GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值*

陳小娟，趙珍珍，向 尹，應(yīng)斌武△

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041；2.樂山市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,四川樂山 614000

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病，嚴(yán)重危害人類健康，是全球十大死亡原因之一，也是引起死亡人數(shù)最多的單一傳染性疾病[1]。早期診斷、及時(shí)抗結(jié)核治療對(duì)患者預(yù)后及預(yù)防MTB的傳播至關(guān)重要。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法如涂片抗酸染色查找MTB、MTB培養(yǎng)等均存在各自的缺點(diǎn)。有研究報(bào)道，涂片抗酸染色顯微鏡檢查只能檢出每毫升>10 000個(gè)抗酸桿菌的標(biāo)本[2]，靈敏度低；而作為金標(biāo)準(zhǔn)的MTB培養(yǎng)法耗時(shí)長,不能滿足臨床對(duì)結(jié)核病早期診斷和治療的需求。因此,臨床迫切需要快速、敏感、特異的MTB感染診斷方法。GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)(簡稱GeneXpert MTB/RIF)利用巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，通過檢測(cè)MTB編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因的81 bp利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)是否突變,進(jìn)而輔助診斷MTB感染及利福平耐藥,能在2 h內(nèi)完成檢測(cè)[3]。GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)MTB的靈敏度高,其檢出限為131 CFU/mL,遠(yuǎn)低于抗酸染色[4]。2010年世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦GeneXpert MTB/RIF用于肺結(jié)核的診斷[5],并在2013年推薦其用于肺外結(jié)核的診斷[6]。然而,GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值在不同地區(qū)之間報(bào)道存在差異[7]。本文旨在評(píng)價(jià)我國西南地區(qū)GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 連續(xù)收集2020年7—9月四川大學(xué)華西醫(yī)院收治的臨床高度疑似結(jié)核病的住院患者，排除人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性及臨床資料不全者，最終納入401例患者為研究對(duì)象。根據(jù)結(jié)核病復(fù)合診斷標(biāo)準(zhǔn)(CRS)，分為結(jié)核組(186例)和非結(jié)核組(215例)。所有研究對(duì)象中男242例,女159例,平均年齡(50.15±17.63)歲。MTB檢測(cè)標(biāo)本來自患者的痰液117例，肺泡灌洗液173例，胸腔積液及腹水52例，腦脊液16例，贅生物(組織)13例，穿刺液19例，尿液11例，均進(jìn)行抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸(TB-DNA)熒光定量PCR及GeneXpert MTB/RIF 3項(xiàng)檢測(cè)。同時(shí)對(duì)所有患者抽取靜脈血行結(jié)核感染T細(xì)胞γ-干擾素釋放試驗(yàn)(TB-IGRA)。以臨床最終診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)4種檢測(cè)方法的檢出率、靈敏度、特異度等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)GeneXpert MTB/RIF對(duì)結(jié)核病的診斷效能。本研究由四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過[審批號(hào)：2019年審(829)號(hào)]，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)我國肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)和結(jié)核病分類標(biāo)準(zhǔn)(WS196-2017)，具有典型的結(jié)核病臨床癥狀，且至少符合以下幾項(xiàng)之一：(1)MTB病原學(xué)檢測(cè)陽性；(2)病理學(xué)診斷支持結(jié)核病變；(3)影像學(xué)檢查有活動(dòng)性結(jié)核病的證據(jù)；(4)兩次以上TB-IGRA陽性且抗結(jié)核治療有效。

1.2儀器與試劑 本研究使用美國Cepheid公司的GeneXpert MTB/RIF及配套試劑，德國凱杰(QIAGEN)公司的TB-DNA試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀型號(hào)為ABI QuantStudio5，MTB抗酸染色使用珠海貝索生物有限公司生產(chǎn)的染液。

1.3方法

1.3.1MTB涂片抗酸染色 按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范及試劑說明書進(jìn)行涂片抗酸染色后于顯微鏡(油鏡)下觀察計(jì)數(shù),每100個(gè)視野可見抗酸桿菌3條及以上為陽性。

1.3.2TB-DNA熒光定量PCR 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行標(biāo)本前處理及核酸提取后,PCR反應(yīng)混合液按照每測(cè)試37.8 μL PCR反應(yīng)液，0.2 μL Taq酶和0.06 μL尿嘧啶糖基化酶的比例配制，從中取38.0 μL與2.0 μL已提取的標(biāo)本DNA混合，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：37 ℃ 3 min，93 ℃ 1 min，93 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s(40個(gè)循環(huán))。反應(yīng)體系為40.0 μL。

