中國豫北漢族人群心腦血管疾病患者血管生成素樣蛋白4(rs4076317、rs1044250)基因多態(tài)性與脂類代謝的關系

王利強，張俊河 ，姚風芹，周紹娟，陳瑞鋒，胡蓉蓉

(1.濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院 a.精準醫(yī)學實驗室；b.病案管理科；c.體檢中心；d.心內科；e.神經康復科，河南 安陽 455000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

我國心腦血管疾病患病率和死亡率非常高，居我國所有疾病分類中的首位，嚴重危害人類生命健康[1]。早發(fā)現、早診斷、早治療是降低心腦血管疾病發(fā)生和死亡的有效措施。多年來，國內外研究早有發(fā)現，心腦血管疾病與脂代謝、基因、環(huán)境因素等密切相關[2-3]。血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4)是一類新發(fā)現的血管蛋白因子，參與脂蛋白代謝調節(jié)，對血管生成具有促進作用[4]。據有關文獻報道，ANGPTL4rs4076317和rs1044250基因位點，與脂蛋白代謝密切相關，在心腦血管疾病動脈粥樣硬化形成中具有重要作用[5-6]。國內外文獻研究報道，ANGPTL4基因多態(tài)性與脂代謝和心腦血管疾病患者的關系研究結果并不一致[7-10]，國內對ANGPTL4基因多態(tài)性與心腦血管疾病的關系研究頗少，楊茜等[11]報道心腦血管疾病組rs4076317、rs1044250與血脂無相關性。我國豫北漢族人群心腦血管疾病患者和健康人群ANGPTL4rs4076317、rs1044250多態(tài)性分布頻率如何，以及和心腦血管疾病患者脂代謝的關系具體怎么樣，均有待進一步研究證實。本研究通過檢測ANGPTL4rs4076317、rs1044250兩個基因位點多態(tài)性，探討ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因位點多態(tài)性在豫北漢族人群心腦血管疾病患者和健康人群中的分布頻率，進一步分析漢族人群心腦血管疾病患者脂代謝特點，以及ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因多態(tài)性與脂代謝特點的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料將安陽地區(qū)醫(yī)院2018年12月至2019年12月收治的143例冠心病(coronary heart disease，CAD)住院漢族患者作為CAD組，其中男73例，女70例，平均年齡(59.0±10.6)歲。將安陽地區(qū)醫(yī)院2018年12月至2019年12月收治的130例缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)住院漢族患者作為IS組，其中男67例，女63例，平均年齡(61.7±10.4)歲。將安陽地區(qū)醫(yī)院2018年12月至2019年12月漢族健康體檢者115例作為對照組，其中男59例，女56例，平均年齡(60.5±15.3)歲。本研究共納入研究對象388例，均選自豫北漢族人群。3組研究對象性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：(1)全部病例均為安陽地區(qū)醫(yī)院住院確診病例，具有典型的臨床癥狀、體征和完善的檢查資料；(2)入組對象無傳染病、腫瘤、血液病史等。入組研究對象均知情同意，且本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準通過。

1.2 檢測方法

1.2.1血脂水平 測定總膽固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平。采用分離膠促凝管采集研究對象靜脈血液4 mL后，室溫放置30 min后，600×g離心5 min后取上清液，采用貝克曼全自動生化分析儀(Beckman Coulter Inc.，USA)分析，所用試劑盒為貝克曼配套試劑盒(Beckman Coulter Inc.，USA)。

1.2.2DNA提取 采集研究對象早晨空腹EDTA-K2抗凝血2 mL，按照DNA提取試劑盒(北京索萊寶公司)操作步驟進行提取，提取完畢，均經電泳驗證總DNA提取合格。

1.2.3rs4076317、rs1044250基因位點引物設計和PCR目的片段擴增 設計PCR擴增目的片段引物，引物序列由上海生工生物技術公司合成。見表1。取1.2.2中血液中提取的總DNA，使用PCR儀(西安天隆DTC)擴增目的片段，設置反應條件：95 ℃預變性300 s，隨后95 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，共設置35個循環(huán)，最后一步72 ℃延伸120 s。擴增完畢后，進行目的片段電泳，觀察目的片段大小是否正確，驗證正確后，擴增產物送至上海生工生物技術公司測序。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1ANGPTL4rs4076317、rs1044250擴增結果ANGPTL4rs4076317、rs1044250擴增目的產物片段分別為279、210 bp，擴增目的片段正確，電泳結果見圖1。

電泳1通道為Marker DL2000；電泳2通道為rs1044250擴增片段210 bp；電泳3通道為rs4076317擴增片段279 bp；ANGPTL4為血管生成素樣蛋白4。

