ASK1在腎臟相關疾病中的研究進展

汪姝婷，唐金城，李穎，馮江超

(川北醫學院附屬醫院腎內科，四川 南充 637000)

腎臟疾病是臨床常見疾病，早期有一定的隱匿性，未經治療的腎臟疾病大多轉化為慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)。國際腎臟病學會腎臟病數據中心的調查顯示，普通人群CKD的患病率為14.3%[1]；而我國橫斷面研究顯示，18歲以上人群CKD的患病率達10.8%[2]。無論何種潛在病因，CKD均會緩慢進展，并導致不可逆的腎單位丟失、終末期腎臟病和(或)過早死亡。導致CKD進展的因素包括實質細胞損失、慢性炎癥、纖維化以及腎臟再生能力降低[3]，當前療法有效性局限且僅能延緩疾病進展，因此迫切需要開發針對腎臟疾病的新療法和早期識別腎臟損傷的診斷技術以停止或逆轉腎臟疾病進展。凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal regulated kinase 1，ASK1)具有在生理條件下誘導細胞凋亡的潛力，并通過其他機制在糖尿病、肝臟疾病、癌癥、腦卒中、自身免疫性疾病、心血管系統、中樞神經系統疾病中發揮重要作用[4-8]。隨著研究的深入發現，ASK1在多種腎臟疾病中有顯著作用。現就ASK1在腎臟相關疾病中的研究進展進行綜述，旨在為腎臟疾病的臨床診斷及治療提供新思路。

1 ASK1的基本結構與功能

1.1ASK1的基本結構 促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯是多種級聯中跨物種保守的信號系統，MAPK級聯包含三個等級的蛋白激酶：MAPK、促分裂原活化的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)和促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)。MAPKKK磷酸化并激活MAPKK，然后激活MAPK，活化的MAPK磷酸化多種底物包括轉錄因子，并調節細胞反應。胞外信號調節激酶、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK是主要的MAPK家族成員[9]。目前有24個已表征的MAPKKK(MAPKKK1～21以及RAF1、BRAF和ARAF)，其中大多數由正常腎臟表達[10]。

ASK1是一種MAPKKK，是一條由約1 000個氨基酸組成的多肽鏈，激酶結構域及其兩端的N端盤管結構域和C端盤管結構域構成其主體[11]。ASK1的N端盤管結構域包含硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)和腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)的特異性結合區域[12]。在正常生理條件下，ASK1通過與還原形式的TRX結合維持非活性狀態[13]。TRAF是一種重要的銜接蛋白，對ASK1下游信號有正向調節作用，在氧化應激情況下與解離的TRX結合發揮作用[14]。目前對于C端盤管結構域的研究尚不深入，其包含的支架蛋白14-3-3可與激酶結構域相互作用并影響其構象變化，其機制類似于TRX[15]。

1.2ASK1的功能及其抑制劑 ASK1蛋白激酶級聯通路主要通過響應氧化應激激活鈣超載、內質網應激、感染以及受體介導的炎癥信號，脂多糖和腫瘤壞死因子等也可誘導ASK1信號轉導[16]。TRX激活后從N端解離形成ASK1信號體，同時蘇氨酸殘基磷酸化，下游底物MAPKK被激活，隨后MAPK激活，包括JNK家族的MAPKK4/MAPKK1途徑和p38 MAPKK3/MAPKK6途徑[17]。以上通路被激活后可誘導細胞凋亡、促進炎癥反應及纖維化信號轉導[18]。在腎臟中，此通路可調節與腎臟疾病相關的關鍵過程，如細胞存活、死亡、分化和增殖[19]，JNK和p38 MAPK的激活在腎臟浸潤細胞和固有細胞中尤為明顯，包括足細胞、腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞和成纖維細胞[20-23]。腎小球中p38的激活與局灶節段性增生性病變相關，而間質中p38的激活與間質炎癥和纖維化相關[23]。腎小管間質區JNK信號通路與巨噬細胞浸潤、間質纖維化和腎功能不全相關[21-22]。

研究發現，ASK1缺陷型(ASK1-/-)小鼠可正常發育并維持正常的生理功能，表明ASK1信號通路只促進病理過程而不影響穩態功能[24]。在病理條件下，除腎臟疾病外，ASK1還參與心血管疾病、神經退行性疾病以及肝臟相關疾病的發生[25]。

