Skp2通過調(diào)控Snaill水平對上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT的作用研究

徐小麗,李 青,陳 彬

安徽省安慶市立醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽安慶 246001

卵巢癌致病機(jī)制復(fù)雜，在疾病早期難以診斷，超過70%的卵巢癌患者在晚期(Ⅲ或Ⅳ期)被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)，卵巢癌細(xì)胞通常對化學(xué)治療藥物具有抗性，導(dǎo)致患者整體生存率急劇下降[1-2]。卵巢癌是上皮性腫瘤，具有高度轉(zhuǎn)移性，與其他腫瘤細(xì)胞不同，由于沒有解剖屏障，卵巢癌細(xì)胞可以直接擴(kuò)散到腹膜腔，而不通過血液擴(kuò)散[3]。在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是其中的關(guān)鍵過程[4]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)抑制被認(rèn)為是EMT過程中的一個(gè)基本事件，許多細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)錄因子Snaill、鋅指E框結(jié)合同源框1/2(ZEB1/2)和樣轉(zhuǎn)錄因子8(KLF8)等可直接與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而抑制其轉(zhuǎn)錄[5-6]。Snaill在EMT的調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用，包括E-cadherin的水平降低，以及波形蛋白(Vimentin蛋白)和纖連蛋白(Fibronectin)等生物標(biāo)志物水平的升高。S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)是近年發(fā)現(xiàn)的一種F-box蛋白，可以直接降解Snaill，在許多晚期癌癥(包括卵巢癌)中發(fā)現(xiàn)其低表達(dá)[7]。體外研究顯示，Skp2過表達(dá)可抑制腺癌或鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的遷移和侵襲[8]。同時(shí)，卵巢癌中Skp2的低表達(dá)與E-cadherin的丟失有關(guān)，表明發(fā)生了EMT[9]。然而，Skp2在EMT中的分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究探討Skp2通過調(diào)控Snaill水平在抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT方面的作用，以期為卵巢癌的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1材料 分別收集15例上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織。所有研究對象均未接受放療或化療，切除后立即將標(biāo)本放液氮中保存。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，所有研究對象對本研究均知情同意并簽署知情同意書，同時(shí)本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)，胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)，Skp2干擾表達(dá)載體(5′-CCGGGATAGTGTCATGCTAAAGAATCTCGAG ATTCTTTAGCATGACACTATCTTTTTG-3′，廣州銳博公司設(shè)計(jì)與合成)和Skp2過表達(dá)載體(5′-CCGGGCCTAAGCTAAATCGAGAGAACTGAGT TCTCTCGATTTAGCTTAGGCTTTTTG-3′，廣州銳博公司設(shè)計(jì)與合成)，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)，TRIzol(美國Invitrogen公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(寶生物工程有限公司)。PCR引物序列由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)及合成：Skp2上游引物為5′-ATAAGCTTATGCACAGGAAGCA-CCCTCCAGG-3′,下游引物為5′-AAGAATTCTCATAGACAACGGGCTTTTGC-3′；Snaill上游引物為5′-TCCAGAGTTTACCTTCCAGCA-3′，下游引物為5′-CTTTCCCACTGTCCTCATCTG-3′；E-cadherin上游引物為5′-GCTGCTCTTGCTGTTTCTTCG-3′，下游引物為5′-CCGCCTCCTTCTTCATCATAG-3′；Vimentin上游引物為5′-AAGTTTGCTGACCTCTCTGAGGCT-3′，下游引物為5′-CTTCCATT TCACGCATCTGGCGTT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。RIPA裂解液(上海生工生物工程有限公司)，Skp2、Snaill、E-cadherin、Vimentin、β-actin鼠抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(美國Santa Cruz公司)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國GE公司)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Ther-mo Revco公司)，24孔Transwell小室(美國Corning科技有限公司)，NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和BIO-RAD垂直電泳儀(美國BIO-RAD公司)，凝膠成像儀(美國UVP公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將實(shí)驗(yàn)對象分為陰性對照組(只加脂質(zhì)體)、Skp2干擾表達(dá)組(加Skp2干擾表達(dá)載體和脂質(zhì)體)、Skp2過表達(dá)組(加Skp2過表達(dá)載體和脂質(zhì)體)。將含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對SKOV3細(xì)胞進(jìn)行離心后接種于6孔板中，待細(xì)胞生長后更換為無血清培養(yǎng)液(RPMI-1640)，分別用Lipofectamine法將脂質(zhì)體、Skp2干擾表達(dá)載體和Skp2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含血清培養(yǎng)液(RPMI-1640)繼續(xù)培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3.2RT-PCR法檢測組織中Skp2、Snaill mRNA，以及細(xì)胞中Skp2、Snaill、E-cadherin和Vimentin mRNA的表達(dá) 陰性對照組、Skp2干擾表達(dá)組和Skp2過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)(3毫升/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞，使用TRIzol提取總RNA，測定mRNA的水平和純度，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書，制備20 μL反應(yīng)體系。在RT-PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、60 ℃ 44 s、40個(gè)循環(huán)，61 ℃時(shí)采集熒光，用RT-PCR儀進(jìn)行檢測并對其表達(dá)量進(jìn)行分析。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Skp2、Snaill、E-cadherin和Vimentin mRNA的相對表達(dá)量(正常卵巢組織和卵巢癌組織標(biāo)本只進(jìn)行Skp2和Snaill mRNA的檢測)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3Transwell法檢測細(xì)胞體外侵襲、遷移能力 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后以5×105/mL接種在24孔Transwell小室中(200微升/孔)，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出小室，用無菌棉簽擦拭去除上室內(nèi)的細(xì)胞，用4%甲醛固定10 min，用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，沖洗干凈后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。計(jì)數(shù)染成紫色的穿膜細(xì)胞(代表細(xì)胞侵襲和遷移能力)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4免疫印跡(western blot)法檢測Skp2、Snaill、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)(3毫升/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰浴2 h。離心取上清液進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整蛋白水平，沸水進(jìn)行變性。進(jìn)行電泳(每孔上樣量為20 μg)，將膜與Skp2(1∶200)、Snaill(1∶500)、E-cadherin(1∶400)、Vimentin(1∶500)和β-actin(1∶1 000)抗體進(jìn)行孵育，4 ℃過夜，將IgG二抗(1∶5 000)在室溫下孵育30 min。進(jìn)行顯色，采集圖像，通過Image LabTM軟件(Bio-Rad)獲取信號并估計(jì)強(qiáng)度，以β-actin作為內(nèi)對照。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1正常卵巢組織和卵巢癌組織中Skp2和Snaill mRNA的表達(dá)情況 Skp2 mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常卵巢組織、Snaill mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 正常卵巢組織和卵巢癌組織中Skp2和 Snaill mRNA的表達(dá)情況