2.2ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因多態(tài)性3組間ANGPTL4rs4076317等位基因位點CC、GC基因型分布頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；CAD組、IS組ANGPTL4rs4076317等位基因位點CC、GC基因型分布頻率與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；CAD組rs4076317等位基因位點CC、GC基因型分別與IS組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。3組間ANGPTL4rs1044250等位基因位點CC、CT基因型分布頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。CAD組ANGPTL4rs4076317基因CC、GC基因型分布頻率危險度OR與對照組比較分析，OR值分別為0.813、1.709，差異有統計學意義(P<0.05)；IS組危險度OR與對照組比較分析，OR值分別為0.787、1.806，差異有統計學意義(P<0.05)。CAD組、IS組CC基因型為避免疾病發(fā)生的保護性因素，GC基因型為疾病發(fā)生的危險性因素。見表3、4。

表2 ANGPTL4 rs4076317、rs1044250基因多態(tài)性分布頻率[n(%)]

表3 CAD組與對照組rs4076317等位基因型危險度OR值分析[n(%)]

表4 IS組與對照組rs4076317等位基因型危險度OR值分析[n(%)]

2.3 血脂水平CAD組、IS組ANGPTL4rs4076317基因CC、GC同類基因型所對應的CHOL、TG、LDL-C水平均高于對照組，HDL-C水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；CAD組ANGPTL4rs4076317 CC、GC同類基因型對應的CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平與IS組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。3組ANGPTL4rs4076317 CC基因型所對應的CHOL、HDL-C、LDL-C水平與GC基因型比較，差異無統計學意義(P>0.05)；3組ANGPTL4rs4076317 CC基因型所對應的TG水平均低于GC基因型，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。CAD組、IS組ANGPTL4rs1044250基因CC、CT同類基因型所對應的CHOL、TG、LDL-C水平均高于對照組，HDL-C水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；CAD組ANGPTL4rs1044250 CC、GC同類基因型所對應的CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平與IS組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。3組ANGPTL4rs1044250 CC基因型所對應的CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平與GC基因型比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表5 ANGPTL4 rs4076317等位基因多態(tài)性與血脂水平比較

表6 ANGPTL4 rs1044250等位基因多態(tài)性與血脂水平比較

2.4ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因型測序結果擴增目的片段成功后，送上海生工生物技術公司進行測序，隨機從標本中抽取ANGPTL4rs4076317、rs1044250等位基因野生型、突變雜合型4例，測序圖示例如下圖2，黑色箭頭所指處為檢測位點。

A為rs4076317野生型CC型；B為rs4076317雜合突變型GC型；C為rs1044250 野生型CC型；D為rs1044250雜合突變型CT型；ANGPTL4為血管生成素樣蛋白4。

圖2ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因測序圖

3 討論

ANGPTLs是一類新發(fā)現的血管相關蛋白因子，目前已知有7個成員，分別命名為 ANGPTL 1～7，在人類和鼠中均有表達。ANGPTL4在分子結構和氨基酸序列上與血管生成素家族相似，具有一定的同源性。脂代謝紊亂為多基因遺傳病，并受其他因素的影響。有關研究證明，ANGPTL4基因多態(tài)性與人類的脂代謝相關[12-13]。Muendlein等[5]報道ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因多態(tài)性與血液中TG水平有關聯。Talmud等[9]報道，ANGPTL4rs1044250 (T266M)與血漿低水平的TG和高水平的HDL-C相關，但由于rs1044250與 rs116843064(罕見的E40K變異)存在強的連鎖不平衡關系，因此，rs1044250對血脂代謝的影響可能取決于E40K變異。也有研究認為，ANGPTL4基因多態(tài)性與脂代謝無關聯，Staiger等[10]在對德國白種人群的研究中指出，rs4076317和rs1044250與血漿TG的水平不相關。ANGPTL4基因多態(tài)性與脂代謝的關聯在多個種族的研究中并不一致，提示各種族的遺傳因素仍是產生臨床表型差異的原因。ANGPTL4通過抑制脂蛋白脂肪酶影響血脂代謝[7]，研究發(fā)現，ANGPTL4基因敲除小鼠TG的水平下降，而通過轉基因技術使小鼠體內ANGPTL4過度表達后可觀察到TG水平明顯升高[14]，人類ANGPTL4基因在TG代謝中是否有同樣的作用尚未證實。動脈粥樣硬化的形成與高水平CHOL、TG、LDL-C和低水平HDL-C等多種因素有關，是心腦血管疾病發(fā)生的高危因素。研究證實，ANGPTL4基因多態(tài)性位點與動脈粥樣硬化相關疾病的易患性密切相關[6，15]。Muendlein等[5]報道ANGPTL4rs1044250與心血管事件的發(fā)病風險相關，rs1044250 T等位基因則是血管事件的危險因素，但攜帶rs1044250T等位基因的單體型并未觀察到增加心血管疾病的發(fā)病風險。Folsom等[6]報道，ANGPTL4基因E40K變異與冠心病發(fā)生風險增加相關。

