無創產前篩查中胎兒游離DNA比例的影響因素分析*

王 杰，冀小平,武麗瓊，安 槿，侯東霞，朱 博，郭志遠，張美玲，王 艷，王曉華△

1.內蒙古自治區婦幼保健院遺傳優生科，內蒙古呼和浩特 010020；2.內蒙古大學省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010021

血液中的游離DNA主要是指存在于外周血中的游離于細胞外的DNA片段，主要通過活細胞的主動釋放或凋亡、死亡細胞的被動釋放而產生，經快速降解后釋放到血循環中[1]。1997年，LO等[2]發現孕婦外周血中的游離DNA除了來源于孕婦自身外，還有極少部分是來自于胎兒，其中來源于孕婦的游離DNA占80%～95%，來源于胎兒游離DNA(cffDNA)占5%～20%。孕婦外周血中的cffDNA主要來源于穿過胎盤屏障的胎盤滋養細胞。因此，理論上當胎兒為三體時，孕婦外周血中的cffDNA也同樣為三體，這使得該染色體上孕婦外周血cffDNA比例與健康孕婦相比，明顯升高。這一發現為無創產前篩查(NIPS)技術打下了理論基礎。

由于cffDNA在孕婦外周血中占比極低，因此NIPS檢測的可靠性在很大程度上取決于所測試樣品中是否有足夠的cffDNA。一般來說，孕婦外周血cffDNA比例通常在3%～30%[3]。通常情況下，胎兒非整倍體的產前篩查要求cffDNA比例至少達4%[3]。如果孕婦外周血中的cffDNA比例過低，則可能受相對比例較高的孕婦正常DNA的影響，進而影響檢測結果的準確性，甚至造成檢測失敗。這不僅給孕婦造成了困擾，也影響了該技術在臨床中的推廣、應用。有研究提示，cffDNA比例與孕周呈正相關，與孕婦體質量、體質量指數(BMI)呈負相關，妊娠期并發癥或合并癥、孕婦年齡、孕中期唐氏篩查結果、胎兒染色體核型及頸后透明層也是潛在的影響因素[4]。本研究對在內蒙古自治區婦幼保健院進行NIPS檢測的4 268例孕婦外周血cffDNA比例與孕周、孕婦BMI、孕婦年齡、妊娠單雙胎、標本運輸時間等相關因素之間的關系進行了回顧性分析，對所有篩查對象跟蹤隨訪至胎兒出生，以探討影響cffDNA比例的因素，分析NIPS失敗的原因，為不同孕婦制訂個體化的產前遺傳學檢測方案提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年9月至2019年3月于內蒙古自治區婦幼保健院進行NIPS檢測的4 268例孕婦，孕周為11+3～36周，其中孕早期(11～12周)157例，孕中期(>12～27周)4 091例，孕晚期(>27～36周)20例；單胎4 158例(97.42%)，雙胎110例(2.58%)；孕婦年齡18～47歲，平均(31±6)歲；BMI為15.62～35.71 kg/m2,中位BMI為23.44 kg/m2。所有研究對象根據孕周、BMI、年齡、妊娠單雙胎、標本運輸時間分成不同的組別。檢測孕周不在最適檢測孕周(12+0～22+6周)的孕婦，其中<12+0周6例，>22+6周149例。由臨床醫生告知研究對象本研究的目的、方法等，研究對象均簽署知情同意書，本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1NIPS檢測方法 抽取孕婦外周靜脈血5 mL，置于cffDNA專用真空采血管(康為世紀，中國)中，分別以1 600×g及16 000×g低溫離心10 min后得到血漿標本。應用聯合探針錨定聚合測序法，按照胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒說明書操作，并借助于BGI500測序平臺進行測序，利用高分辨率成像系統及生物信息系統轉換得到待測序列。所得序列經與人參考基因組(GRCh37/hg19)比對，確定每一測序reads染色體的定位，計算得出標準化Z值。當標本滿足度量標準(有效數據量≥3.5 Mb，無擴增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)時根據標準化Z值評估檢測結果：若Z值的絕對值≥3，提示高風險；若Z值為>-3～<3，結果為低風險。

1.2.2cffDNA比例的評估方法 (1)Y染色體估算法[3]：健康女性的染色體核型為46，XX，是不含Y染色體的，也就是說一旦在孕婦血漿中檢測出了來源于Y染色體的cffDNA片段，則為cffDNA。(2)SeqFF估算法[5]：在孕婦血漿中檢測到的cffDNA并非是均勻、散在分布在染色體所有區域的。實際上，在有的染色體區域內，cffDNA占比高，而在有的染色體區域內，cffDNA占比很少。利用cffDNA這一特性，將各常染色體按照每50 kb分割成區間窗口(bin)，選出cffDNA片段為100～150 bp的bin，計算這些cffDNA片段長度較短的bin占所有bin的比例，并以GC含量、讀段數等指標作為參數，建立一個高度回歸模型，即seqFF模型，通過該模型即可估算cffDNA比例。本研究將Y染色體估算法和seqFF估算法綜合運用，評估標本中cffDNA比例。選擇3.5%作為cffDNA比例最低檢測限[6]。

