血清微小RNA-155 表達與潰瘍性結腸炎患者病情嚴重程度及復發的關系

張鳳，羅德蘭，鐘玉全

內江市第一人民醫院，四川內江641000

潰瘍性結腸炎（UC）是免疫相關的慢性非特異性腸道炎性病變，近年來隨著我國人民生活水平的提高，發病率呈逐漸增加的趨勢［1］。病因尚不明確，與遺傳、環境及免疫等因素有關，表現為腸黏膜組織損傷及機體免疫功能紊亂［2］。目前UC的治療主要包括激素治療、手術治療等，但部分UC患者存在激素治療不敏感或激素抵抗的現象，導致治療失敗［3］。因此，研究炎癥性腸病（IBD）的病因及發病機制，尋找UC患者預后的危險因素，對于控制UC患者癥狀發作、盡早應用免疫抑制劑轉換治療及提高患者生活質量具有重要的臨床意義。微小RNA（miRNA）是長度為19～25個核苷酸的RNA分子，參與細胞分化、增殖、凋亡及衰老等生理過程。近年來研究發現，miRNA在炎癥、免疫、腫瘤等多種疾病中均存在異常表達的現象，通過調控下游靶基因轉錄后水平的表達，發揮重要的生物學功能［4］。miR-155基因位于人類染色體21q12.3，是一種參與造血、炎癥和免疫反應的多功能miRNA，其表達受炎癥因子和toll樣受體配體誘導［5］。研究表明，在IBD患者結腸黏膜中miR-155的表達異常升高，并通過調控下游轉錄因子Est-1，促進UC的發生發展［6］。但目前UC患者血清中miR-155表達及臨床意義報道較少。本研究通過檢測UC患者血清中的miR-155，分析其與UC病情嚴重程度及復發的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2017年12月我院診治的97 例UC 患者（UC 組）。納入標準：參考中華醫學會消化病學分會IBD 學組制定的《炎性腸病診斷與治療的共識意見》中UC 診斷標準進行診斷［7］；臨床及隨訪資料完整；既往無激素類等藥物治療史。排除標準：合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能障礙疾病；患精神障礙性等疾病；患胃腸道細菌性、病毒性感染及腸道結核等腸道疾病。UC 組患者年齡33～56（41.4 ± 5.6）歲；男50 例，女47 例；有吸煙史 57 例，無吸煙史40 例；體質量指數（BMI）18.2～27.4（21.3 ± 3.4）kg/m2；病情活動期 61 例，緩解期36例；病變范圍：直腸及乙狀結腸41例，左半結腸34例，全結腸22 例；伴腸外癥狀（包括關節疼痛、口腔病變等）28 例，無腸外癥狀69 例。以49 例查體健康人群作為對照組，其中男27 例，女22 例；年齡35～59（43.1 ± 6.1）歲；BMI 18.7～28.1（21.7 ± 4.1）kg/m2。UC組與對照組性別、年齡及BMI比較差異無統計學意義。所有患者簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會審核批準通過。

1.2 血清中miR-155 表達檢測 采用熒光定量PCR。留取各組清晨空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，4 ℃下2 500 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），將上清移至EP 管中，-70 ℃保存待測。應用TRIzol 法提取血清中總RNA，溶于DEPC 水中，Narodrop 檢測總 RNA 的濃度及純度，OD260/OD280介于 1.8～2.0。以總RNA 為模板，反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，進行PCR 反應。總反應體系包括模板1μL cD?NA、0.2 μL Taq 聚合酶、1 μL 上游及下游引物、10μL 2×SYBR Green mix 和 1 μL 20 mmol/L dNTPs，ddH2O 補足 20 μL。反應條件：95 ℃預變性 60 s，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 s，變性退火延伸共40 個循環。miR-155 正向引物序列：5"-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3"，反向引物序列：5"-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3"；內參基因 U6正向序列：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，反向序列 ：3"-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-5"。 采 用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。應用速率散射比濁法檢測外周血的C 反應蛋白（CRP），應用魏氏法檢測紅細胞沉降率（ESR）。

1.3 UC 內鏡下嚴重程度評價及臨床活動度評價 采用UC 內鏡下嚴重度指數評分（UCEIS 評分）對受累腸段嚴重程度評分［8］，評分內容包括血管紋路（0～2 分）、出血情況（0～3 分）及糜爛潰瘍（0～3分），評分越高，受累腸段病情越重。UC 緩解期UCEIS 評分 0～1 分，活動期 2～8 分。UC 臨床活動度采用 Mayo 評分評價［9］，癥狀緩解為 0～2 分、輕度活動為3～5 分、中度活動為6～10 分、重度活動為11～12分。

1.4 隨訪 所有患者出院后以門診或電話方式隨訪，每月隨訪1次，隨訪2年，隨訪內容為患者復發情況，復發標準參考《炎性腸病診斷與治療的共識意見》中關于UC 的診斷內容。隨訪截止至2019 年12月。隨訪終點為患者復發或隨訪結束。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以-x±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用F檢驗，進一步兩兩比較采用q檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。采用Pearson 線性相關分析miR-155 與UCEIS 評分及Mayo 評分的相關性。采用多因素Logistic回歸分析UC患者復發的危險因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-155 表達比較 對照組與UC 組miR-155 相對表達量分別為 0.35 ± 0.07、1.95 ±0.36，兩組比較P<0.01。

