腸外營養(yǎng)混合液中維生素C 含量測定的研究

穆殿平，解曉帥，張鳳瑩，許煜靜，楊金榮*

（1.天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192；2.天津醫(yī)科大學藥學院，天津 300070）

維生素C（vitamin C，Vc）參與體內多種代謝過程，可增加肌體抵抗能力，促進膠原合成，具有抗病毒及抗癌作用［1，2］。近年來研究表明，Vc 在對抗膿毒血癥發(fā)揮一定療效［3］。根據(jù)臨床需要，Vc 常加入腸外營養(yǎng)混合液（TNA）中，為不能耐受腸內營養(yǎng)或消化道受損患者提供腸外營養(yǎng)治療［4］。有報道，腸外營養(yǎng)添加大劑量Vc對急性重癥創(chuàng)傷患者較好的治療效果［5］。然而，由于TNA 處方組分多，不同物質混合可能使其物理及化學性質發(fā)生變化，有可能降低TNA 混合液的安全性及穩(wěn)定性［6，7］，尤其是Vc 含有烯二醇結構易被氧化變色，甚至失效［8］。因此，測定TNA 中Vc 的含量變化是非常可靠的考查其有效性的指標，文獻中關于Vc 含量測定方法報道較多，但多為單一組分或簡單配伍條件，且重復性較差。本研究旨在建立操作簡便、適用性廣、重現(xiàn)性好、結果準確的高效液相色譜法（HPLC），用于測定TNA混合液中Vc 注射液含量，確保臨床TNA 治療的安全性和有效性。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；十萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器）；Photoelectron TECHNOLOGY 色譜柱恒溫箱；AP-9901S 真空泵（天津蘭博實驗儀器）。

1.2 試劑 維生素C 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100425-201504；規(guī)格：100 mg/支；純度：100.0%）；維生素C 注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號1809301；規(guī)格：0.5 g/5 ml）；甲醇和乙腈（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）；其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Zirchrom Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：0.34%（w/v）磷酸二氫鉀-氫氧化四丁基銨-乙腈（92.5∶2.5∶5，v/v/v，pH 3.0）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取0.500 g 維生素C 對照品，用流動相溶解并定容至100 ml，得濃度5 mg/ml 的Vc 對照品儲備液，搖勻，冷藏、避光保存。

2.2.2 TNA 處方設計 根據(jù)普通成人及住院患者對Vc 的日需求量設計實驗中TNA 處方。處方中具體各成分配比見表1。處方0（0 組）為陰性對照組不添加Vc 注射液，其余三組Vc 的含量分別為0.735、1.46 和2.88 mg/ml。四組供試溶液均在局部百級的水平層流臺由專業(yè)人員按照《靜脈用藥集中調配質量管理規(guī)范》中相關操作規(guī)程規(guī)范配制，灌裝在1 L 營養(yǎng)袋中，室溫、避光的條件下放置待測。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品儲備液15 ml，置100 ml 量瓶中，加入流動相最終配制成含Vc 對照品0.75 mg/ml 的對照品溶液。取處方0（陰性對照組）溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，加入對照品儲備液15 ml，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為樣品對照溶液；取處方1 溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液；取處方0 溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為陰性對照液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，HPLC 色譜圖見圖1。維生素C 色譜峰保留時間為5.5 min，與相鄰峰分離度良好。維生素C 色譜峰位置處無相關干擾，結果表明專屬性良好。

圖1 對照品（A）樣品對照（B）處方1 供試品（C）陰性對照（D）HPLC 色譜圖

2.4 標準曲線的制備 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 和12.0 ml 至100 ml 的棕色量瓶中，加入流動相溶液稀釋至刻度，避光。按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，以各個濃度的維生素C 對照品峰面積（Y）對相應的濃度（X）進行線性回歸，得到標準曲線方程式為：Y=27 105X-10 325（r=0.999 8），維生素C 在50～600 μg/ml 濃度范圍內呈線性關系。

2.5 精密度試驗 精密量取處方1 溶液50 ml，置100 ml 棕色量瓶中，用流動相稀釋至刻度，充分混勻，避光，作為供試品溶液。精密量取上述供試品溶液20 μl，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，結果RSD 為0.96%。

2.6 重復性試驗 精密量取處方1 溶液50 ml，置100 ml棕色量瓶中，用流動相稀釋至刻度，充分混勻，避光，作為供試品溶液。同法配制6 份，各取上述供試品溶液20 μl 進樣，按照“2.1”項下色譜條件進行含量測定，計算含量RSD 來考查試驗的重復性，結果RSD 為1.78%。

2.7 回收率試驗 取處方0 溶液，精密量取9 份，每份50 ml，置100 ml 棕色量瓶中，分別精密加入5 mg/ml 的維生素C 對照品儲備液5.0（低濃度）、7.5（中濃度）和10.0 m（l高濃度）3 個濃度，流動相稀釋至刻度，每個濃度配制3 份，峰面積取平均值計算回收率。按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率和RSD，結果平均回收率為99.23%，RSD 為1.06%。見表2。

