變異鏈球菌生長受枯草芽孢桿菌抑制機制的代謝組學分析

徐 洋 晁文池 宋寶莉 高江力

1 甘肅省蘭州市中醫醫院 730000； 2 西北民族大學醫學部

齲病是一種重要的口腔疾病，其不但會對牙體硬組織進行慢性破壞，而且還是消化系統疾病、心血管疾病、過敏性紫癜等多種全身性疾病的危險因素，同時，齲病也是人群中發病率最高的疾病之一[1]。相關研究已證實細菌是齲病的主要致病因素，其中變異鏈球菌(Streptococcus mutans)由于可在口腔中通過產生多種代謝產物發酵糖類并產酸，且其代謝產物中包含多種致齲相關的致病因子，成了目前已經明確的齲病致病菌[2-4]。利用傳統的抑菌藥物抑制變異鏈球菌往往會破壞口腔微生態，很難達到理想的效果[5]。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是在人體內廣泛存在的非致病菌，其代謝產物中包含多種抑菌物質，能夠廣譜地抑制病原菌，并在人體內多個部位維持微生態的平衡[6-8]。已有研究從口腔中分離培養得到了枯草芽孢桿菌，并表明幾種口腔致病菌的生長受到了枯草芽孢桿菌的抑制[9]。揭示變異鏈球菌的生長受枯草芽孢桿菌抑制的機制對于齲病的治療及預防有著非常重要的意義。

利用代謝組學技術可對相對分子質量較低的微生物代謝產物進行全面的分析，且可反映微生物在此過程中真實的生理動態[10-11]，是揭示枯草芽孢桿菌對變異鏈球菌生長抑制機制的有力工具。因此，本研究采用基于1H核磁共振波譜(Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)的代謝組學方法對變異鏈球菌菌液及與枯草芽孢桿菌代謝產物提取液共培養的變異鏈球菌菌液的代謝產物進行比較分析，以期初步揭示枯草芽孢桿菌抑制變異鏈球菌生長的機制，為探求安全、有效的齲病防治藥物提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養方法 變異鏈球菌S.mutans ATCC25157和枯草芽孢桿菌B. subtilis CMCC63501由西北民族大學甘肅省口腔疾病研究重點實驗室提供。變異鏈球菌在牛腦心浸液(Brain heart infusion broth，BHI)培養基，37℃厭氧條件培養。枯草芽孢桿菌采用枯草芽孢桿菌選擇性培養基T2培養基，37℃進行培養[12]。

1.2 枯草芽孢桿菌代謝產物的提取 取生長24h的枯草芽孢桿菌菌液，在4℃下3 000r/min離心5 min，吸取上清并用22μm濾器過濾。

1.3 生長曲線的建立 將BHI培養基中復蘇培養12h的菌體離心收集，之后用PBS磷酸緩沖液重懸并調OD570至0.08。準備24管BHI培養基和24管加入枯草芽孢桿菌代謝產物的BHI培養基，每管10ml。分別將0.05ml重懸后的菌液加入每管培養基，每小時取1管測定OD值構建生長曲線。

1.4 胞外代謝產物的收集及處理 分別收集培養24h處于穩定期的變異鏈球菌及與枯草芽孢桿菌代謝產物共培養的菌液，在4℃、15 000r/min離心10min，將上清液提取后加入PBS磷酸緩沖液(1∶2)并靜置5min。再4℃、15 000r/min離心10min，取上清0.5ml并與0.25ml重水混勻后置于核磁管內，保存于-80℃冰箱，測定前取出并保持在0℃左右，使用DRX600超導傅里葉變換NMR儀進行測定。