2 ASK1與腎臟疾病發病機制

2.1ASK1與腎臟疾病中的氧化應激狀態 氧化應激是急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)過渡到CKD和CKD基礎上誘發AKI的重要危險因素[26]。在急性或慢性腎損傷期間，氧化應激產生的自由基和促氧化劑可能會進一步加快疾病進程，并在隨后并發癥的發生發展中發揮作用[27]。ASK1可因活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的解離、締合而受到動態調控，特別是以ROS依賴性方式與ASK1結合的分子在調節ASK1活性中起重要作用[28]，ROS誘導的氧化應激、異常蛋白質聚集誘導的內質網應激等最終均被整合到ASK1中，從而啟動JNK/p38激酶信號通路，進一步導致細胞死亡[29]。被刺激的ASK1信號體形成分子量明顯增加的復合物，其中包含ASK1的各種調節因子(TRAF2、TRAF6、蛋白磷酸酶5和泛素特異性蛋白酶9X)以響應ROS，銜接蛋白TRAF2和TRAF6被募集到ASK1信號體中，通過促進N端盤管結構域的同源相互作用正向調節ASK1的活性[13]。蛋白磷酸酶5以ROS依賴性方式使ASK1的活性磷酸化位點去磷酸化，并負向調節ASK1的活性[30]。此外，泛素特異性蛋白酶9X可通過去泛素化和穩定ASK1正調節ASK1活性[31]。

2.2ASK1與腎臟纖維化 腎纖維化是CKD發展到終末期腎臟病的常見病理過程。腎纖維化的細胞基礎包括肌成纖維細胞活化、細胞外基質成分過量產生以及炎癥細胞浸潤[32]。腎活組織檢查發現，在各類纖維化腎臟疾病患者中，ASK1下游信號通路p38和JNK活化水平在腎小球和腎小管間質中增加[20]。JNK信號轉導促進腎小管上皮細胞炎癥及纖維化病程，并促使間質表型的腎小管細胞去分化，JNK途徑還與其他促纖維化途徑相互作用，如JNK可以直接磷酸化信號轉導蛋白同源物3，以增強促纖維化分子的轉錄[33]，但目前JNK在腎成纖維細胞中的作用機制尚不清楚。

ASK1抑制劑在抗肝纖維化中顯示出良好的效果[34]。ASK1-/-腎纖維化小鼠中p38活化程度明顯降低，且腎臟中腎膠原(羥脯氨酸)含量也顯著減少[35]。ASK1通路在纖維化過程中起重要作用，ASK1抑制劑可阻止腎纖維化進展，甚至誘導纖維化消退。

3 ASK1與AKI

3.1ASK1與新月體腎炎 新月體腎小球腎炎又稱快速進展性腎小球腎炎，有超過50%的腎小球發生毛細血管外增殖，可迅速發展為晚期腎病綜合征[36]。ASK1抑制劑可通過減少人新月體腎小球腎炎中p38 MAPK/JNK的活化延緩腎損傷進展。在腎毒素血清導致的新月體腎病大鼠模型中，ASK1抑制劑處理后p38和JNK活化顯著降低，腎組織中新月體的形成及蛋白尿減少，巨噬細胞活化及T細胞浸潤度降低，腎纖維化改善[37]。抗基膜性腎炎屬于Ⅰ型新月體腎小球腎炎，通過對抗基膜性腎炎小鼠進行研究發現，五肽化合物PLNPK(Pro-Leu-Asn-Pro-Lys)也可通過抑制大鼠腎小球系膜細胞中p38 MAPK的磷酸化抑制腎小球系膜細胞活化,減少腎小球內巨噬細胞聚集，從而減輕腎組織的損傷程度[38]。可見，ASK1抑制劑可能在新月體腎小球腎炎中具有治療潛力。

3.2ASK1與腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI) IRI是指器官經歷短暫的血流供應減少或停止后重新建立灌注時觸發的炎癥損傷。在臨床環境中，IRI會導致嚴重的AKI，發病率和病死率均較高[39]。缺血再灌注期間腎組織損傷由膜脂質過氧化、蛋白質和DNA的氧化損傷導致。研究發現，抗氧化劑防御機制的增強對腎組織有保護作用[40]，其保護作用可能通過抑制ASK1信號通路完成。Wang等[41]的研究發現，提前給予抗氧化劑亞硒酸鹽的小鼠腎臟缺血3 h后ASK1、p38的磷酸化顯著減少，從而保護腎小管上皮細胞免受IRI誘導的細胞凋亡損傷。

