基于不同酸堿值與培養養分差異的螺旋藻擴殖生產優化研究

方鑫源 ，鄭皓遠 ，2，3

（1.三明學院海峽理工學院，福建 三明 365004；2.三明學院資源與化工學院，福建 三明 365004；3.藥用植物開發利用福建省高校工程研究中心，福建 三明 365004）

螺旋藻是微藻之一，同時也是第三代生質能源發展所使用的主要藻種。螺旋藻是一種低等的多細胞生物，無成形細胞核，屬原核生物，因其外觀排列成螺旋狀而得名螺旋藻，是由法國科學家克里門特博士于20 世紀60 年代在非洲探險時所發現[1]。螺旋藻易于培養且生長繁殖非常迅速。其生長繁殖方式主要以營養繁殖為主，工業培養時，一般在低濃度條件下，給予其適宜生長環境，經歷3～5 d 的時間，其數量就能增長約一倍[2]。螺旋藻既能進行光合作用，又是很多底層動物重要的食物來源，而且它還能提供一些具有抗氧化作用的色素蛋白[3]。例如蝦紅素（也叫蝦青素）是最強的天然抗氧化劑之一，抗氧化性極強，近年來被廣泛應用于抗氧化性、抗腫瘤等多種領域[4-5]。但其實蝦體內的蝦青素是蝦通過攝取一些含有蝦紅素的藻類累積在體內的。有一些蝦的蝦青素已被證明是與紅體相關的主要類胡蘿卜素，例如黑虎蝦（Penaeus monodon，也叫斑節蝦）的顏色[6]。

螺旋藻的藻體包含大量的蛋白質（含量約為55%～70%），是人類至今發現的蛋白質含量最高的生物[7-8]。螺旋藻包含的豐富的蛋白質和色素蛋白是天然的優質蛋白源，長期服用螺旋藻可以提高人體免疫力[9]。早前也有許多商家將其添加到魚類、禽類飼料中，用以代替蛋白源[10]。

今天，螺旋藻因其具有很多方面的優點，已被廣泛應用在很多方面，養殖和加工螺旋藻已經成為一個現代化的大產業[11]。螺旋藻在未來仍具有很大的發展空間，相信螺旋藻憑借著它多方面的優點和科學技術的不斷發展會越來越受人們的重視，以后的螺旋藻產品會越來越多樣化，出現在我們的日常生活中[12]。

但是現如今在工業的培養上，螺旋藻的生產成本仍舊較高，而許多廠家由于缺乏后續的處理加工過程，其主要的利潤都來源于售賣螺旋藻的干粉，導致利潤較低[13]。因此，該試驗研究的主要目的是為了改善螺旋藻的培養條件，希望通過試驗控制法探究不同的影響螺旋藻生長的條件，借此找到能夠提高螺旋藻產量、降低螺旋藻生產成本的方法，用以提高培養螺旋藻的經濟效益。

1 材料與方法

1.1 化學試劑

HCl；NaOH；NaCl；NaHCO3；MgSO4·6H2O；FeSO4·6H2O；K2SO4；CaCl2·2H2O；NaNO3；K2HPO4；EDTA；H3BO3；ZnSO4·7H2O；MnCl2·4H2O；CoCl2·6H2O；CuSO4·5H2O；Mo7O24（NH4）6·4H2O；

1.2 試驗藻種

該試驗藻種為鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），在分類上屬植物界，藍藻門，藍藻綱，斷殖藻目，顫藻科，螺旋藻屬。

1.3 螺旋藻干重檢量線制作[14]

分別用吸管吸取高濃度的螺旋藻種藻液10 次，使用分光光度計，在660 nm 處測定，將其分別稀釋至 0.1～1.0 吸光度（OD 值），并分別記錄其吸光度。用吸管吸取10 種不同吸光值的藻液各30 mL，使用高速離心機，分別于4 500 r/min、離心力24 g下離心20 min，去上清后，加入15 mL 逆滲透水，混勻后，于4 500 r/min、離心力24 g 下繼續離心20 min，洗去其他雜質，去上清，于35 ℃的烘干機中烘干24 h，并取出稱重。記錄數據，并表格與制作檢量線，用EXCEL 表格求其OD 值與其干重的關系方程式。

