兩種分枝桿菌鑒定及耐藥檢測方法在肺泡灌洗液中的應用價值*

趙佳慧，徐費凡，馬 娟，施軍衛

江蘇省南通市第六人民醫院：1.檢驗科；2.結核科，江蘇南通 226011

盡管臨床醫師對結核病的診斷和治療逐漸取得進展，但是耐藥結核病仍然是危害公共衛生和生命安全的重大疾病之一[1]。2018年的世界衛生組織(WHO)全球結核病報告顯示：2017年全球新發結核病例數約為1 000萬，死亡病例約為160萬。有研究報道，我國約有55.8萬例利福平耐藥結核病患者[2]。我國是耐藥結核病的重災區，耐藥結核病患者人數位居全球第2位[3]。因此，耐藥結核病的預防和治療工作仍然是我國公共衛生事業的重點和難點。

在實驗室檢測方面，結核病的診斷和利福平耐藥檢測多依賴于傳統結核分枝桿菌(MTB)培養和藥敏試驗，但所需時間較長，不利于患者早期、精準定位治療[4-5]。近年來，隨著分子生物學診斷方法的迅速發展，熒光聚合酶鏈反應(PCR)溶解曲線法和Gene Xpert MTB/RIF法顯現出比較明顯的早期診斷優勢[6-8]，而其在支氣管肺泡灌洗液中的診斷價值鮮見報道。因此，本研究將這兩種分子生物學方法在支氣管肺泡灌洗液中的應用價值進行比較，以期為耐藥結核病的臨床診斷和治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選取2018年10月至2019年8月本院收治的門診和住院患者支氣管肺泡灌洗液標本共102例，灌洗液標本由結核科和呼吸科醫生取自患者病變的肺部及遠端支氣管，經注入生理鹽水并通過負壓吸收，收集于無菌收集管中，每管10～15 mL。所有灌洗液標本均立即采用熒光PCR溶解曲線法和Gene Xpert MTB/RIF法進行檢測和利福平耐藥快速鑒定。在收集到的102例灌洗液中，經分枝桿菌病原學檢測(涂片或者培養)，檢測結果為陽性(結核性灌洗液)的患者59例，結果為陰性的(非結核性灌洗液)患者43例。兩種類型灌洗液患者中男性患者分別為34、23例(P<0.05)，年齡分別為(59.44±14.23)、(56.27±7.53)歲(P>0.05)，有肺部空洞者分別為12、0例(P<0.05)，T-SPOT陽性患者分別為48、4例(P<0.05)。非結核性灌洗液43例患者中包括支氣管擴張癥8例，肺部結節18例，肺癌5例，肺炎10例以及其他疾病2例。

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀(Lightcycler 480 PCR儀)購自美國Roche公司；Gene Xpert MTB/RIF設備及配套試劑購自美國Cepheid公司；MTB核酸提取試劑、MTB利福平耐藥突變檢測試劑盒及MTB復合體快速檢測試劑盒均購自廈門致善生物科技有限公司；核酸提取儀購自海門其林貝爾制造有限公司。

1.3方法

1.3.1熒光PCR溶解曲線法與結果判讀 取混勻后的灌洗液標本1 mL加入兩倍體積的配制好的消化液消化5 min，取1 mL消化后的灌洗液標本轉移至新標記好的EP管中，離心去除上清液后加入MTB DNA提取液(250 μL)，混勻后置于99 ℃恒溫加熱儀中加熱20 min。再次離心，取5 μL離心后的上清液作為反應模板加入20 μL PCR反應液中。采用Lightcycler480 PCR儀進行目的片段擴增和溶解曲線分析。熒光PCR反應條件參照文獻[9]。結果判斷：(1)分枝桿菌檢測，MTB復合群Tm值在FAM通道上為(61.4±1.5)℃。(2)利福平突變結果，①野生型，樣品Tm值與內置陽性對照Tm值相同；②突變型，樣品Tm值低于內置陽性對照Tm值2 ℃及以上。