2.23組細(xì)胞中Skp2、Snaill、E-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)情況 與陰性對照組相比，Skp2干擾表達(dá)組細(xì)胞中Skp2和E-cadherin mRNA表達(dá)水平降低，Snaill和Vimentin mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Skp2干擾表達(dá)組相比，Skp2過表達(dá)組細(xì)胞中Skp2和E-cadherin mRNA表達(dá)水平升高，Snaill和Vimentin mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.33組細(xì)胞侵襲、遷移能力 與陰性對照組相比，Skp2干擾表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Skp2干擾表達(dá)組相比，Skp2過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1～2、表3。

表2 3組細(xì)胞中Skp2、Snaill、E-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)情況

注：A為陰性對照組；B為Skp2干擾表達(dá)組；C為Skp2過表達(dá)組。

注：A為陰性對照組；B為Skp2干擾表達(dá)組；C為Skp2過表達(dá)組。

表3 3組細(xì)胞侵襲、遷移能力

2.43組細(xì)胞中Skp2、Snaill、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)情況 與陰性對照組相比，Skp2干擾表達(dá)組細(xì)胞中Skp2和E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，Snaill和Vimentin蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Skp2干擾表達(dá)組相比，Skp2過表達(dá)組細(xì)胞中Skp2和E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，Snaill和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 3組細(xì)胞中Skp2、Snaill、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)情況

