牛蛙血細(xì)胞核酸和脊髓運動神經(jīng)細(xì)胞的顯色觀察*

徐本錦，劉 玲，宣 焱，杜 淼

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，山西呂梁 032200

核酸的細(xì)胞化學(xué)染色是利用化學(xué)試劑與核酸分子反應(yīng)生成帶顏色的產(chǎn)物，從而達(dá)到對細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA定位和定性的目的，是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的重要手段。1924年有研究者發(fā)明了DNA顯色的經(jīng)典方法——福爾根反應(yīng)[1]。該反應(yīng)還可用于DNA的化學(xué)計量測定[2]、區(qū)分腫瘤性質(zhì)和判斷病變程度等[3]。甲基綠-派洛寧染色已被廣泛用于細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的顯示[4]。

牛蛙具有血細(xì)胞大[5-6]、肌肉發(fā)達(dá)、性情溫和等特點，是了解肌肉、呼吸系統(tǒng)、心臟和循環(huán)系統(tǒng)[7]結(jié)構(gòu)特征的良好材料。本研究對牛蛙血細(xì)胞中的核酸和脊髓運動神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了顯色，對實驗的注意事項進(jìn)行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1一般材料 健康牛蛙數(shù)只，染色缸，載玻片，蓋玻片，鑷子，剪刀，香柏油，擦鏡紙。

1.2儀器與試劑 儀器：普通光學(xué)顯微鏡，恒溫水浴箱。主要試劑：甲基綠-派洛寧混合液，95%乙醇，1%亮綠染液，1 mol/L HCl，Schiff試劑，1%甲苯胺藍(lán)染液。

1.3方法

1.3.1牛蛙血細(xì)胞DNA的福爾根反應(yīng)顯色 具體實驗步驟包括：(1)取材。麻醉牛蛙，將其置于一白瓷盤中，腹面朝上，沿著尾部向頭部方向依次剪開皮膚和肌肉，找到心臟。剪開心包膜，使心臟完全顯露出來，然后在心臟上剪一小口。(2)涂片。取一張干凈的載玻片，輕輕蘸取心臟血，以45°夾角在另一張干凈的載玻片上輕輕向前推，即可做成血涂片，自然晾干。(3)水解。將血涂片置于室溫下的1 mol/L HCl中水解2 min，然后置于60 ℃的1 mol/L HCl中水解8 min，再在室溫下的1 mol/L HCl中水解2 min。(4)染色。將血涂片用小流量的水沖洗，除去多余的HCl，然后在血涂片上滴加一層Schiff試劑，染色30 min，再用小流量的水沖洗，然后放入1%的亮綠染液中復(fù)染30～60 s，小流量的水沖洗后晾干。(5)鏡檢。先在低倍鏡下找到符合預(yù)期實驗結(jié)果的區(qū)域，然后在高倍鏡下觀察。(6)拍照。拍照記錄不同放大倍數(shù)的實驗結(jié)果。

1.3.2牛蛙血細(xì)胞DNA和RNA的甲基綠-派洛寧染色 具體實驗步驟包括：(1)取材，同上。(2)涂片，同上。(3)固定。在晾干的血涂片上滴加一層95%乙醇，室溫固定5 min，然后吸去乙醇再放置5 min。(4)染色。在血涂片表面滴加1層(3～4滴)甲基綠-派洛寧染液，染色20 min后用小流量的水沖洗掉多余染液，再用吸水紙吸去多余水分。(5)鏡檢。先在低倍鏡下找到符合預(yù)期結(jié)果的區(qū)域，然后在高倍鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的顏色。(6)拍照。拍照記錄不同放大倍數(shù)的顯色結(jié)果。

1.3.3牛蛙脊髓運動神經(jīng)細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色 具體實驗步驟包括：(1)取材。取小段高位脊髓，置于載玻片上用鑷子或牙簽將其搗碎。(2)染色。滴加數(shù)滴甲苯胺藍(lán)染液，染色5 min左右，然后用小流量的水洗去多余染液。(3)壓片。蓋上蓋玻片，用拇指擠壓使脊髓壓為一薄層。(4)鏡檢。先在低倍鏡下找到符合預(yù)期結(jié)果的區(qū)域，然后在高倍鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)特征。(5)拍照。拍照記錄不同放大倍數(shù)的染色結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1血細(xì)胞DNA的福爾根反應(yīng)顯色 結(jié)果顯示，福爾根反應(yīng)后細(xì)胞核呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)呈綠色(圖1A)。隨著復(fù)染時間的延長(50～60 s)，細(xì)胞質(zhì)呈暗綠色(圖1B)。當(dāng)復(fù)染時間為30 s或更短時，細(xì)胞質(zhì)變?yōu)闇\綠色(圖1C)。在顯微鏡下，還經(jīng)?？梢钥吹接行┘?xì)胞核是紅色的，有些細(xì)胞核顏色很淺或幾乎沒有紅色(圖1D～E)。這是由于局部水解不充分或不完全造成的。另外，當(dāng)復(fù)染時間大于60 s時，可以看到部分細(xì)胞質(zhì)顏色變?yōu)闇\海綠色，細(xì)胞核的紫紅色也被一定程度覆蓋了(圖1F中的黑色箭頭)。因此，福爾根反應(yīng)顯色血細(xì)胞DNA的最佳條件為室溫水解2 min，60 ℃水解8 min，再室溫水解2 min，Schiff試劑染色30 min，亮綠復(fù)染40 s。

