多表位融合蛋白對減少梅毒抗體測定假反應性的作用*

雷 雪，林勇平，向 波，杜麗枝，鄧湘雪，劉斯琦，林潤培，劉忠民△

1.廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州 510000；2.廣州醫科大學金域檢驗學院，廣東廣州 510000

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年3月至2018年3月廣州醫科大學附屬第一醫院雅培全自動免疫分析儀Architect i2000(簡稱Architect i2000)梅毒檢測陽性血清標本96份(1≤S/CO≤10)，健康人標本50份。血清分裝后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2儀器與試劑 質粒提取和膠回收試劑盒購自天根公司；Premix Ex Taq DNA聚合酶購自TAKARA公司；內切酶XhoⅠ、NcoⅠ、T4 DNA連接酶和蛋白標準相對分子質量購自Thermo Fisher公司；HRP購自Sigma公司；His Trap FF親和層析柱購自GE公司。

1.3方法

1.3.1重疊PCR基因擴增 根據Genbank中的Tp47基因序列，使用IEDB等預測軟件進行B細胞表位預測，選定優勢表位基因片段。應用Primer Premier V5.0軟件設計引物，委托上海生物工程有限公司合成引物。引物序列見表1。

表1 Tp47基因優勢抗原表位的引物設計

使用質粒提取試劑盒提取Tp47基因組DNA，以其為模板，PCR擴增、融合3個基因片段獲得多表位融合蛋白基因。反應體系共50.0 μL：2×Ex Taq Master Mix 25.0 μL，引物F1和R3 10.0 μmol/L，其余引物各1.0 μmol/L，模板40.0 ng。反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.2構建重組質粒 將PCR產物與pET-28b載體進行雙酶切，回收目的DNA片段后于22 ℃下連接3 h，將連接片段轉導至感受態細胞DH5α中，經卡那霉素篩選陽性克隆，提取質粒雙酶切鑒定并測序。測序陽性質粒導入BL21(DE3)感受態細胞中準備誘導。

1.3.3重組蛋白的誘導表達與純化 將重組工程菌按1∶100的比例接種于含卡那霉素的LB培養基中，待菌液A值為0.6～0.8時，加入異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至水平為1.0 μmol/L。誘導6 h后收集菌液進行超聲碎菌(150 W，超聲4 s，暫停4 s，共100次)，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后分別收集上清液和沉淀，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白。使用ATKA系統(鎳離子親和層析柱法)純化蛋白后對純化后的蛋白進行透析除鹽和復性。

1.3.4質譜鑒定和免疫印跡試驗(WB) 使用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析(MALDI-TOF-MS)得到蛋白質指紋圖譜，與Blast數據庫進行對比。進行梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)，陽性血清為一抗，HRP標記的羊抗人IgG為二抗，評估重組蛋白的免疫反應性。

同時，可針對自身特點研發或添置若干新型設備。在聯合開發打造先進海纜施工船同時，鑒于舟山現有普通OTDR不能監測海底光纜所受應力變化的實際情況，建議購置增設若干B-OTDR設備以實現對海纜應力變化的動態監測，確保海底光纜運行的安全穩定[7-9]。

1.3.5HRP標記 采用過碘酸鈉法，使用商品化的HRP標記重組蛋白，作為雙抗原夾心ELISA法的酶標二抗。

1.3.6雙抗原夾心ELISA法的建立 以純化、透析后的多表位融合蛋白作為包被抗原，HRP標記的多表位融合蛋白作為酶標二抗建立雙抗原夾心ELISA法。通過棋盤法優化包被抗原和酶標抗原水平、血清稀釋度、包被條件、封閉條件和封閉方式等。

