miR-20a對NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響及與血清腫瘤標志物聯合檢測的診斷效能

楊文玲，陳宗濤

陸軍軍醫大學第一附屬醫院健康管理科,重慶 400038

非小細胞肺癌(NSCLC)是臨床上常見的惡性腫瘤，其發病率較高，約占肺癌總發病率的84%[1]。NSCLC的療效及預后與診斷有著密切關系，由于NSCLC早期并無明顯的臨床癥狀，臨床診斷過程中常出現漏診或者誤診的情況，從而延誤最佳治療時機[2-3]。近年來，腫瘤標志物在臨床應用中受到越來越多的關注，有研究表明，腫瘤標志物聯合檢測可提高NSCLC的診斷效能，但是這些標志物并非是NSCLC的特異性標志物，所以其在NSCLC診斷中的應用仍需不斷探討、考證[4]。本研究旨在探討血清腫瘤標志物和miR-20a聯合檢測在NSCLC診斷中的價值，以期為NSCLC的臨床早期診療提供可靠的依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2013年1月至2015年1月收治的肺部疾病患者共206例，其中NSCLC患者[NSCLC組,在進行手術切除時保留癌組織和癌旁組織(距癌組織>5 cm)標本]112例，肺部良性疾病患者(良性肺病組)94例。NSCLC組中男58例，女54例；年齡45～76歲，平均(56.82±13.21)歲；腫瘤直徑為1.6～5.9 cm，平均(3.45±1.25)cm。良性肺病組中男48例，女46例；年齡44～75歲，平均(54.72±12.11)歲。所有患者均經本院病理科明確診斷。排除標準：(1)心、肝、腎功能嚴重受損者；(2)近期接受過相關治療者；(3)長期使用免疫抑制劑及糖皮質激素治療者；(4)精神疾病患者；(5)其他癌癥患者。受試者均簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會審核通過。

1．2方法

1.2.1標本采集 抽取10 mL空腹靜脈血于非抗凝管中，然后4 000 r/min離心10 min分離血清，儲存于-80 ℃冰箱，用于癌胚抗原(CEA)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)等腫瘤標志物的檢測。抽取10 mL空腹靜脈血于抗凝管中，然后4 000 r/min離心10 min分離血漿，儲存于-80 ℃冰箱，用于miR-20a檢測。

1.2.2血清腫瘤標志物及miR-20a水平檢測 采用電化學發光法(Roche Elecsys 2010)檢測血清CEA、NSE、糖類抗原(CA)125水平。采用TaqMan試劑盒(賽默飛世爾；ID:000580;序列:UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG)在實時熒光定量PCR儀上檢測miR-20a的表達水平。

1.2.3細胞培養、分組及轉染 將細胞加入DMEM培養基，于37 ℃、5%CO2的條件下培養于培養箱中，48 h后消化傳代。采用LipofectamineTM2000試劑將miR-20a類似物(mimic-miR-20a)轉染至A549細胞(該細胞來源于NSCLC細胞系)中，即mimic-miR-20a組，以僅加入LipofectamineTM2000試劑而未轉染miRNA模擬物/抑制劑(mimics/inhibitor)的細胞為對照，即mimic-NC組。等量接種A549細胞于6孔板中，過夜培養A549細胞貼壁生長至80%～90%的融合度，mimic-miR-20a組用mimics(終水平為50 nmol/L)轉染的完全培養基培養約24 h。

1.2.4細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力檢測 (1)CCK8細胞增殖檢測：將密度為105個/毫升的細胞懸液接種于96孔板中，每孔接種200 μL。培養48 h后加入10 μL的CCK8試劑，孵育2 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度，檢測細胞的增殖情況。(2)Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測：將收集到的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后用400 μL的結合緩沖液(binding buffer)重懸，然后分別加入10 μL的Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)，避光孵育20 min，采用流式細胞術檢測細胞的凋亡水平。(3)細胞劃痕實驗：按照2×106個/孔的密度將細胞接種于6孔板中，培養48 h后用20 μL的槍頭在6孔板上劃出劃痕，在0 h和24 h這兩個時間點進行拍照，量取細胞的遷移距離。(4)碳酸脂膜(Transwell)侵襲實驗：用基質膠(matrigel)包被Transwell上層小室，加入200 μL DMEM重懸的密度為105個/毫升的細胞懸液，下層用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM填滿，培養48 h后將侵襲的細胞固定，用結晶紫染色，對侵襲細胞進行計數。

1.3判斷標準 以病理檢查結果為金標準。聯合檢測時，CEA、NSE、CA125和miR-20a任意一項水平超過其臨界值判定為陽性；全部指標水平低于其臨界值判定為陰性。

2 結 果

2.1miR-20a在NSCLC組織中的表達水平及與患者生存率的相關性 與癌旁組織相比，miR-20a在NSCLC組織中的表達水平明顯升高(P<0.05)。經過5年的隨訪，47例患者因肺癌死亡。采用Kaplan-Meier曲線分析miR-20a表達水平與患者生存率之間的相關性，結果表明，miR-20a的表達水平與患者的生存率呈負相關(P<0.05)。見圖1～2。

2.2miR-20a對A594細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的調控作用 在A594細胞中過表達miR-20a，實時熒光定量PCR結果表明，miR-20a在A594細胞中有著較高的過表達效率(圖3A)。CCK8細胞增殖檢測結果表明，過表達miR-20a可明顯促進A594細胞的增殖(圖3B)，且流式細胞術結果證明過表達miR-20a后，A594細胞的凋亡水平明顯降低(圖3C)。此外，細胞劃痕實驗和Transwell 侵襲實驗結果表明，在A594細胞中過表達miR-20a可明顯促進細胞的遷移與侵襲(圖3D～E)。

