鼻咽癌組織中miR-10b、LMP1和Twist1的表達變化及臨床意義

孫秀英，袁穎，徐彧

南京醫科大學附屬淮安第一醫院，江蘇淮安223300

鼻咽癌是發生于鼻咽頂壁及咽隱窩的惡性腫瘤，全球每年鼻咽癌發病患者例數約8萬，死亡例數約5萬［1］。鼻咽癌對放化療較為敏感，早期患者積極治療后5 年生存率達80%，但中晚期患者腫瘤已發生局部浸潤及遠處轉移，患者遠期生存預后不佳［2］。因此，有必要深入研究鼻咽癌發生發展的機制，尋找診斷、治療及預后判斷的腫瘤標志物。微小RNA（miRNA）是長度為19～25 個核苷酸的非編碼RNA分子。研究發現，miRNA 參與正常細胞增殖、分化、凋亡及代謝等生物學過程，與炎癥、免疫及腫瘤等疾病的發生發展密切相關［3］。miR-10b 基因位于染色體2q31.1，在腎癌［4］、肝癌［5］等多種腫瘤中均存在異常表達，可調控下游靶基因如同源盒基因3（HOXA3）的表達，促進細胞侵襲和轉移，導致腫瘤的惡性進展。鼻咽癌的發生與EB 病毒感染密切相關。潛伏期膜蛋白1（LMP1）是EB 病毒的基因蛋白產物，發揮癌基因的功能。有研究報道，LMP1 能夠激活細胞內核因子κB信號通路，促進正常鼻黏膜上皮細胞的惡性轉化，促進鼻咽癌的發生發展［6］。Twist 同系物 1（Twist1）基因位于 7p21.1，編碼蛋白為具有螺旋―環―螺旋結構的轉錄因子，以同二聚體和異二聚體的方式發揮作用，在胚胎發育、神經管閉合和褐色脂肪代謝中起重要作用。Twist1 在肺癌［7］、肝癌［8］等多種人類癌癥中過表達，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，導致腫瘤的發生發展。目前關于 miR-10b、LMP1 和Twist1 在鼻咽癌中的研究較少。因此，本研究通過觀察鼻咽癌組織中miR-10b、LMP1和Twist1的表達變化，探討三者表達的相關性及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年12月南京醫科大學附屬淮安第一醫院診治的92 例鼻咽癌患者。納入標準：經病理學檢查確診為鼻咽鱗癌，由兩位病理醫師共同診斷；初次診治，未接受過化療、放療等治療；臨床資料及病理資料完整。排除標準：合并其他器官惡性腫瘤；合并嚴重感染性疾病；合并嚴重的心肺腎等臟器功能障礙。其中男52例，女40例；年齡 26～79（47.3 ± 6.1）歲；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期22 例，Ⅲ～Ⅳ期70 例；腫瘤分化程度：高中分化19 例，低分化73 例；伴淋巴結轉移62 例，無淋巴結轉移30例；有吸煙史31例，無吸煙史61例。患者及家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究經我院倫理委員會審核批準通過。

1.2 組織中miR-10b、LMP1和Twist1 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。各取約50 mg 癌組織和癌旁組織（距離癌組織邊緣2 cm 以上），TRIzol法提取組織中總RNA，Nanodrop 檢測RNA 的濃度及純度。以RNA 為模板逆轉錄合成cDNA。實時熒光定量PCR 總反應體系20 μL，10 μL SYBR Green Pre?mix，上下游引物各1μL，模板2μL，去離子水6μL。miR-10b 上游引物序列：5"-CTCAACTGGTGTCGTG?GAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAAATT-3"，下 游引物序列：5"-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3"，內參基因U6 上游引物序列：5"-TTCGGCAGCA?CATATACTAAAATTGG-3"，下游引物序列：3"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5"；LMP1 上 游 引物序列：5"-ACACACTGCCCTGAGGATG-3"，下游引物序列：5"-TGAGCAGGAGGGTGATCA-3"；Twist1 上游引物序列：5"-CAAGCTGCAGCTATGTGGC-3"，下游引物序列：5"-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGG-3"；內參基因GAPDH 上游引物序列：5"-GCTCTCT?GCTCCTCCTGTTC-3"，下 游 引 物 序 列 ：3"-CGCCCAATACGACCAAATCC-5"。 miR-10b 的 反 應條件：95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸 30 s，共 40 個循環。LMP1、Twist1 反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火25 s，70 ℃延伸 30 s，共 40 個循環。以 2-ΔΔCt法計算miR-10b、LMP1和Twist1 mRNA的相對表達量。