1.2.3妊娠結局隨訪 查詢電子病歷記錄系統或打電話對孕婦的妊娠結局進行追蹤隨訪。隨訪內容包括胎兒或新生兒是否表現為典型的21、18、13-三體綜合征，孕婦有無流產、引產、雙胎之一消失，分娩孕周，以及新生兒出生時健康狀況、體格檢查結果、有無其他臨床診斷和(或)遺傳學診斷的異常。

2 結 果

2.1孕婦血漿cffDNA比例與孕周的相關性分析 4 268例孕婦cffDNA比例為1.025%～29.851%，中位cffDNA比例為7.392%，其中孕19+5周最低，孕30+1周最高。相關性分析發現，cffDNA比例與孕周呈正相關(r=0.113，P<0.05)。但cffDNA比例隨孕周增長的速度不一致，孕11～22周，cffDNA比例每周約增加0.2%，孕22周以后，每周約增加0.7%。見圖1。

在75例cffDNA比例<3.5%的孕婦中，孕15周cffDNA比例<3.5%的孕婦比例最低，為0.41%(2/493)，孕19周cffDNA比例<3.5%的孕婦比例最高，為3.36%(11/327)。cffDNA比例<3.5%的孕婦的孕周比較，各組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

注：曲線為spline擬合曲線。

圖1 cffDNA比例與孕周的相關性 表1 cffDNA比例<3.5%的孕婦在不同孕周的分布[n(%)]

2.2孕婦血漿cffDNA比例與BMI的相關性分析 相關性分析發現，cffDNA比例與BMI呈負相關(r=-0.261，P<0.05)。依據世界衛生組織(WHO)制定的BMI界限值，將孕婦按照BMI分為4組：低體質量組(BMI<18.50 kg/m2)、正常體質量組(BMI為18.50～<25.00 kg/m2)、超重組(BMI為25.00～<30.00 kg/m2)和肥胖組(BMI≥30.00 kg/m2)。低體質量組、正常體質量組、超重組和肥胖組平均cffDNA比例分別為9.26%、8.29%、7.26%、6.29%，各組之間差異有統計學意義(P<0.05)，隨著BMI的升高，cffDNA比例明顯降低。見圖2。

注：曲線為spline擬合曲線。

2.3孕婦血漿cffDNA比例與孕婦年齡的相關性分析 相關性分析發現，cffDNA比例與孕婦年齡呈負相關(r=-0.088，P<0.05)。根據孕婦年齡，將孕婦分為高齡組(≥35歲)和低齡組(<35歲)，高齡組、低齡組平均cffDNA比例分別為7.57%、8.11%，經單因素分析后得出兩組之間差異有統計學意義(P<0.05)，隨著年齡的升高，cffDNA比例明顯降低。見圖3。

注：曲線為spline擬合曲線。

2.4孕婦血漿cffDNA比例與妊娠單雙胎的相關性分析 單胎組、雙胎組平均cffDNA比例分別為7.92%、8.47%。經單因素分析后得出兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)。經相關性分析，妊娠單雙胎與cffDNA比例無相關性(r=0.025,P>0.05)。

2.5孕婦血漿cffDNA比例與標本運輸時間的相關性分析 使用cffDNA專用采血管采集全血，按照相關標準運輸，放置于6～35 ℃環境中，96 h內運送至實驗室并處理。將運輸時間分為4組：<24 h組、24～<48 h組、48～<72 h、72～<96 h組。各組平均cffDNA比例分別為7.92%、7.83%、8.05%、8.14%。經單因素分析后得出4組之間差異無統計學意義(P>0.05)。經相關性分析，標本運輸時間與cffDNA比例無相關性(r=0.021，P>0.05)。見圖4。

圖4 cffDNA比例與運輸時間的相關性

2.6cffDNA比例<3.5%的標本重新采血后的檢測結果 對16例cffDNA比例<3.5%的標本(孕12+5～19+4周)進行了重新取樣檢測，中位間隔時間為17.1 d。其中8例標本經重新取樣檢測后cffDNA比例>3.5%，中位間隔時間17.3 d；另有8例標本經重新取樣檢測后cffDNA比例依舊<3.5%，中位取樣間隔時間16.9 d，這8例孕婦超重3例，肥胖2例。經隨訪，妊娠結局均未發現明顯異常。

3 討 論

近年來，隨著高通量測序技術的成熟及測序成本的不斷降低，基于孕婦外周血cffDNA的NIPS技術越來越多地被應用于胎兒染色體數目異常相關疾病的檢測。NIPS技術要有效地檢測出胎兒染色體數目異常，cffDNA比例十分重要[7]。