1.4 不同起始pH 值的螺旋藻培養

1.4.1 螺旋藻培養液配置[14]按表1 的成分比例配置螺旋藻營養液，并滅菌備用。

表1 螺旋藻培養液配方

1.4.2 微量元素溶液配置 按表2 的成分比例配置螺旋藻微量元素溶液。

螺旋藻培養液是以營養液與微量元素溶液之比為1 000∶1 的比例配置而成。

1.4.3 滅菌前處理

取6 根容量為150 mL 的光反應器，與配置完成的螺旋藻培養液一起置于高溫高壓滅菌鍋中（121 ℃，0.12 MPa）滅菌 20 min。

表2 微量元素溶液配置表

1.4.4 藻種配置

吸取50 mL 高濃度的螺旋藻藻種，以冷卻后的螺旋藻培養液稀釋，用分光光度計在660 nm 波長處測量，調整螺旋藻液初始的OD 值約為0.15。

1.4.5 pH 值調整[15]

取600 mL 配置好的螺旋藻液平均分為6 份，分別倒入6 根光反應器中，使用水質檢測儀檢測其pH 值，用滴管緩慢滴加NaOH 溶液與鹽酸溶液，分別調整6 根光反應器中螺旋藻液的pH 值為7、8、9、10、11 和 12。

1.4.6 其他條件設置

用照度計測量，調整整個培養裝置的光照強度為3 000 lx，調整空氣幫浦空氣流速為400 cc/min，對螺旋藻進行24 h 不間斷光照培養，每隔24 h 分別取樣使用分光光度計在660 nm 波長處測定其OD 值，并記錄，制作成OD 值變化表。

1.5 不同起始生質濃度的螺旋藻培養

取2 份300 mL 培養液，加入螺旋藻藻液混勻后使用分光光度計在660 nm 波長處測定其OD 值并分別調整至其OD 值約0.15 和1.50 后，分別放入6 根光反應器中。不調整其pH 值（原始pH 值為9.10）。并保持其他條件與1.4 試驗條件一致，并每隔24 h 取樣，使用分光光度計在660 nm 的波長處測定其OD 值，并記錄，制作成OD 值變化表。螺旋藻培養裝置、螺旋藻培養液的配置方法、滅菌前處理步驟皆與前述試驗步驟一致。

1.6 不同比例培養基濃度的螺旋藻培養

用1 g/L 的NaCl 溶液，與培養基混合分別調配成培養基含量為1/2 濃度以及3/4 濃度的培養基各300 mL，加入高濃度的藻種，混合均勻后在660 nm處測量其OD 值，調整其OD 值到0.15 左右。各取100 mL 分別放入6 根光反應器中，其他條件與之前對照培養時一致。每隔24 h 取樣，用分光光度計在660 nm 的波長下測量并記錄其OD 值變化。并與1.4 試驗中螺旋藻的起始OD 值為0.15 左右的試驗組進行對照，比較其差異。螺旋藻培養裝置的設置、螺旋藻培養液的配置方法、滅菌前處理步驟、其他條件的設置皆與1.4 試驗步驟一致，不調整其pH 值。

2 結果與討論

2.1 螺旋藻干重檢量線制作

螺旋藻干重稱量數據見表3。由圖1 螺旋藻干重檢量線可知得到的檢量線的R 平方值為0.980 5，具有較高的可信度。

藻干重與檢量線的關系為每30 mL 藻液的藻干重=0.213×OD-0.021，單位為 g。

每毫升螺旋藻的干重（g）=（OD 值×0.213-0.021）÷30×體積（mL）

表3 螺旋藻干重稱量數據

圖1 螺旋藻干重檢量線圖

2.2 不同起始pH 值的螺旋藻培養

如圖2 所示，螺旋藻在初始pH 值為12 的情況下，生長的狀況非常差，藻液偏黃（螺旋藻大量死亡），只有些許綠色。初始pH 值為7～11 的情況對螺旋藻的生長影響較不明顯。剛開始進行培養時，不同pH 值環境的螺旋藻液并沒什么明顯差異，培養14 d 后，初始 pH 值為 7～11 的 5 個試驗組的螺旋藻液顏色外觀差異不大，而初始pH 值為12 的試驗組的螺旋藻液較其他試驗組明顯顏色偏淡（螺旋藻密度低）。因螺旋藻培養液的初始pH 值在9.10 左右，相對來說堿性不高，而初始pH 值處于7～11 對螺旋藻的生長影響較不明顯。