1.3.2Gene Xpert MTB/RIF法與結果判讀 取混勻后的灌洗液標本1 mL，加入兩倍體積的商品化稀釋液震蕩30 s，靜置15 min，取約2 mL消化好的標本于配套的Cartridge盒內，蓋上蓋子，于Gene Xpert系統程序中設置好位置和編號，反應過程約為2 h。結果判讀：根據循環次數(CT)，系統自動識別為陰性、極低、低、中、高。CT<16判定為MTB檢出“高”；CT 為16～22判定為MTB檢出“中”，CT為>22～28判定為MTB檢出“低”；CT為>28～38判定為MTB檢出“極低”；CT>38判定為MTB未檢出(陰性)。Probe A、B、C、D和E 5個探針是檢測利福平rpoB基因是否發生突變的不同耐藥位點，系統報告為陰性或耐藥。

2 結 果

2.1兩種分子生物學方法對分枝桿菌的鑒定結果 在分枝桿菌鑒定中，102例灌洗液中有57例經熒光PCR溶解曲線法鑒定為MTB復合群，有2例鑒定為非MTB，根據Tm值區間以及測序結果對比，證實這兩例非MTB為龜膿腫分枝桿菌和牛分枝桿菌。該方法檢測的陽性率為57.84%。在102例灌洗液標本中，有57例經Gene Xpert MTB/RIF法鑒定為MTB，陽性率為55.88%。其中有5例CT<16，MTB檢出“高”；2例CT為16～22，MTB檢出“中”；32例CT為>22～28，MTB檢出“低”；18例CT為>28～38，MTB檢出“極低”；其余45例CT>38，MTB未檢出。兩種方法的符合率為98.08%。

2.2兩種分子生物學方法對利福平耐藥突變的鑒定結果 熒光PCR溶解曲線法在57例MTB中檢出15例利福平耐藥突變，檢出率為26.32%。Gene Xpert MTB/RIF法檢出13例利福平耐藥，檢出率為22.81%。在檢出的13例利福平耐藥MTB中，針對利福平耐藥的Probe E(529～533)區域檢出耐藥菌株5例，Probe B(512～518)區域檢出耐藥菌株3例，Probe D(523～529)區域檢出耐藥菌株3例，Probe A(507～511)區域檢出耐藥菌株2例。兩種方法的符合率為96.61%。

2.3兩種分子生物學方法與培養法對比 在收集的102例灌洗液中，熒光PCR溶解曲線法檢出了59例分枝桿菌陽性標本及15例利福平耐藥突變標本。Gene Xpert MTB/RIF法檢出57例陽性標本和13例利福平耐藥突變標本，兩種方法的符合率之間差異無統計學意義(P>0.05)。以最終的培養結果為金標準，熒光PCR溶解曲線法診斷分枝桿菌的靈敏度為100.00%，特異度為100.00%，陽性預測值為100.00%，陰性預測值為100.00%。Gene Xpert MTB/RIF法診斷分枝桿菌的靈敏度為96.61%，特異度為100.00%，陽性預測值為100.00%，陰性預測值為95.56%。見表1～2。

表1 熒光PCR溶解曲線法和培養法結果對比(n)

表2 Gene Xpert MTB/RIF法和培養法結果對比(n)

3 討 論

由于潛伏感染及耐藥結核病患者數量的增加，結核病的發病率和患病率有所升高[10]。盡管結核病的病原學診斷方法很多，但大部分診斷方法依賴于結核病患者的依從性[11]。因此，病原學標本的質量對于臨床早期診斷和治療有著至關重要的作用。支氣管肺泡灌洗液主要由臨床醫生在患者肺部病變部位和遠端支氣管反復灌洗所得，臨床診斷的陽性率明顯高于一般的檢驗標本，如痰液、胸腔積液等[12]。近年來，隨著分子生物學方法的不斷發展，用于MTB診斷及耐藥突變鑒定的診斷試劑不斷涌現[13-14]。其中，熒光PCR溶解曲線法和Gene Xpert MTB/RIF法由于操作比較簡便，縮短了病原學診斷時間而被廣泛應用[15-16]。利福平是目前臨床使用的一線抗結核藥物之一，其耐藥現象最為普遍[17]。研究表明，90%的利福平耐藥患者同時對異煙肼耐藥[18-19]。因此，利福平是目前研究耐藥結核病的主要檢測藥物。