1.3 組織中LMP1、Twist1 蛋白表達檢測 采用免疫印跡法。各取約50 mg 癌組織和癌旁組織，將組織冰上剪碎，組織勻漿器勻漿，將上清加入細胞裂解液，裂解15 min。取上清蛋白定量后，加入上樣緩沖液，99 ℃水浴10 min。進行SDS-PAGE 膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，恒壓80 V 轉印2 h。將PVDF 膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h；LMP1、Twist1一抗（稀釋比均為1∶3 000，LMP1單抗購自In?vitrogen 公司，Twist1 單抗購自abcam 公司）4 ℃孵育過夜；二抗（1∶5 000）中孵育，室溫1 h。ECL 暗室顯影照相。出現相應蛋白條帶判定為陽性，無蛋白條帶判定為陰性。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；miR-10b、LMP1 和 Twist1 mRNA 表達的相關性采用 Pear?son線性相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織和癌旁組織中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA 表達比較 鼻咽癌組織中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA 的相對表達量分別為8.110±1.132、4.934 ± 0.826、4.147 ± 0.811，癌旁組織分別為0.475±0.113、0.627±0.151、0.568±0.105。鼻咽癌組織中 miR-10b、LMP1 和 Twist1 mRNA 的相對表達量均高于癌旁組織（t分別為64.373、49.198、41.978，P均<0.01）。

2.2 鼻咽癌組織和癌旁組織中LMP1和Twist1蛋白表達比較 鼻咽癌組織及癌旁組織中LMP1 蛋白表達陽性率分別為77.2%（71/92）、10.9%（10/92），癌組織LMP1 蛋白表達陽性率高于癌旁組織（χ2=82.065，P<0.01）；癌組織及癌旁組織中Twist1 蛋白表達陽性率分別為72.8%（67/92）、7.6%（7/92），癌組織Twist1 蛋白表達陽性率高于癌旁組織（χ2=81.376，P<0.01）。

2.3 鼻咽癌組織中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA表達與臨床病理特征的關系 不同腫瘤TNM 分期鼻咽癌患者癌組織中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA 表達比較差異有統計學意義（P均<0.05）。見表1。

2.4 鼻咽癌組織中miR-10b、LMP1 和Twist1 mRNA表達的相關性 鼻咽癌癌組織中miR-10b 與LMP1、Twist1 mRNA 的表達呈正相關（r分別為 0.603、0.578，P均<0.01），癌組織中LMP1 與Twist1 mRNA表達呈正相關（r=0.611，P<0.01）。

3 討論

鼻咽癌是我國常見的頭頸部惡性腫瘤之一，源于鼻咽部及咽隱窩部黏膜上皮組織，病理上分為角化性、非角化性及基底樣鱗狀細胞癌三類。目前放療是鼻咽癌的主要治療方式，但放療的不良反應較大，局部復發及轉移率較高［9］。因此，需深入研究鼻咽癌的病因及發病機制，用于臨床診斷及治療。近年研究表明，細胞內存在的miRNA 可以通過結合下游靶基因mRNA 的3"-非編碼區來調控多種靶基因的表達，而miRNA 的異常表達與自身免疫性疾病、心血管疾病及腫瘤等多種疾病有關，有望成為診斷治療鼻咽癌的腫瘤標志物［10］。

miR-10b編碼基因位于人類2q31 HOXD 基因簇中。近年來研究表明，乳腺癌等多種腫瘤中miR-10b 表達升高，并且體外試驗亦證實過表達miR-10b具有促進腫瘤細胞的侵襲及轉移的功能［11］。本研究鼻咽癌組織中miR-10b 的相對表達量高于癌旁組織，表明miR-10b 參與鼻咽癌的發病過程。有學者報道，miR-10b 的表達增加能夠通過調控大腫瘤抑制激酶2（LATS2）的表達，促進腫瘤細胞的上皮間質轉化，導致腫瘤細胞的惡性進展［12］。此外，鼻咽癌組織中miR-10b 的表達與腫瘤TNM 分期有關，表明miR-10b 高表達參與促進鼻咽癌的發生發展。其機制可能是miR-10b 作為一種致癌miRNA，能通過促進巖藻糖基轉移酶8 的表達，進而激活蛋白激酶B信號通路促進腫瘤細胞的增殖及局部侵襲浸潤，導致腫瘤分期升高［13］。此外，miR-10b 表達增加可通過抑制抑癌基因如同源性磷酸酶張力蛋白基因的表達，促進腫瘤細胞的無限增殖［14］。