Terada等[42]發現，IRI后ASK1-/-小鼠JNK和p38 MAPK的磷酸化減少，凋亡細胞及浸潤的白細胞數量減少，血尿素氮和血清肌酐水平明顯低于ASK1表型正常的小鼠，而ASK1表型正常小鼠腎臟組織學表現出更大程度的腎小管壞死和降解。以上結果表明，ASK1在IRI誘導的AKI中被激活，而ASK1阻滯可減弱腎小管凋亡及腎功能損傷。此外，國內利用蛋白酪氨酸磷酸酶1失活突變小鼠構建腎IRI模型的研究發現，蛋白酪氨酸磷酸酶1通過作用于ASK1實現對腎IRI的保護作用[43]。綜上，抑制ASK1可對抗腎IRI，其保護作用可能通過抑制細胞凋亡和氧化應激實現。

3.3ASK1與造影劑腎病(contrast-induced nephropathy，CIN) CIN指給予對比劑48～72 h內出現的腎功能損害(血清肌酐較基線值增加25%或絕對血清肌酐增加0.005 g/L)，目前已成為醫院獲得性AKI的主要原因。CIN的病理機制復雜，包括腎內血管收縮導致髓質缺氧、ROS的產生以及直接的腎小管毒性[44-45]。有學者推測，CIN相關的ASK1途徑活化可能由ROS產生而誘發，新型N-乙酰半胱氨酸酰胺可通過抗氧化活性和上調TRX1有效抑制ASK1途徑的活化，從而保護腎功能[46]。體外實驗也表明，用ASK1下游底物抑制劑(JNK抑制劑、p38抑制劑)預處理腎細胞可明顯減弱造影劑誘導的腎細胞凋亡[47]。

可見，造影劑誘發的氧化應激反應可以激活ASK1信號轉導通路，從而造成腎損傷，故抑制ASK1信號通路可能是CIN的治療靶點，但目前尚無ASK1抑制劑在CIN中發揮作用的直接證據，需要進行大規模動物實驗和隨機臨床試驗，以確定抑制ASK1預防CIN的有效性，從而早期識別、正確調整用藥劑量并及時對高危患者進行干預。

4 ASK1與CKD

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)是一種糖尿病微血管并發癥相關的CKD，也是腎功能衰竭的主要原因[48]。氧化應激、晚期糖基化終末產物形成、細胞信號轉導和更新以及纖維化等是DKD病理生理的關鍵[49]。DKD患者體內的ASK1一旦被炎癥和氧化應激激活會導致腎纖維化并促進DKD進程[50]。內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)功能障礙與人類DKD有關，eNOS缺陷型(eNOS-/-)小鼠對腎臟損害的敏感性增強，其與遺傳性肥胖的瘦素受體缺陷型(db/db)小鼠雜交后代(db/db eNOS-/-)可強有力地模擬2型DKD[45]。每日給予ASK1抑制劑GS-444217治療可減少db/db eNOS-/-小鼠的腎小球瘢痕形成、足細胞死亡和腎纖維化，防止腎小球濾過改變和蛋白尿形成[45]。Tesch等[50]在鏈脲佐菌素注射誘發的糖尿病小鼠的研究發現，GS-444217治療可減少促炎分子信使RNA及腎小管損傷標志物腎損傷分子-1的表達。研究還顯示，早期和晚期干預對糖尿病小鼠的病情均有益[50]。證明GS-444217在DKD中有較大的治療窗口，為預防DKD進展提供了新的治療策略。

腎纖維化是CKD的典型標志。單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)是構建進行性腎小管間質纖維化的方法。手術后第7天，與野生型小鼠相比，ASK1-/-UUO小鼠腎小管細胞凋亡、間質巨噬細胞蓄積和間質纖維化程度明顯降低，可能與p38 MAPK和JNK激活減少有關[35]。另外，UUO手術前1 h開始服用GS-444217，亦可阻止p38 MAPK活化，并使JNK活化程度降低60%，且腎組織的纖維化及腎小管細胞凋亡情況與ASK1-/-小鼠相似[18]。以上研究表明，UUO模型中GS-444217提供的腎保護作用與ASK1缺乏癥的影響非常相似。腎切除術模擬的CKD是基于腎單位不足和高血壓原理的手術模型。Liles等[18]采用此種模型進行研究發現，GS-444217干預可防止蛋白尿進一步增加，并減緩腎小球硬化進展，而聯用依那普利可進一步抑制蛋白尿并顯著降低腎小球硬化程度，這一發現為在CKD的治療中使用ASK1抑制劑作為血管緊張素轉換酶抑制劑的輔助療法提供了支持。由此可見，ASK1抑制劑和ASK1缺陷均通過阻斷CKD小鼠體內ASK1信號通路發揮作用，這為阻止CKD進展、延長CKD患者生命帶來希望。