2.3兩組血清腫瘤標志物及miR-20a表達水平比較 NSCLC組患者血清CEA、CA125以及NSE的表達水平明顯高于良性肺病組(P<0.05)；另外，NSCLC組患者血漿miR-20a的表達水平明顯高于良性肺病組(P<0.05)。見表1。

注：與癌旁組織比較，*P<0.05。

圖2 miR-20a的表達水平與NSCLC患者生存率的相關性

2.4血清腫瘤標志物以及miR-20a在各組的檢出情況比較 NSCLC組患者CEA、NSE、CA125以及miR-20a的陽性檢出率明顯高于良性肺病組；聯合檢測結果為陽性(上述指標任意一項水平超過其臨界值)的患者在NSCLC組中所占的比例明顯高于良性肺病組。見表2。

注：A為miR-20a在A594細胞中的過表達效率；B為miR-20a對A594細胞增殖能力的調控作用；C為miR-20a對A594細胞凋亡水平的調控作用；D為miR-20a對A594細胞遷移能力的調控作用，以0 h作為參照；E為miR-20a對細胞侵襲能力的調控作用；*P<0.05。

圖3 miR-20a對A594細胞增殖、凋亡、遷移與侵襲的調控作用表1 兩組血清腫瘤標志物及miR-20a的表達水平比較

表2 兩組血清腫瘤標志物及miR-20a檢出情況比較(n)

2.5血清腫瘤標志物與miR-20a聯合檢測在NSCLC診斷中的價值 NSE診斷NSCLC的靈敏度為61.28%，特異度為84.66%，明顯高于其他血清腫瘤標志物；miR-20a對NSCLC也有較高的靈敏度與特異度。CEA、NSE、CA125、miR-20a聯合檢測對NSCLC的診斷效能遠高于各腫瘤標志物單獨檢測，其靈敏度達73.21%，特異度達91.49%，見表3。

表3 各指標單獨及聯合檢測的診斷效能(%)

3 討 論

miRNA是一類不能編碼蛋白質、長度小于25個核苷酸的小RNA，研究表明，miRNA的異常表達與癌癥的發生、發展有著緊密的聯系[5]。本研究表明，miR-20a高表達于NSCLC組織中，且過表達的miR-20a可顯著促進A594細胞的增殖、侵襲與遷移。許榮譽等[6]研究表明，miR-20a在NSCLC組患者血漿中的表達水平及陽性檢出率明顯高于良性肺病組患者，且miR-20a的表達水平與腫瘤的分化程度、臨床分期以及淋巴結轉移有著密切關系，與本研究結果基本一致。

鑒于miR-20a在NSCLC組織中的生物作用，筆者認為miR-20a還可以在NSCLC的診斷試驗中起作用。本研究發現，miR-20a在NSCLC組患者血漿中的表達水平明顯高于良性肺病組患者，并且其靈敏度為58.04%，特異度為80.85%。因此，筆者認為miR-20a可以作為NSCLC診斷試驗中的一個生物標志物。

此外，本研究還探討了CEA、NSE和CA125在NSCLC診斷中的價值，結果顯示，CEA高表達于NSCLC患者血清，NSCLC患者CEA陽性檢出率明顯高于肺部良性疾病患者，但是其對NSCLC的特異度和靈敏度較低。CEA是一種由胃腸道分泌的糖蛋白，具有胚胎抗原特異性。早期的研究表明，血清中CEA的高表達與大腸癌的發病息息相關，因此可作為大腸癌的特異性標志物應用于臨床診斷[7-8]。隨著研究的深入，CEA在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌等惡性腫瘤中的異常表達逐漸被發現，因此CEA被當作腫瘤診斷標志物廣泛應用于臨床，并且許多研究報道指出，其在NSCLC的診斷中有重要意義[9-10]。

本研究中NSCLC患者血清NSE水平以及陽性檢出率均明顯高于肺部良性疾病患者，并且其特異度和靈敏度較高，分別為84.56%、61.28%。NSE特異性地存在于中樞及周圍神經系統，由于NSCLC屬于神經內分泌類腫瘤，因此NSE對NSCLC的診斷具有較高的特異度與靈敏度[11]。

相較于肺部良性疾病患者，NSCLC患者血清CA125水平和陽性檢出率明顯升高，且CA125診斷NSCLC的靈敏度達51.79%，特異度達75.26%。CA125是一種儲存于細胞內的糖蛋白，正常情況下由于細胞間連接和基底膜的阻擋,CA125無法進入血液循環，因此健康人血液中CA125水平極低。當組織出現癌性病變時，細胞之間的連接及基底膜遭到破壞，血液中的CA125水平會明顯升高[12-14]。隨著研究的深入，不少報道指出，其在肺癌患者血清中的陽性檢出率偏高，且其診斷肺癌的靈敏度為30%～60%，特異度為34%～67%[15]，這與本研究結果基本一致。

綜上所述，CEA、NSE、CA125及miR-20a作為NSCLC的診斷標志物各有優點，但是單獨使用時的特異度和靈敏度并不理想。本研究將3種血清腫瘤標志物與血漿miR-20a聯用，發現聯合檢測對于診斷NSCLC的靈敏度和特異度均高于各指標單獨檢測，這提示miR-20a、CEA、NSE及CA125聯合檢測可能更具有診斷價值。