表1 鼻咽癌組織中miR-10b、LMP1和Twist1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

EB 病毒具有嗜B 淋巴細胞的特點，人體感染后處于潛伏狀態，在一定條件下能夠再次復制，并編碼產生蛋白抗原。LMP1 是EB 病毒編碼產物，具有誘導B 淋巴細胞分化、促增殖及抑制凋亡的能力。有研究發現，LMP1 能夠激活腫瘤細胞內經典的Wnt/β連環蛋白信號通路，促進腫瘤細胞的惡性增殖，促進鼻咽癌的發生發展［15］。本研究中，癌組織中LMP1 mRNA 表達和LMP1 蛋白陽性率均升高，表明LMP1可能參與鼻咽癌的發生發展。分析其原因，鼻咽癌是一種EB 病毒相關癌癥，腫瘤發生時，處于潛伏狀態的EB 病毒能夠再次活化，誘導LMP1 的表達，從而促進腫瘤的惡性進展。此外，高分化期腫瘤中LMP1 表達較高。分析其原因，LMP1 充當組成型活性受體，模擬腫瘤壞死因子受體超家族分子功能，激活細胞內多種信號通路，包括核因子κB，磷脂酰肌醇3 激酶/Akt 和絲裂原活化的蛋白激酶途徑等，促進基質金屬蛋白酶、血管內皮生長因子等癌基因的表達，導致腫瘤細胞發生遷移、增殖等惡性生物學行為［16］。

Twist1 基因的編碼蛋白是一種重要的具有螺旋—環—螺旋結構的轉錄因子，以異二聚體的形式與DNAE 盒序列結合，調節神經發育、神經管閉合和褐色脂肪代謝等生物學過程。該基因在多種人類癌癥中被高度甲基化并過表達，編碼蛋白質促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。研究表明，腫瘤細胞中Twist1 表達上調促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化過程，導致腫瘤的惡性進展［17］。本研究中，鼻咽癌組織中Twist1 mRNA 表達和Twist1 蛋白表達陽性率均高于癌旁組織，表明Twist1 參與鼻咽癌的發病。研究表明，Twist1 表達受 miRNA（如 miR-140-3p）的調控，miR-140-3p 表達下調導致Twist1 mRNA 的穩定性增加，腫瘤中Twist1 表達升高，而Twist1 表達升高能夠促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，增加腫瘤細胞的局部浸潤及遠處轉移能力，促進腫瘤的惡性進展［18］。此外，Twist1 基因的表達與腫瘤分期有關，可能是因為過表達Twist1 導致E-鈣黏素表達降低，波形蛋白等間質性標志物表達升高，促進鼻咽癌的惡性進展，導致腫瘤分期升高［19］；腫瘤中Twist1的表達上調能夠通過增加性別決定區Y 框蛋白2 等因子的表達，增加腫瘤CD133+干細胞亞群，增強腫瘤的惡性增殖及遷移能力［20］。

本研究進一步分析了鼻咽癌組織中miR-10b、LMP1 和 Twist1 表達的相關性，結果顯示 miR-10b 與LMP1、Twist1 的表達 呈 正相關，LMP1 的表達與Twist1 表達呈正相關。目前其機制尚不清楚，但有學者在鼻咽癌的C666.1 細胞系中發現，EB 病毒表達的LMP1 蛋白能夠通過上調轉錄因子Twist1 的表達，而Twist1 結合miR-10b 的啟動子區域，促進miR-10b 的表達［21］。也有研究發現，miR-10b 能夠靶向抑制抑癌基因PTEN 的表達，促進惡性腫瘤細胞的增殖及遷移，導致腫瘤進展［22］。因此，鼻咽癌中LMP1可能通過促進Twist1 及miR-10b 的表達，促進鼻咽癌的發生發展，這可能是影響鼻咽癌發生發展的重要機制。

綜上所述，鼻咽癌組織中miR-10b、LMP1 和Twist1 表達升高，三者表達與腫瘤分期有關。鼻咽癌組織中的miR-10b、LMP1 和Twist1 有可能成為新的鼻咽癌腫瘤診斷及治療靶點，但三者的相互作用機制及臨床意義尚需要進一步研究。