注：A 為亮綠復(fù)染約40 s(×400)；B為亮綠復(fù)染50～60 s (×400)；C為亮綠復(fù)染約30 s(×400)；D為亮綠復(fù)染約30 s，并且部分水解不充分(×100)；E為水解不充分(×400)；F為亮綠復(fù)染60 s或更長時間(×400)。

2.2血細(xì)胞DNA和RNA同時顯色 血細(xì)胞中的DNA和RNA經(jīng)甲基綠-派洛寧染色后，可以看到細(xì)胞核變成了藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)變?yōu)榉奂t色(圖2A)或深紫色(圖2B～D)。

2.3脊髓運動神經(jīng)細(xì)胞的染色觀察 牛蛙的高位脊髓經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，可以看到單極形(圖3A，以及圖3B右上角的黑色實線箭頭)、雙極形(圖3A，以及圖3B左下角的黑色實線箭頭)或多極形(圖3A，以及圖3C～D的黑色實線箭頭)分枝且具有神經(jīng)纖維的形態(tài)較大的運動神經(jīng)細(xì)胞(深藍(lán)色)。還可以觀察到呈圓形、數(shù)目較多、形態(tài)較小的細(xì)胞，為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖3A、E，以及圖3B～D、F中的黑色虛線箭頭)。此外，在運動神經(jīng)細(xì)胞中還能看到染色很深的核仁(圖3B～D)。

注：A、C、D為×400放大倍數(shù)下的視野；B為×100放大倍數(shù)下的視野。

注：A為×100放大倍數(shù)下的視野；B～E為×400放大倍數(shù)下的視野；F為×1 000放大倍數(shù)下的視野。

3 討 論

細(xì)胞化學(xué)是研究細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分及其在細(xì)胞活動中的變化和定位的學(xué)科。核酸定位和細(xì)胞化學(xué)染色是生命科學(xué)，特別是遺傳學(xué)研究的重要手段。DNA細(xì)胞技術(shù)在評估腫瘤侵襲性方面發(fā)揮著重要作用[8]，可以為腫瘤病理分級和臨床分期提供有價值的信息。細(xì)胞化學(xué)染色不僅有助于研究細(xì)胞的代謝活動、生理功能，而且對生理和病理情況下血細(xì)胞化學(xué)成分的變化，各種類型血細(xì)胞的鑒別，某些血液病的診斷、治療及發(fā)病機(jī)制的探討均有重要意義。

福爾根反應(yīng)是一種經(jīng)典的DNA顯色方法，是DNA的特異性反應(yīng)，核染色質(zhì)和染色體能夠被顯色，而含有核糖核酸的核仁和細(xì)胞質(zhì)福爾根反應(yīng)為陰性。本研究首先利用福爾根反應(yīng)的原理對牛蛙心臟血細(xì)胞中的DNA進(jìn)行了顯色分析。結(jié)果顯示，血細(xì)胞核呈紫紅色，亮綠復(fù)染后細(xì)胞質(zhì)呈綠色(圖1A)、暗綠色(圖1B)或淺綠色(圖1C)。通過對亮綠復(fù)染時間的優(yōu)化，確定了牛蛙血細(xì)胞DNA顯色的最佳條件：室溫水解2 min，60 ℃水解8 min，再室溫水解2 min，Schiff試劑染色30 min，亮綠復(fù)染40 s。多年來，關(guān)于福爾根反應(yīng)的影響因素，雖然已有多個報道，但筆者根據(jù)自身經(jīng)驗，提出了4點注意事項：(1)血涂片的制作。以45°夾角在另一張干凈的載玻片上輕輕向前推，夾角過大或過小，都會影響血細(xì)胞在玻片上的分布、數(shù)量和形態(tài)。切勿來回多次推片，防止玻片之間的切割作用造成血細(xì)胞破裂，影響后續(xù)實驗。(2)HCl水解的時間。福爾根反應(yīng)的一個關(guān)鍵步驟是DNA經(jīng)弱酸水解，釋放出游離的醛基。如果水解不充分，嘌呤堿與脫氧核糖之間的糖苷鍵未斷裂或斷裂不完全，導(dǎo)致形成的游離醛基變少，進(jìn)而反應(yīng)變?nèi)?圖1D～E)。另外，如果水解時間過長，則可能使DNA和組蛋白過度降解，也會導(dǎo)致反應(yīng)變?nèi)?，甚至出現(xiàn)陰性結(jié)果。(3)Schiff試劑的質(zhì)量。Schiff試劑的質(zhì)量直接影響著DNA的呈色反應(yīng)，應(yīng)選用質(zhì)量好的堿性品紅來配制Schiff試劑，并注意避光保存，防止因氧化變紅而失效。(4)復(fù)染時間。亮綠復(fù)染的最適時間為40 s(圖1A)。若復(fù)染時間太短，則亮綠著色太淺，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淺綠色(圖1C)。如果復(fù)染時間太長，細(xì)胞質(zhì)的顏色就會變成淺海綠色，細(xì)胞核的紫紅色也會被一定程度覆蓋(圖1F)。福爾根反應(yīng)有助于人們理解DNA在生物學(xué)和遺傳學(xué)中的作用。此外，Schiff試劑在組織化學(xué)研究中被引入，為其他醛基染色劑的開發(fā)打下了基礎(chǔ)。