研究表明，cffDNA比例受孕婦和胎兒兩方面因素的影響，孕婦因素包括孕周、體質量、妊娠期并發癥或合并癥、年齡、孕中期唐氏綜合征血清學篩查的危險系數、血清妊娠相關蛋白A和游離β-人絨毛膜促性腺激素的變化[8]。其中cffDNA比例與孕周呈正相關，與孕婦BMI呈負相關。胎兒因素包括胎兒的單胎或多胎、胎兒染色體核型及胎兒頸后透明層厚度等，這些也是潛在的影響因素[4,7,9]。此外，標本運輸時間或實驗室提取方法的差異也會對cffDNA比例產生一定影響。

3.1孕婦自身因素對cffDNA比例的影響 在本研究中cffDNA比例與孕婦采血時的孕周呈正相關。隨著孕周的增加，胎盤體積逐漸增大，凋亡的滋養層細胞增多，因此釋放到孕婦血液中的DNA片段增加。但是本研究發現，cffDNA比例在不同孕周增長速度不一致，孕11～22周，cffDNA比例每周約增加0.2%，22周以后，每周約增加0.7%，這與之前報道的在孕10～21周,cffDNA每周約增加0.1%，21周后,每周約增加1.0%類似[10]。在孕19周時，cffDNA比例<3.5%的比例相對較高，較少見相關的報道。

本研究還發現cffDNA比例與孕婦BMI之間存在負相關性，與之前的研究結果一致[11]。可能的原因是受到孕婦血液中總體游離DNA水平的影響，隨著孕婦體質量的增加，血容量增加，導致血液中的總體游離DNA水平升高，從而稀釋了外周血中的cffDNA，使cffDNA比例降低。另一方面，由于肥胖孕婦具有的更多的脂肪組織，可通過脂肪細胞壞死或基底層的血管組織凋亡進行活躍的脂肪重建。脂肪細胞裂解后，cffDNA釋放入血，從而導致血中來源于孕婦的DNA含量更高，而cffDNA含量不變,因此導致cffDNA比例更低[12]。針對高BMI對cffDNA比例的影響，2016年美國醫學遺傳學與基因組學學會指南指出，肥胖孕婦外周血中的cffDNA比例通常較低，建議肥胖孕婦直接使用傳統篩查方法，而不采用NIPS。我國的相關技術規范也將肥胖孕婦列入NIPS慎用人群。與年齡的相關性分析發現，cffDNA比例與孕婦年齡呈負相關，與HOU等[11]的研究結果相符。

3.2妊娠單雙胎及運輸時間對cffDNA比例的影響 本研究發現，適宜孕周內的妊娠單雙胎以及按照采血管要求的運輸條件下的運輸時間與cffDNA比例無相關性。這一發現對于地廣人稀，東西、南北跨度均較大的內蒙古地區至關重要，在合適的運輸條件下96 h內cffDNA比例沒有明顯差異，有助于偏遠地區標本的收集及檢測，為NIPS在欠發達地區的普及提供可能。

3.3cffDNA比例<3.5%的標本2次采樣的可行性評估 對首次檢查發現cffDNA比例低的孕婦建議重新采血進行第二次檢測，有50%的孕婦經第2次檢測后會得到結果，這與之前的研究結果一致[13-14]。二次采血后cffDNA仍偏低的標本中BMI≥25.00 kg/m2的占65.5%(5/8)，推測在最適的檢測孕周，BMI是影響cffDNA比例的主要因素。另有3例BMI在正常范圍的孕婦cffDNA比例仍<3.5%，可能是受其他因素的影響。目前對于重新采血時機的選擇及再次行NIPS獲得結果的可能性尚未達成共識，因為重新采血時，隨著孕周的增加，孕婦體質量和BMI也會增加。美國醫學遺傳與基因組學學會在2016年發布的關于NIPS在胎兒染色體非整倍體疾病篩查的應用指南中建議：如果孕婦是在合適的檢測孕周出現了cffDNA比例低導致NIPS失敗，可建議孕婦直接進行產前診斷，而不是重新采血再次進行NIPS檢測[15]。我國目前多采用先重新采血檢測，而不直接進行有創產前診斷，對于第2次NIPS失敗的孕婦，建議接受進一步的遺傳咨詢、全面的超聲評估和產前診斷[16]。

綜上所述，孕周越小、BMI越大、年齡越大，cffDNA比例越低，NIPS的失敗率越高。因此，臨床需要告知孕婦相關風險，可根據篩查對象的BMI、年齡、孕周制訂個體化的采血時間，對于肥胖、年齡較大的孕婦可適當將篩查孕周后移。對首次采血cffDNA比例未達標的標本，可以先進行重新采血檢測，對于第2次NIPS失敗的孕婦，建議接受進一步的遺傳咨詢、全面的超聲評估和產前診斷，并對胎兒結局進行隨訪。仍有一部分cffDNA比例低導致NIPS失敗的孕婦，具體原因不明，后續關于胎兒染色體核型、孕期并發癥/合并癥、重新采血時機和其他影響cffDNA比例因素的研究需要進一步完善。同時，也需要不斷研究新的cffDNA富集方法，提高cffDNA比例，不斷提高NIPS的檢出率。