2 結 果

2.1重疊PCR基因擴增結果 經重疊PCR技術獲得多表位融合蛋白基因，瓊脂糖凝膠電泳分析結果見圖1。基因擴增產物為700 bp，與預計相符。

注：M為DL1000 DNA標志物；1為多表位融合蛋白基因PCR產物。

2.2重組質粒載體構建結果 重組載體的雙酶切鑒定結果見圖2，酶切后的基因片段約為700 bp，符合預期。取陽性質粒送樣測序，與數據庫中Tp47基因組一致。

2.3多表位融合蛋白的表達與純化 重組工程菌在IPTG的誘導下表達，主要以包涵體形式存在，可使用親和層析柱進行純化，電泳結果見圖3。

2.4質譜鑒定與WB結果 目的蛋白進行MALDI-TOF-MS后，利用Mascot軟件在MSDB數據庫對質譜結果進行檢索。檢索結果顯示，多表位融合蛋白的肽段序列(GSHMASMTGGQQMGR)與梅毒螺旋體Tp47蛋白相匹配，得分103分，高于閾值分數60分(P<0.05)，證明多表位融合蛋白為梅毒螺旋體47×103脂蛋白片段。WB結果表明，多表位融合蛋白能與TPPA陽性血清發生特異性反應，見圖4。

注：M為DL1000 DNA標志物；1為pET-28b-多表位融合蛋白基因雙酶切產物；2為pET-28b雙酶切產物。

注：M為蛋白標準相對分子質量；1為誘導蛋白上清液；2為誘導蛋白沉淀；3為純化后的誘導蛋白；3號條帶中多表位融合蛋白在包涵體變性純化階段可能存在降解，降解片段在后續復性過程中出現沉淀而被分離；聚丙烯酰胺凝膠電泳后，凝膠使用考馬斯亮藍進行染色，脫色后使用Tanon凝膠成像系統進行拍照，故為黑色。

注：M為蛋白標準相對分子質量；1為多表位融合蛋白誘導菌體蛋白；2為pET-28b誘導菌體蛋白(空載誘導蛋白)。

2.5HRP標記 使用過碘酸鈉法進行HRP標記，電泳結果顯示在170×103上出現蛋白條帶，表明標記成功，見圖5。

注：M為蛋白標準相對分子質量；1為HRP-多表位融合蛋白；2為HRP；3為多表位融合蛋白；條帶使用考馬斯亮藍進行染色，脫色后使用Tanon凝膠成像系統進行拍照，故為黑色。

2.6血清檢測結果

2.6.1多表位融合蛋白雙抗原夾心ELISA法檢測結果 50份Architect i2000梅毒檢測陰性(S/CO<1)且TPPA為陰性結果的標本，平均A值為0.107，s為0.051，計算得出臨界值為0.258。將A值≥0.26的血清標本判讀為陽性，以此臨界值作為標準，對96份Architect i2000梅毒檢測陽性血清(1≤S/CO≤10)再次進行檢測，其中58份為陽性，38份為陰性。以TPPA的結果為標準，多表位融合蛋白雙抗原夾心ELISA法的靈敏度和特異度為90.32%(56/62)和94.12%(32/34),與TPPA結果的符合率為91.67%(88/96)，見表2。

表2 多表位融合蛋白雙抗原夾心ELISA法和TPPA法的檢測結果比較(n)

2.6.2Tp47蛋白雙抗原夾心ELISA法檢測結果 50份Architect i2000梅毒檢測陰性(S/CO<1)且TPPA為陰性結果的標本，平均A值為0.072，s為0.041，計算得出臨界值為0.195。將A值≥0.195的血清標本判讀為陽性，以此臨界值作為標準，對96份Architect i2000梅毒檢測陽性血清(1≤S/CO≤10)再次進行檢測，其中65份為陽性，31份為陰性。以TPPA的結果為標準，Tp47蛋白雙抗原夾心ELISA法的靈敏度和特異度為93.55%(58/62)和79.41%(27/34),與TPPA結果的符合率為88.54%(85/96)，見表3。

表3 Tp47蛋白雙抗原夾心ELISA法和TPPA法的檢測結果比較(n)