圖2 不同起始pH 值培養后的螺旋藻OD 值變化圖

2.3 不同起始生質濃度的螺旋藻培養

圖3 所見，指出初始培養OD 值為0.161 的也就是1～3 號光反應器，從開始培養至第12 天，每天的OD 值都有一定程度的增長。而初始培養OD值為1.538 的也就是4～6 號光反應器，在培養的前8 d 內，螺旋藻的濃度有明顯的增長，而在培養了8 d之后，螺旋藻的OD 值趨于穩定，沒有明顯的增長。

圖3 不同起始濃度值培養后的螺旋藻平均OD 值變化圖

2.4 不同比例的培養基濃度螺旋藻培養

如圖4 不同比例的培養基螺旋藻平均OD 值變化圖指出，在前6 d 的培養中，1/2 培養基的螺旋藻OD 值增長速度與正常培養基的螺旋藻OD 值增長速度接近，而3/4 培養基的螺旋藻的OD 值增長速度則要比正常培養基的螺旋藻OD 值增長速度要快。在第6 天至第12 天的培養中，1/2 培養基的螺旋藻OD 值增長速度已經開始明顯慢于其他兩組，而3/4 培養基的螺旋藻OD 值增長速度與正常培養基的螺旋藻OD 值增長速度非常接近。在培養了12 d 之后，3/4 培養基的螺旋藻液OD 值基本已不再有持續的增長，保持相對穩定在2.8 左右，到培養的第17 天時，藻的OD 值仍然只有2.85，而正常培養基的螺旋藻OD 值仍在持續增長，并在培養的第17 天增長到了3.955。

從試驗結果我們可以知道，3/4 比例的培養基雖然最終的螺旋藻OD 值只能達到2.8 左右，比不上正常的培養基，但其完全可以在前12 d 的螺旋藻培養中替代正常培養基使用（工業培養的螺旋藻一般在螺旋藻生長對數期的低OD 值階段收獲，此時螺旋藻的生長速度最快最有經濟效益），這種將鹽水與培養基以1∶3 的比例混合而成作為螺旋藻培養基的做法若是可以實行，那在工業的培養上可以節省約1/4 的培養基原料成本，這對降低螺旋藻工業培養的成本有很大的利用價值。而1/2 比例的培養基雖然在前6 d 的OD 值增長與正常培養基的OD 值增長速率近似，但其在第六天之后OD 值的增長速率太慢，且其最后的OD 值也比另外兩組要低不少，在工業的培養上可以說是沒有太大的利用價值。

圖4 不同比例的培養基螺旋藻平均OD 值變化圖

3 結論

研究前期，先對螺旋藻分別在初始pH 值為7～12 的不同環境下進行光照強度為3 000 Lux、24 h光照培養研究，培養時間為14 d。研究結果發現除初始pH 值為12 的高堿性環境不適合用在螺旋藻的培養，其他7～11 的pH 值對螺旋藻的生長無較大影響。故不再繼續進行關于初始pH 值的的探討。后續研究，進行初始生質濃度不同的螺旋藻培養，最終螺旋藻藻液的OD 值相差不大，這也表明正常培養時，培養液存在營養過剩的狀況，有望通過稀釋培養基的比例來降低其培養成本。第三階段研究使用1/2、3/4 兩種不同濃度比例的培養基進行螺旋藻培養，并與第二階段研究中的正常培養基的培養結果進行對比。結果表明，3/4 比例的培養基可以替代正常培養基進行螺旋藻的前期培養，以此來降低培養成本。但到了培養后期3/4 比例培養基螺旋藻的生長速度及最高生質濃度均不如正常培養基。而1/2 比例的培養基雖然在前6 d 的培養中不會比正常的培養基差，但在后續的培養中其螺旋藻的生長速率及最高生質濃度明顯低于另外兩組，所以利用價值較低。

4 致謝

感謝“福建省中青年教師教育科研項目（JT180493）”以及“福建省科技特派員（明財（教）指（2018）135號）”等項目資助完成研究。