5 ASK1與心腎綜合征

心腎綜合征(cardiorenal syndrome，CRS)是由一個器官的功能障礙導致另一器官急性或慢性功能障礙，病變涉及心臟、腎臟和血管系統等，CRS的發病率和病死率高，且病理機制復雜，涉及神經激素、炎癥過程、氧化應激和代謝紊亂間的相互作用[51-52]。抑制ASK1可能有助于減輕CRS，延緩疾病發作。據報道，ASK1可促進與年齡相關的心血管疾病中的氧化應激和炎癥反應，而其下游信號通路p38 MAPK的過度激活是心臟和腎臟疾病的共同特征[53-54]。

尿毒癥毒素的累積是腎排泄功能受損的標志，且尿毒癥毒素的心臟毒性是CRS的驅動因素[55]。透析患者尿毒癥毒素硫酸吲哚酚硫酸鹽和對甲酚硫酸鹽水平明顯升高，并能夠與白蛋白結合，從而形成無法通過透析膜孔的大蛋白復合物[56-57]。有研究顯示，ASK1抑制劑可減輕由硫酸吲哚酚硫酸鹽和對甲酚硫酸鹽引起的心臟肥大和心腎纖維化，認為ASK1抑制劑可能有助于延緩尿毒癥毒素介導的CRS進展[58]。

組胺可能是通過靶向ASK1/MAPK信號通路，改善CRS大鼠的心腎功能并減輕心臟和腎臟的纖維化。在冠狀動脈左前降支結扎結合5/6次全腎切除術誘發的2型CRS大鼠模型中，組胺可明顯抑制CRS大鼠心臟和腎組織中磷酸化的ASK1和MAPK，并降低血清肌酐、血尿素氮和腦利鈉肽水平，改善左心室重構和收縮功能[59]。

6 ASK1抑制劑在腎臟疾病中的治療潛力

ASK1抑制劑在多發性硬化癥、接觸性超敏反應、腫瘤生長、對乙酰氨基酚肝毒性等動物模型中具有治療作用[25]，近來其在部分腎病模型及臨床試驗中也顯示出治療潛力。GS-444217是一種口服ATP競爭性ASK1抑制劑，對ASK1具有高度選擇性[18]，被應用于多種腎臟疾病的臨床前研究。GS-44217處理可預防eNOS-/-糖尿病小鼠腎臟p38 MAPK的活化，早期(2～8周)干預可減少腎小球硬化和腎功能丟失，而晚期(8～5周)干預可阻止腎小球硬化發展、腎臟炎癥和腎小管損傷，并改善腎功能[50]。GS-44217治療效果與p38 MAPK或JNK抑制劑的治療效果相當，但無p38 MAPK和JNK抑制劑相關的不良反應[18,37]。另一種ASK1抑制劑NQDI-1也表現出良好療效，提前給予NQDI-1的腎缺血大鼠可避免腎臟氧化應激、腎小管細胞凋亡、腎功能喪失和組織學損害[60]，表明使用ASK1抑制劑進行預防性治療可保護腎臟免受 IRI。

以上研究為藥物研發提供了依據。2016年，吉利德公司評估了選擇性ASK1抑制劑塞洛塞替尼對2型糖尿病和難治性中度至重度DKD的安全性和有效性，表明塞洛塞替尼可減慢DKD的進展，但由于未預期的混雜因素(如塞洛塞替尼介導的肌酐分泌抑制)，該試驗未達到終點[61]。目前正在進行塞洛塞替尼的Ⅲ期臨床試驗，以評估其在延緩DKD腎功能下降、降低腎功能衰竭風險或全因死亡率方面的確切療效。

ASK1抑制劑可能有助于腎臟疾病治療，但ASK1抑制劑會抑制p38 MAPK和JNK的激活，因此需要謹慎看待其可能產生的副作用。一項針對結腸炎模型的研究表明，Ask1-/-小鼠骨髓巨噬細胞對引起結腸炎的細菌的滅活能力降低，導致腸道炎癥的發生率增加[62]。因此需要對使用ASK1抑制劑的研究對象進行持續觀察，以評估遠期安全性和有效性。

7 展 望

ASK1在多種腎臟疾病模型中表現出顯著的保護作用；此外，ASK1作為腎臟疾病的新靶點還具有一定的預測性，其基線水平升高在腎臟疾病患者出現蛋白尿或腎功能下降前就已經表現出來，可能成為未來研究的重點。但目前ASK1在腎臟疾病中的研究較為局限，未來需要擴展ASK1在其他類型腎臟疾病中的作用，如感染引起的腎臟疾病(腎盂腎炎等)以及自身免疫性疾病引起的腎臟疾病(狼瘡性腎炎等)，從而為腎臟疾病的早期診斷、預后評估以及靶向治療提供新思路。