1.3.3GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè) 在生物安全柜內(nèi)按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范操作,在前處理管中視標(biāo)本性狀將標(biāo)本與標(biāo)配的處理液按1∶2的比例混合(若標(biāo)本較濃稠則按≥1∶3的比例混合;腦脊液或相對(duì)清亮的漿膜腔積液可不處理直接檢測(cè)),漩渦震蕩后靜置15 min，標(biāo)本充分液化后取2.0～2.5 mL加入GeneXpert檢測(cè)匣，于GeneXpert MTB/RIF進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間約2 h。

1.3.4TB-IGRA檢測(cè) 按照結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(體外釋放酶聯(lián)免疫法)說明書,采集患者4 mL肝素抗凝血,在2 h內(nèi)將患者全血標(biāo)本輕柔顛倒混勻5次后取1 mL分裝到本底對(duì)照培養(yǎng)管(N)、測(cè)試培養(yǎng)管(T)、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(P)培養(yǎng)基，迅速放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)(22±2)h后，將培養(yǎng)管于3 000～5 000 r/min離心機(jī)中離心10 min,取血漿進(jìn)行ELISA檢測(cè),計(jì)算γ-干擾素(IFN-γ)水平。結(jié)果判定:T-N≥14 pg/mL為陽性,<14 pg/mL為陰性。如果校準(zhǔn)品400 pg/mL的平均A值<1.0或試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)劑量-反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r<0.990 0,則試驗(yàn)無效，需重復(fù)試驗(yàn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，各方法檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以檢出率、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值描述各檢測(cè)方法的診斷效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MTB在不同類型標(biāo)本的檢出情況 在結(jié)核組，GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)各類標(biāo)本情況如下：痰液檢出率為51.85%；肺泡灌洗液檢出率為43.59%；胸腔積液及腹水檢出率為11.11%；腦脊液檢出率為22.22%；贅生物(組織)檢出率為50.00%；穿刺液檢出率為42.86%；尿液檢出率40.00%。見表1。

2.2各檢測(cè)方法的診斷效能評(píng)估 本研究納入的401例疑似結(jié)核病患者，臨床最終診斷結(jié)果為結(jié)核病186例，非結(jié)核病215例。各方法檢測(cè)結(jié)核組和非結(jié)核組的結(jié)果見表2。在MTB的檢測(cè)技術(shù)中,GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR的檢出率分別為19.45%、6.73%、18.45%，其中3例TB-DNA熒光定量PCR陽性患者臨床最終診斷為非結(jié)核病，1例抗酸染色陽性患者最終診斷為非MTB感染。在患者全血標(biāo)本TB-IGRA檢測(cè)中,檢出陽性235例，檢出率為58.60%(235/401)。以臨床最終診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA 4種方法診斷結(jié)核病的靈敏度分別為41.94%、13.98%、38.17%、69.35%，特異度分別為100.00%、99.53%、98.60%、50.70%，陽性預(yù)測(cè)值分別為100.00%、96.30%、95.95%、54.89%，陰性預(yù)測(cè)值分別為66.56%、57.22%、64.83%、65.66%。結(jié)果顯示：在結(jié)核組，GeneXpert MTB/RIF檢出陽性78例，靈敏度為41.94%，較抗酸染色(13.98%)明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.090,P<0.05)，而與TB-DNA熒光定量PCR(38.17%)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.549,P=0.459)；TB-IGRA檢出陽性129例，靈敏度為69.35%，較其他3種方法靈敏度明顯提高(χ2=118.764,P<0.05),但其在非結(jié)核組檢出陽性106例，陰性109例，特異度為50.70%，明顯低于其他3種方法(χ2=342.791,P<0.001)。

表1 結(jié)核組和非結(jié)核組的各類型標(biāo)本MTB檢出情況[%(n/n)]

表2 GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA診斷結(jié)核的效能比較

續(xù)表2 GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA診斷結(jié)核的效能比較

2.3GeneXpert MTB/RIF對(duì)利福平耐藥的檢測(cè) 在78例GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)陽性的患者中，檢出利福平耐藥共7例，其中2例為痰液標(biāo)本，2例為肺泡灌洗液標(biāo)本，1例為胸腔積液標(biāo)本，2例為穿刺液標(biāo)本，臨床據(jù)此結(jié)果對(duì)上述7例患者行表型藥敏試驗(yàn)后均診斷為利福平耐藥。