1.51H NMR的數據采集及分析 在配備了5mm PATXI探針，600.13 MHz質子頻率的Bruker Avance Ⅱ 600波譜儀(Bruker公司，德國)上記錄細胞外代謝物的1H NMR(300K)。隨后在樣點數64 000，譜寬9 001.95Hz下采用兩個脈沖序列獲得光譜[13]。對1H NMR的失真基線和相位進行手動校準。利用MestReC-v4.8軟件將獲得的原始自由感應衰減信號(Free induction decay，FID)數據進行傅里葉轉換(Fourier transition，FT)獲得1H-NMR圖譜，并對1H-NMR譜進行分段積分得到積分值，將積分數據歸一化[14]，隨后通過Canoco 5.0軟件進行主成分分析(Principal components analysis，PCA)。

2 結果

2.1 變異鏈球菌受枯草芽孢桿菌代謝物影響下的生長曲線 單獨培養的變異鏈球菌以及與枯草芽孢桿菌代謝產物共同培養的變異鏈球菌初始濃度相同，在進入對數期后變異鏈球菌生長受到明顯抑制，在培養12h后進入穩定期(圖1)。

圖1 變異鏈球菌受枯草芽孢桿菌代謝物影響下的生長曲線

2.2 胞外代謝產物分析1H NMR分析結果顯示化學位移在δ0×10-6～10×10-6范圍內存在大量胞外代謝產物，這些代謝產物主要包括亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等(圖2)。

圖2 胞外代謝產物的1H NMR分析

2.3 胞外代謝產物的主成分分析(PCA) 將胞外代謝產物1H NMR分析結果的積分數據進行PCA分析，從分析結果可以看出變異鏈球菌單獨培養與共培養樣點在PCA圖上分為了兩簇(圖3)，這表明與枯草芽孢桿菌代謝產物共培養后，變異鏈球菌的代謝產物發生了改變，這些存在差異的代謝產物可能包含了亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等。

圖3 胞外代謝產物的主成分分析

黑色圓點：變異鏈球菌 紅色圓點：變異鏈球菌+枯草芽孢桿菌

3 討論

本研究提取了枯草芽孢桿菌代謝產物，并將其與變異鏈球菌共培養，從測得的細菌生長曲線可以看出與單獨培養的變異鏈球菌相比，共培養的變異鏈球菌生長受到了抑制(圖1)，這表明枯草芽孢桿菌可以產生抑制變異鏈球菌生長的代謝產物。枯草芽孢桿菌的抑菌作用已經在很多領域被廣泛應用[15]，尋找并利用能夠抑制變異鏈球菌生長的代謝產物對齲病的防治具有重要意義。

為了揭示枯草芽孢桿菌抑制變異鏈球菌生長可能存在的機制，筆者從代謝組學的角度分析了變異鏈球菌單獨培養及共培養的代謝產物。1H NMR結果的主成分分析表明了其兩者之間存在差異(圖3)，而這些表達存在差異的重要代謝產物可能是亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等(圖2)。變異鏈球菌致齲的關鍵毒力因子包含了胞外多糖合成、產酸、耐酸、黏附及形成生物膜等[2]。乳酸是致齲的關鍵因素，牙表面乳酸的形成可降低pH并導致齲齒的形成[16]。而亮氨酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等均為三羧酸循環的重要中間產物，它們與細菌的生長與繁殖密切相關[17]。通過本研究的結果筆者認為枯草芽孢桿菌可能通過產生能夠影響變異鏈球菌糖代謝和氨基酸代謝的產物，從而抑制了變異鏈球菌的生長。一方面，變異鏈球菌的生長及增殖受到了抑制，使其作為齲病的重要致病菌從數量上得以減少。另一方面，變異鏈球菌的糖酵解途徑受到影響，使其產生的毒力因子作用降低。

本研究利用1H NMR代謝組學分析為揭示枯草芽孢桿菌抑制變異鏈球菌生長可能存在的機制提供了理論依據，然而要明確發生改變的代謝產物并對其進行定量還需要進行精確的靶向代謝組學分析。未來的研究還需結合多組學對該機制進行完整的揭示，以期為齲病的治療提供安全、有效的藥物，以及提出新的研究思路。