豬ALAS1基因的多態性與產仔數性狀的關聯分析

劉林清，李慶崗，蘇世廣，周 梅，張 威，王重龍

（安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，豬分子數量遺傳學安徽省農業科學院重點實驗室，畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031）

ALAS1基因，一個吡哆醛5'磷酸（PLP）限速酶，它屬于α-氧基胺合成酶家族。ALAS1基因參與血紅素生物合成的第一步反應，并且對血紅素的合成起到限速酶的作用，以維持細胞內血紅素的水平[1]。有研究發現，在ALAS1基因的5'側翼序列存在兩個cAMP應答元件（CRE）識別序列，cAMP調節信號轉導通路在卵巢卵泡發育和黃體化過程中起到主要作用，并可誘導ALAS1基因的表達[2]。還有研究者們發現，ALAS1基因還在卵巢中參與調節與排卵過程有關的線粒體細胞色素P450和類固醇代謝及類固醇激素的產生[3-6]。此外，Lawrence等[7]在小鼠卵巢中注射HCG（人絨毛膜促性腺激素）0～39 h后發現，ALAS1基因在早期排卵過程中在卵泡組織中上調表達，并且可能參與卵泡黃體化過程。這些研究結果進一步暗示了ALAS1基因在卵巢卵泡發育及排卵過程后都發揮著作用。

為此，本研究建立了ALAS1基因的PCR-MspIRFLP分型技術，并在3個中外豬種中進行多態性分型，還在兩個豬群中檢測該位點的多態性并與產仔數性狀進行關聯分析，以期為提高豬產仔數提供一個有用的分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及組織采集 試驗地點在安徽省科鑫養豬育種有限公司；試驗動物：于2014年7月采集58頭淮豬、75頭長白豬及85頭淮豬新品系Ⅱ系豬的耳組織放置于75%酒精的離心管中，-20 ℃保存備用；飼養管理條件和飼糧營養水平一致。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚-氯仿抽提法，TE溶解，-20 ℃冷凍保存。

1.2.2 引物的設計與合成 根據ALAS1基因DNA序列，應用Premier 5.0軟件在多態位點（第9內含子）兩側，設計1對引物，突變位點可用限制性內切酶MspI識別，引物由上海生工生物公司合成。引物信息如下：ALAS1基因的上游引物：5'-CACACCCCGCAGATGATGAC-3'，下游引物：5'-AAATAGAAGTGCAGAGCCCAGC-3'，片段長度為359 bp，退火溫度為62.5 ℃。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系為25 μL，其中PCR×2Taqmix 12.5 μL，10 mmol/μL的引物各0.5 μL，DNA模板1 μL（DNA約100 ng），加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為第1步95 ℃變性5 min；第2步95 ℃變性45 s；第3步62.5 ℃復性40 s；第4步72 ℃延伸45 s；重復第2至第4步35個循環，之后再72 ℃延伸10 min，最后降溫至4 ℃保存。PCR擴增產物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統中觀察，可見到片段大小為359 bp的清晰條帶。

1.2.4 限制性內切酶酶切（RFLP）ALAS1基因的PCR產物用MspI內切酶酶切，反應體系為：10×Buffer 1 μL，MspI酶0.20 μL（20 U/μL），加PCR產物至10 μL；37 ℃反應8～12 h；然后，酶切產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統中觀察。

1.3 數據處理分析

1.3.1 統計分析的軟件 采用SAS 8.0統計軟件（SAS Institute Inc, Version 8 Edition）的GLM程序進行標記方差分析，并進行顯著性檢驗。

1.3.2 基因效應統計分析模型 依據Liu等[8]所述方法建立的單標記回歸統計模型，除了豬個體為隨機效應以外，其他因素均為固定效應。所采用模型如下：Y=平均值+基因型+胎次效應+殘差，其中Y為性狀表型值。

2 結果與分析

2.1 豬ALAS1基因的多態位點檢測

PCR擴增片段長度為359 bp，經檢測與預期結果一致（圖1），片段本身就存在一個MspI酶切位點，經MspI酶切后產生3種基因型（圖2）。當多態位點為CC基因型時，則造成了2個MspI酶切位點，PCR產物經MspI消化后產生3個片段（277 bp+35 bp+47 bp），記為等位基因C；當多態位點為TT基因型時，則一個酶切位點消失，PCR產物經MspI消化后產生1個片段（324 bp+35 bp），記作等位基因T。

2.2 豬ALAS1基因在不同豬群體中的基因型和等位基因的頻率分布

由表1可見，ALAS1基因MspI酶切位點在所檢測的3個豬群中，國內地方品種淮豬豬群中C等位基因占優勢，而從國外引進的長白豬和自主培育的淮豬新品系Ⅱ豬群中T等位基因頻率較高。

表1 ALAS1基因PCR-MspI-RFLP基因型頻率和等位基因頻率分布

2.3 豬ALAS1基因MspI多態位點基因型與豬產仔數性狀的關聯分析

應用基因效應統計分析模型，采用SAS統計軟件的GLM程序分別在長白豬和淮豬新品系Ⅱ豬群體中進行豬ALAS1基因PCR-MspI-RFLP多態位點與產仔數性狀的關聯分析。

在長白豬和淮豬新品系Ⅱ豬群體中，所有胎次產仔數均呈現CC＞TC＞TT的趨勢，其中CC型個體和TC型個體的所有胎次產仔數分別顯著高于TT型個體（P＜0.05），詳見表2。統計結果顯示，CC型母豬具有較高的產仔數，C等位基因為優勢等位基因。

表2 ALAS1基因PCR-MspI-RFLP基因型與長白豬、淮豬新品系Ⅱ產仔數性狀的統計分析

3 討論

淮豬是我國地方豬種，具有生長速度慢、繁殖力高等特性。長白豬是引進的外來豬種，其具有生長速度快、繁殖力不高等特性。而淮豬新品系Ⅱ是以安徽省優良地方品種淮豬為母本，以國外優質瘦肉型品種長白豬、大白豬為父本，經過雜交育種組建基礎群，然后運用標記輔助選擇BLUP估計育種值進行群體繼代選育的。ALAS1基因，一個吡哆醛5'磷酸（PLP）限速酶，它屬于α-氧基胺合成酶家族。筆者前期采用RTPCR方法的分析豬ALAS1基因在用PMSG（孕馬血清促性腺激素）和HCG（人絨毛膜促性腺激素）處理卵巢顆粒細胞不同時間后的表達情況，結果表明，ALAS1基因在卵泡顆粒細胞生長、發育等過程中瞬時表達[9]，這與其他研究者的結果是一致的[7]。這些研究結果進一步顯示了ALAS1基因在卵巢卵泡發育及排卵過程后都發揮著作用。所以，我們選擇ALAS1基因作為研究豬產仔數性狀的候選基因。

本研究發現，ALAS1基因MspI酶切位點在所檢測的3個豬群中，國內地方品種淮豬豬群中C等位基因占優勢，而從國外引進的長白豬和自主培育的淮豬新品系Ⅱ豬群中T等位基因頻率較高。并且在長白豬和淮豬新品系Ⅱ豬群體中，所有胎次產仔數均呈現CC＞TC＞TT的趨勢。其中，CC型個體和TC型個體的所有胎次產仔數分別顯著高于TT型個體（P＜0.05），從以上結果表明，CC型母豬具有較高的產仔數，C等位基因為優勢等位基因。因此選擇CC型個體留種可提高群體的產仔數，在今后選育中可適當提高等位基因C的頻率。