表2 回收率試驗結果（n=9）

2.8 樣品溶液的含量測定 根據(jù)方法學中考查的Vc濃度的線性范圍，處方1、處方2 和處方3 分別精密吸取50.0、25.0 和12.5 ml，置100 ml 的量瓶中，用流動相稀釋至刻度，充分混勻，避光備用。按照“2.1”項下色譜條件進行含量測定。結果處方1、處方2 和處方3 平均含量分別為0.74、1.46 和2.88 mg/ml，見表3。

表3 不同處方Vc 樣品溶液含量測定結果（n=3）

2.9 TNA 溶液的穩(wěn)定性 處方1、處方2、處方3 分別在0、4、8、12 和24 h 時取樣，按照“2.1”項下色譜條件分別對處方1、處方2、處方3 溶液進行測定，記錄峰面積，以每組0 h 時Vc 濃度對應的峰面積為100%，計算每組其他時間點Vc 的相對百分含量。結果見表4。

表4 含不同濃度維生素C的TNA 溶液隨放置時間的相對含量

3 討論

3.1 方法學討論

3.1.1 檢測波長的確定 用紫外分光光度計在200 ～800 nm 對維生素C 進行掃描，在波長210 nm 處有最大吸收，故測定波長選擇210 nm。

3.1.2 流動相的選擇 本試驗中樣品液為多種組分的TNA 混合液，并且多種物質均有紫外吸收峰，極性與維生素C 相似，很可能干擾維生素C 的含量測定。在早期預試驗中，探索正確的流動相時多以參考文獻［9］為主，結果不是出峰時間過早導致無法準確測定TNA 中維生素C 含量，就是無法很好分離多組分營養(yǎng)液中的維生素C 峰。經(jīng)過探索，發(fā)現(xiàn)以0.025 mol/L 磷酸二氫鉀與0.010 mol/L 四丁基氫氧化銨加入5%的乙腈作為流動相，維生素C 的保留時間在5 min 左右，并可以將相似極性的多種物質與維生素C 的吸收峰分開，峰形良好，不拖尾，分離的大于1.5。

3.1.3 流動相pH 值的確定 由于維生素C 不穩(wěn)定，具有較強的還原性，易氧化，故其注射劑均添加一定量的抗氧劑來確保其穩(wěn)定性。根據(jù)其在酸性介質中氧化的速度減慢或生成單鈉鹽而不致發(fā)生水解［10］，確定流動相應呈偏酸性。當流動相pH 值調為2.0 時，維生素C主峰拖尾嚴重，而嘗試流動相pH 值調節(jié)至3.5 時，出現(xiàn)峰形重疊的情況，經(jīng)過反復探索，調節(jié)流動相pH 值為3 時能很好分開極性相似的幾個峰，并確保了維生素C 水溶液的穩(wěn)定。有文獻報道［11］，當pH 值大于5 時，會導致維生素C 的降解加速，并隨著pH 值越來越高，維生素C 降解反應越快。因此，流動相pH 值確定為3.0。

3.2 樣品液含量測定 試驗數(shù)據(jù)（表4）顯示，各組TNA中Vc 含量隨放置時間的延長逐漸下降。1 組和2組分別在放置4 和8 h 后相對含量已經(jīng)減少到90%以下，根據(jù)《中國藥典》2015 版規(guī)定，即為失去療效。3組在放置12 h 時，含量僅下降了5.9%；提示TNA 中加入濃度越高的Vc 注射液，其含量下降越慢，可能與Vc 注射液中抗氧劑濃度有關；同時也為進一步研究TNA 中是否可以加入適宜濃度的Vc 注射液奠定了基礎。

3.3 其他影響因素 由于維生素C 具有光敏感性，遇空氣中的氧氣易氧化分解［11］，故本試驗全程保持避光條件，將配好的樣品液及試劑密閉保存，避免與外界的空氣長時間的接觸。由于樣品液為多種注射劑調配而得，而各種注射劑都有相應規(guī)格的裝量差異，會導致配制的TNA 實際體積與理論體積有所差異。因此在本試驗中，樣品溶液不同時間的維生素C 含量均以0 h 時測定濃度做比值，計算相對含量，從而排除偶然誤差。

4 結論

本文建立了測定腸外營養(yǎng)混合液中Vc 含量的高效液相色譜法，該方法操作簡單，快速準確，且分離度和重復性均較好，可用于考查TNA 中Vc 注射液的含量變化。近些年，關于TNA 中加入Vc 注射液穩(wěn)定性和安全性國內外研究報道較少，該方法的建立可以說為進一步深入研究Vc 注射液加入TNA 中不同濃度，不同配伍的含量變化奠定了基礎，同時也為臨床腸外營養(yǎng)應用更加安全、有效提供了很好的藥學研究路徑。