導率與愈傷組織誘導率的二次多項回歸方程模型，方差分析結果顯示該方程能很好地解釋花藥胚狀體誘導率隨各參數變化的規律。

優化后的最佳條件為0.49 mg/L IAA+0.48 mg/L 6-BA+0.56 MS，胚狀體的誘導率為36.80%。為了便于實際操作，可采取0.50 mg/LIAA+0.50 mg/L 6-BA+1/2 MS 的條件進行試驗。