核酸的定量檢測在研究細(xì)胞生長、腫瘤生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面具有重要意義。甲基綠是一種單組分的核染料，其染色機(jī)制涉及靜電作用和非離子相互作用[9]。這種非離子反應(yīng)可能是由于染料嵌入了DNA的嘌呤和嘧啶堿之間造成的[10]。由于具有陽離子性質(zhì)，甲基綠被認(rèn)為可與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對組織或細(xì)胞內(nèi)DNA含量的可靠評估。派洛寧Y是一種陰離子染料，不僅能夠染色RNA、彈性纖維和肥大細(xì)胞顆粒，還能對硫酸黏蛋白進(jìn)行染色[11]。本研究通過甲基綠-派洛寧染色，對牛蛙血細(xì)胞中的DNA、RNA進(jìn)行了定位分析。結(jié)果顯示，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色(圖2A)或深紫色(圖2B～D)。本實驗有3個需要注意的地方：(1)固定時間。一般情況下用95%的乙醇固定10 min。實際操作時，先固定5 min，然后吸掉乙醇，再等待5 min。(2)染色時間以20 min為宜。(3)多余染料的清洗。多余的染料要用小流量的水沖洗，水流速度不宜過快，否則細(xì)胞質(zhì)的顏色會變淺(圖2C)。甲基綠-派洛寧染色法還可用于評估癌前和癌變過程中細(xì)胞核和核仁的變化[12]。此外，也可作為常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色的輔助手段來診斷惡性腫瘤[9,13]和檢測細(xì)胞凋亡[14-15]。

甲苯胺藍(lán)染色顯示脊髓運動神經(jīng)細(xì)胞具有特異性強(qiáng)，無背景著色，結(jié)果穩(wěn)定的特點[16]。本研究用甲苯胺藍(lán)染液對牛蛙的脊髓運動神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行顯色觀察，在視野中可見許多染色較深的呈單極形、雙極形和多極形分枝的運動神經(jīng)細(xì)胞(圖3A～D)。這些細(xì)胞個體較大，細(xì)胞中央較膨大，稱為胞體。此外，運動神經(jīng)細(xì)胞還具有細(xì)長的纖維狀結(jié)構(gòu)，能夠接收和傳導(dǎo)刺激，稱為神經(jīng)纖維。運動神經(jīng)細(xì)胞中也可見深藍(lán)色的核仁(圖3B～D)。還可以看到許多染色較深的小細(xì)胞，即神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本實驗有兩個需要注意的地方：(1)取材。取牛蛙高位脊髓，因為高位脊髓中的運動神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多，而低位脊髓中幾乎看不到運動神經(jīng)細(xì)胞，只能看到數(shù)量較多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。(2)壓片。一定要確保脊髓被搗碎，然后壓為一薄層，否則，只能看到很少的細(xì)胞或者幾乎看不到細(xì)胞。

綜上所述，牛蛙是研究核酸在血細(xì)胞中的定位和顯示神經(jīng)系統(tǒng)特性的良好材料。在福爾根反應(yīng)中引入亮綠復(fù)染并優(yōu)化染色時間是一種較好的方法，提高了細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)顏色的對比度，有利于進(jìn)行后續(xù)的核酸定量分析。甲基綠-派洛寧染色能同時對DNA和RNA進(jìn)行定位和定性分析。1%的甲苯胺藍(lán)染色能很好地顯示牛蛙高位脊髓中運動神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)。本文系統(tǒng)地分析和討論了這3個實驗的影響因素，對實驗過程中可能出現(xiàn)顯示不佳的結(jié)果也進(jìn)行了呈現(xiàn)和說明，并提出了操作過程中的注意事項。本研究結(jié)果可靠，可重復(fù)性好，對實驗教學(xué)、科學(xué)研究以及臨床應(yīng)用都具有一定的理論和實踐意義。