3 討 論

本研究利用多表位融合蛋白運用優化后的雙抗原夾心ELISA法檢測梅毒血清標本，該法與TPPA結果的符合率為91.67%，特異度為94.12%,而基于Tp47蛋白的雙抗原夾心ELISA法與TPPA結果的符合率為88.54%，特異度為79.41%。與Tp47蛋白雙抗原夾心ELISA法相比，多表位融合蛋白雙抗原夾心ELISA法檢測的特異度較高，說明通過應用優勢表位融合蛋白作為抗原，提高臨床梅毒篩查的特異度，解決臨床假反應性的方案是可行的。

本研究結果發現，基于多表位融合蛋白的雙抗原夾心ELISA法檢測中有兩份標本出現了假反應性結果，可能是因為血清中存在某些未知的因素引起的交叉反應，目前尚未得知。例如：有6份陽性標本漏檢，可能是因為僅僅使用了Tp47的大部分優勢表位，存在選擇遺漏。TPPA雖然作為目前診斷梅毒的金標準，但所用的診斷抗原為Tp裂解的全天然蛋白抗原，包含眾多的復雜表位，因此也存在某些交叉反應而可能導致假反應性結果，在后續試驗中應進一步使用多種診斷方法進行評價。

國內外的研究常使用表位預測的方法預測優勢表位基因片段，并對其優勢表位基因片段進行表達。目前梅毒抗體檢測多采用Tp47(Tp0574)、Tp17(Tp0453)和Tp15(Tp0171)等蛋白通過不同的組合作為抗原[10-11]，較少有研究針對優勢表位基因片段進行融合表達，本研究的創新性在此。有研究通過表達伯氏疏螺旋體特有的表位短肽作為抗原靶標，通過消除非特異性表位，提高了萊姆病檢測的特異度[12]。LIN等[13]選用丙型肝炎病毒(HCV)基因組的型特異區段和優勢抗原表位合成多表位融合重組抗原，與第二代HCV的血清學檢測方法相比，靈敏度和特異度提高了2～4倍。因此，利用優勢抗原表位融合蛋白作為抗原進行血清學檢測，可能有助于提高診斷的特異度。鑒于以上情況，本研究利用生物信息學技術預測Tp47蛋白的B細胞表位，利用重疊PCR技術連接含多個表位基因的片段，去掉抗原性差的部分構建、表達出多表位融合蛋白，使用HRP標記該多表位融合蛋白，建立雙抗原夾心ELISA法，對臨床標本進行評估。

本研究僅使用目前主要的診斷梅毒的抗原Tp47蛋白作為試驗目標，較為局限，還可以考慮優化其他具有強免疫反應性的蛋白如Tp15、Tp17等，聯合多個不同蛋白的多表位融合蛋白作為抗原，提高ELISA法檢測的靈敏度和特異度。此外，WANG等[14]通過在ELISA法中添加尿素解離的步驟，選擇合適的解離濃度和時間，使假陽性血清標本轉為陰性，改進ELISA法的靈敏度(100.00%)，為本試驗中多表位融合蛋白檢測靈敏度較低的情況提供了改進方案。

在未來的研究中，通過聯合多種蛋白和改進試驗步驟的方式，爭取在高靈敏度的前提下，建立高特異度的梅毒血清學篩查方法。還可以利用多表位融合蛋白建立化學發光法以提高梅毒的篩查速度，該策略也可用于目前HIV、HCV等存在高假陽性標本的臨床血清學篩查中。

本研究以多表位融合蛋白作為包被抗原，HRP標記該蛋白作為酶標抗原，對臨床標本進行檢測，與Tp47蛋白相比，具有更好的檢測性能。國內外較少有對優勢表位基因片段進行融合表達后方法學的建立。本研究為解決梅毒血清學篩查中假反應性問題提供了思路，為新一代的梅毒血清學診斷方法的建立提供了重要的實驗依據。