3 討 論

GeneXpert MTB/RIF可同時(shí)進(jìn)行MTB及利福平耐藥檢測(cè)，是集標(biāo)本處理、PCR擴(kuò)增于一體的全封閉自動(dòng)化分子檢測(cè)平臺(tái)。近年來,基于其具有靈敏度高、特異度高、生物安全性高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被用于肺內(nèi)及肺外結(jié)核標(biāo)本中MTB及利福平耐藥檢測(cè)、臨床分離的MTB菌株的檢測(cè)等,并成為WHO推薦的MTB分子檢測(cè)技術(shù)[8-9]。

本研究通過比較GeneXpert MTB/RIF與抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA檢測(cè)的靈敏度和特異度等指標(biāo),初步探討其在診斷結(jié)核感染方面的應(yīng)用價(jià)值。本研究中,GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA的檢測(cè)靈敏度分別為41.94%、13.98%、38.17%、69.35%,特異度分別為100.00%、99.53%、98.60%、50.70%。結(jié)果顯示，在特異度方面GeneXpert MTB/RIF為100.00%，優(yōu)于其他3種方法。抗酸染色特異度雖也較高，但其靈敏度較低，且檢測(cè)陽性者需進(jìn)一步行分枝桿菌菌種鑒定，如本研究中1例抗酸染色陽性患者最終診斷為非MTB感染。靈敏度方面，GeneXpert MTB/RIF僅次于TB-IGRA，但TB-IGRA檢測(cè)基于免疫學(xué)原理，結(jié)果依賴于患者的免疫狀態(tài)，DRUSZCZYNSKA等[10]報(bào)道，既往感染MTB及長期暴露于MTB環(huán)境中均可導(dǎo)致TB-IGRA結(jié)果不完全可靠。本研究中TB-IGRA的特異度為50.70%，較文獻(xiàn)[11]報(bào)道的65.80%更低，這可能與研究對(duì)象年齡、性別、免疫狀態(tài)及病毒感染狀態(tài)有關(guān)，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。從檢測(cè)平臺(tái)的易用性來看，GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)快速、簡便，對(duì)試驗(yàn)條件要求低且不易污染。本研究中TB-DNA熒光定量PCR在非結(jié)核組檢出3例假陽性，可能是操作過程中的污染造成的(TB-DNA熒光定量PCR檢測(cè)手工操作煩瑣、對(duì)試驗(yàn)條件要求高且容易造成交叉污染)。此外，GeneXpert MTB/RIF在利福平耐藥檢測(cè)方面，雖然本次研究病例較少，檢出耐藥患者7例，但均與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符，表明其具有較好的臨床用藥指導(dǎo)價(jià)值。

另外,通過比較GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)不同類型標(biāo)本中的MTB檢出率,分析不同類型標(biāo)本對(duì)診斷結(jié)核的影響。本研究中,GeneXpert MTB/RIF在痰液中檢出率最高(51.85%),其次是贅生物(組織)(50.00%),而其在胸腔積液及腹水中檢出率最低(11.11%),這與ALLAHYARTORKAMAN等[12]的研究結(jié)果相符。本研究中GeneXpert MTB/RIF在腦脊液中靈敏度低于DENKINGER等[13]和GARG[14]的報(bào)道,可能與腦脊液含菌量較低有關(guān)。本研究顯示,GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)與涂片抗酸染色鏡檢、TB-DNA熒光定量PCR檢測(cè)相比,在幾種肺外結(jié)核標(biāo)本如腦脊液、胸腔積液及腹水、穿刺液中均具有更高的檢出率,這也與多項(xiàng)同類研究結(jié)果相似[13,15]。因此,GeneXpert MTB/RIF在本研究的4種檢測(cè)方法中,對(duì)肺結(jié)核和肺外結(jié)核均具有更高的診斷效能。但由于本研究病例較少,結(jié)果存在一定局限性,接下來應(yīng)擴(kuò)大樣本量并將MTB培養(yǎng)及MTB表型藥敏試驗(yàn)加入研究中。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核病診斷中具有較好的應(yīng)用價(jià)值，有助于臨床醫(yī)生對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行早期、快速的診斷。