熒光PCR溶解曲線法是一種基于Tm值變化而識別物種基因分型及耐藥基因突變的較為簡便的分子生物學檢測技術[20]。該方法在一些疾病的早期分子診斷中廣泛應用[21-23]。鄒遠嫵等[24]將羅氏藥敏法與熒光PCR溶解曲線法用于異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、莫西沙星和左氧氟沙星的耐藥檢測中，發現熒光PCR溶解曲線法對這幾種藥物的檢測結果較為一致，且操作簡便，檢測速度快，是一種比較穩定的分子生物學檢測方法[24]。也有科研人員將不同的臨床標本(包括痰液、胸腔積液、腹水、腦脊液、灌洗液、膿液)用于利福平和異煙肼耐藥檢測，結果也發現該方法有較高的檢測效能[25]。筆者之前的研究也發現，熒光PCR溶解曲線法在利福平和異煙肼耐藥突變檢測方面較傳統的比例藥敏法有更高的檢測價值[9]。在之前的研究中，熒光PCR溶解曲線法主要用于培養陽性的MTB菌株的耐藥基因檢測，在此次研究中，筆者直接將支氣管肺泡灌洗液用于核酸提取，并聯合耐藥診斷試劑盒直接檢出分枝桿菌及其是否為利福平耐藥，極大縮短了以往MTB的培養時間，為結核病患者的早期診斷和治療提供了較好的實驗室診斷基礎。

Gene Xpert MTB/RIF法是一種全新的集分枝桿菌檢測和利福平耐藥檢測于一體的全自動半定量實時PCR系統，其針對MTB 81 bp左右的利福平耐藥核心區域設計引物，操作簡便，可以全自動提取核酸并純化，自動完成PCR反應并在2 h內出具檢測結果[26]。研究發現，與直接涂片法和液體培養法比較，Gene Xpert MTB/RIF法有較好的一致性，并在結核性胸膜炎和腦膜炎的輔助診斷方面有較高的價值[27-28]。但這兩種方法在支氣管肺泡灌洗液中的應用鮮見報道。本研究結果發現，在102例灌洗液標本中熒光PCR溶解曲線法檢出MTB 57例，另外檢出非MTB 2例，其檢出分枝桿菌的靈敏度為100.00%，特異度為100.00%，檢出利福平耐藥15例，檢出率為26.32%。Gene Xpert MTB/RIF法檢出MTB 57例，其檢出分枝桿菌的靈敏度為96.61%，特異度為100.00%，檢出利福平耐藥13例，檢出率為22.81%，兩種方法的符合率為96.61%。與熒光PCR溶解曲線法比較，Gene Xpert MTB/RIF法耗時更短，操作方法更為簡便，但熒光PCR溶解曲線法在分枝桿菌鑒定，尤其是在區分MTB復合群和非MTB方面更有優勢。

綜上所述，熒光PCR溶解曲線法和Gene Xpert MTB/RIF法在分枝桿菌檢測和利福平耐藥突變檢測方面均有較高的靈敏度和特異度，兩種方法也有較高的符合率。熒光PCR溶解曲線法在非MTB鑒定與分型上有較大優勢，而Gene Xpert MTB/RIF法操作更為快速、簡便。臨床醫師可根據病原學診斷的具體要求選擇合適的實驗方法，為臨床診斷和早期治療提供較好的實驗室支撐。