本研究檢測結果顯示，我國豫北健康漢族人群ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因多態(tài)性，正常野生型分別為79.13%和93.91%，雜合型分別為20.87%和6.09%，兩者均未檢測到純合突變型，可能與標本量不足夠大有關。在CAD組和IS組中，rs4076317正常野生GG型分別為64.34%和62.31%，雜合GC型分別為35.66%和37.69%，與正常健康人群等位基因頻率比較，差異有統計學意義，并且CAD組和IS組中，其rs4076317雜合型GC型與正常對照組比較，危險度OR值分別為1.709、1.806，差異亦有統計學意義，因此，rs4076317雜合型GC型可能是引起心腦血管疾病的易感危險因素，而rs4076317野生型CC型，與正常對照組比較，其OR值分別為0.813、0.787，可能為心腦血管疾病的保護性因素。rs1044250(T266M)在CAD組和IS組中，野生型CC型分布頻率分別為93.00%和92.31%，雜合型CT型分布頻率分別為7.00%和7.69%，與正常健康人群組比較，差異無統計學意義，可初步認為ANGPTL4rs1044250等位基因多態(tài)性在中國漢族人群中與心腦血管疾病易患性無關。本研究數據分析表明，3組患者無論是ANGPTL4rs4076317基因是野生型還是雜合型，其CHOL、TG和LDL-C水平均高于對照組，HDL-C值均低于健康對照組，這些數據進一步證明了CHOL、TG和LDL-C水平偏高、HDL-C水平偏低是心腦血管疾病患者的發(fā)病高危因素[16-17]。本研究發(fā)現，3組患者ANGPTL4rs4076317，野生型GG與雜合型GC比較，其GG型的TG水平均低于GC型，而CHOL、HDL-C、LDL-C差異無統計學意義，與楊茜[18]報道有所差別，這表明ANGPTL4rs4076317野生GC型較易引起TG增高，可能與心腦血管疾病易感性更密切。

本研究數據分析發(fā)現，3組患者ANGPTL4rs1044250基因野生型CC型與雜合型CT型分布頻率無差異。ANGPTL4rs1044250基因無論是野生CC型還是雜合CT型，在CAD組、IS組間，其CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平差異無統計學意義，只是在對照組中CC型、CT型，其CHOL、TG、LDL-C水平均低于CAD組和IS組，HDL-C水平高于CAD組和IS組，推測可能原因是ANGPTL4rs1044250基因變異與rs116843064存在連鎖不平衡，引起的脂代謝異常更多的是依賴于rs116843064基因變異(罕見的E40K變異)，與Talmud等[9]、楊茜等[11]報道較為一致。

本研究探討了豫北漢族人群ANGPTL4rs4076317、rs1044250等位基因多態(tài)性在正常人群和心腦血管疾病患者人群中的分布頻率，還進一步分析了心腦血管疾病人群與健康人群這兩個基因位點多態(tài)性與脂代謝的關系，初步論證了ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因位點變異與脂代謝的關系，進一步論證了ANGPTL4rs4076317基因多態(tài)性與脂類代謝TG有關以及ANGPTL4rs1044250基因多態(tài)性與脂類代謝無關，并驗證了心腦血管疾病患者與正常健康人群脂代謝的水平分布特點。由于心腦血管疾病和脂代謝紊亂是多基因疾病，需要更多的其他基因和其他因素研究，才能更好地闡明基因、脂代謝與心腦血管疾病之間的關系。本研究從ANGPTL4rs4076317、rs1044250兩個等位基因位點變異與脂代謝的關系進行研究，為臨床分析高脂血癥病因提供一定的幫助，可將其作為臨床診治心腦血管疾病的一個風險評估指標，也可為下一步開發(fā)ANGPTL4藥物治療心腦血管疾病提供一個方向和途徑。由于脂類代謝疾病是多基因病，涉及因素較多，牽涉到多個自變量(疾病、ANGPTL4rs4076317、ANGPTL4rs1044250)和多個因變量(CHOL、TG、HDL-C、LDL-C)，或者其他未知因素等，都可能對脂類代謝指標有影響，鑒于復雜程度，本研究只用了卡方檢驗和t檢驗對比分析，未采用多元回歸分析方法，可能對本研究的結果稍有影響或存在局限性，有待以后進一步更深入的研究。另外，由于本研究樣本量較少，更多的ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因位點變異頻率分布，以及其他基因與相關的脂代謝和心腦血管疾病的關系，需要更大樣本量進行深入的研究。