圖3 western blot法結(jié)果

3 討 論

上皮性卵巢癌的高致死率很大程度上是由于高侵襲性和易于局部及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移造成的，其中EMT起著實(shí)質(zhì)性的作用。在腫瘤進(jìn)展過程中，卵巢癌細(xì)胞EMT表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物如E-cadherin、閉鎖蛋白1(ZO-1)等表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物如Vimentin蛋白、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)等表達(dá)增加為特征，這意味著EMT是卵巢癌進(jìn)展的先決條件[10]。E-cadherin表達(dá)下調(diào)是EMT的特征性改變，主要受轉(zhuǎn)錄因子Snaill的調(diào)控，是癌細(xì)胞侵襲的前提條件。Snaill可以與E-cadherin啟動(dòng)子中的E-BOX結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄[11]。因此，調(diào)控EMT相關(guān)因子可能為卵巢癌的治療提供新的線索。

Skp2是一種E3泛素連接酶[12]，調(diào)控多種腫瘤抑制因子水平，包括p27和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(FOXO1)[12]。Skp2低表達(dá)在包括卵巢癌在內(nèi)的多種人類癌癥中經(jīng)常被觀察到，然而，Skp2與EMT的相關(guān)性尚不清楚[13]。本研究探討了Skp2通過調(diào)控Snaill水平在抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞EMT方面的作用。結(jié)果表明，Skp2在卵巢癌組織中表達(dá)明顯降低，且在其卵巢癌中水平升高則會(huì)抑制Snaill的表達(dá)，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲性。同時(shí)，有研究顯示，Skp2對Snaill表達(dá)有抑制作用，而Snaill對Skp2表達(dá)無明顯影響[14]，表明Snaill是Skp2的下游因子。Snaill被認(rèn)為是EMT中的轉(zhuǎn)錄因子。為了進(jìn)一步支持上述結(jié)果，筆者進(jìn)一步探討了Skp2在SKOV3細(xì)胞侵襲、遷移中的作用，結(jié)果表明，Skp2抑制了SKOV3細(xì)胞的侵襲和遷移。

有研究者提出了一個(gè)有關(guān)EMT的全面監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)，以強(qiáng)調(diào)Skp2的關(guān)鍵作用[14]。然而尚不清楚EMT過程中Skp2發(fā)揮作用的確切機(jī)制，在某些情況下，Skp2低表達(dá)與E-cadherin低表達(dá)相關(guān)[15]。有研究報(bào)道，Skp2主要充當(dāng)肝癌細(xì)胞中與EMT相關(guān)的抑制因子，并與基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合抑制其侵襲性，但這些因子與EMT之間的關(guān)系尚未確定[16]。此外，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路的激活導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)和間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的上調(diào)。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)通過磷酸化的機(jī)制下調(diào)Snaill來抑制EMT，而PI3K/AKT通過GSK-3β失活，穩(wěn)定Snaill來促進(jìn)EMT[17-18]。本研究觀察到促進(jìn)Skp2表達(dá)可以使Snaill蛋白水平降低，抑制卵巢癌細(xì)胞EMT，而抑制Skp2表達(dá)則作用相反。上述結(jié)果對于在EMT中建立Skp2的功能網(wǎng)絡(luò)非常有意義，但本研究沒有對Skp2相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，說服力較欠缺。

綜上所述，Skp2在上皮性卵巢癌組織中低表達(dá)，它在卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的調(diào)控中起重要作用。通過基因干預(yù)技術(shù)促進(jìn)Skp2的表達(dá)可以降低SKOV3細(xì)胞中Snaill表達(dá)，抑制EMT，而抑制Skp2表達(dá)則作用相反。