2.2 UC 不同臨床活動度患者血清miR-155、Mayo評分及UCEIS 評分比較 UC 緩解期、UC 活動期患者 miR-155 相對表達量分別為 1.67 ± 0.36、2.12 ±0.41，兩組比較P<0.01。UC 不同臨床活動度患者血清miR-155、Mayo 評分及UCEIS 評分比較見表1。Pearson 線性相關分析結果顯示，UC 活動期患者血清 miR-155 與 Mayo 評分及 UCEIS 評分呈正相關（r分別為0.512、0.603，P均<0.01）。見表1。

表1 UC不同臨床活動度患者血清miR-155表達、Mayo評分及Baron評分比較（±s）

表1 UC不同臨床活動度患者血清miR-155表達、Mayo評分及Baron評分比較（±s）

注：與輕度相比，＊P<0.05；與中度相比，#P<0.05。

臨床活動度輕度中度重度F P n 19 22 20 miR-155相對表達量1.85±0.46 2.11±0.44＊2.39±0.38＊#7.671<0.01 Mayo評分（分）3.46±0.71 5.22±0.94＊8.76± 1.25＊#145.002<0.01 UCEIS評分（分）3.49±0.81 4.22±0.90＊5.96± 1.10＊#11.793<0.01

2.3 血清miR-155 與UC 復發的關系 隨訪過程中，UC 組 97 例患者中無復發 48 例、復發 49 例，復發率50.5%（49/97）。UC 患者復發與腸外表現、血清miR-155、ESR 及 CRP 有關（P均<0.05），而與性別、年齡、BMI、吸煙史及病變位置無關。見表2。

表2 影響UC患者復發的危險因素單因素分析

將腸外表現、CRP、ESR和miR-155作為自變量，將復發與否作為因變量，進行多因素Logistic 回歸分析。結果發現，腸外表現、CRP、ESR 和 miR-155 是UC患者復發的危險因素。見表3。

3 討論

UC 是病因及發病機制不明的胃腸道慢性炎性疾病，屬于IBD的一種類型。近年來我國UC發病率有逐漸增加的趨勢，嚴重威脅我國人民身體健康。目前UC 尚缺乏特異性的診斷指標，易將感染性結腸炎、克羅恩病等誤診為UC，并且UC 病程較長，復發率高，腸道長期慢性炎癥有腫瘤發生的風險［10］。因此，深入研究UC 疾病發生發展的機制，尋找有效診斷評估UC 病情程度的血清學指標，探討UC 復發的危險因素，對于評估IBD 患者病情及預后具有重要的臨床意義。miRNA 是近年來發現的小的非編碼RNA 分子，以往認為是轉錄過程中的“分子垃圾”，但大量研究發現其在炎癥、免疫及腫瘤等多種病理過程中發揮重要的調控作用［11］。檢測患者外周血中miRNA 水平變化有助于疾病的早期診斷、治療及隨訪，是一種有潛在價值的血清標志物［12］。

表3 影響UC患者復發的危險因素多因素Logistic回歸分析

miR-155 是一種多功能的microRNA，最初發現其具有免疫調節功能，在先天和適應性免疫應答中發揮重要作用［13］。研究表明，miR-155對IBD的發生發展也至關重要，在UC 腸黏膜組織中過表達，并能夠通過激活Wnt信號通路，下調E-鈣黏素的表達，促進上皮間質轉化，導致UC 的發生［14］。本研究中，UC患者血清miR-155 表達高于對照組。目前其機制尚不清楚，可能與腸道局部炎癥環境中免疫細胞分泌的細胞因子失調有關。研究表明，炎癥微環境中的中性粒細胞、巨噬細胞等能產生大量促炎細胞因子，如 TNF-α，TNF-α 能夠激活核因子κB 信號通路，轉錄因子結合于miR-155啟動子區域，促進miR-155表達上調，進而引起UC 的發生［15］。此外本研究發現，UC 患者血清miR-155 表達與疾病的活動性有關，活動期患者血清miR-155 表達高于緩解期，并且miR-155與反映活動期病情程度的Mayo評分及UCEIS評分呈正相關。表明miR-155 參與UC 的發生發展，有可能成為判斷UC 活動期病情嚴重程度的血清標志物。研究發現，miR-155 表達上調后能夠抑制IL-6、IL-8 等抗炎細胞因子的產生，加重炎癥微環境中促炎及抗炎平衡系統的失調，導致UC 疾病進展［16］。此外，miR-155 通過影響靶基因的表達，影響多種免疫細胞的功能，如miR-155能夠結合并抑制Jarid2基因的表達，引起Th17 細胞中notch1 信號通路的過度活化，產生大量IL-17細胞因子，IL-17招募大量中性粒細胞進入局部組織，從而加重UC 腸壁組織損傷［17］。本研究對 UC 組 97 例患者隨訪 2 年，49 例患者復發。進一步采用單因素及多因素Logistic 回歸分析影響UC復發的危險因素，發現腸外表現、CRP、ESR 和miR-155 是UC 患者復發的危險因素。血清高miR-155 表達患者UC 復發風險高于低表達者，與miR-155 參與UC 的發生發展的過程有關。可能是血清高miR-155 表達的UC 患者由于腸壁病變較重，腸黏膜愈合時間長，腸黏膜上皮屏障功能障礙，加上腸黏膜上皮細胞分泌的抗菌因子減少導致殺菌屏障功能不足，導致腸道細菌易突破腸道屏障，引起UC復發［18］。CRP 和 ESR 是 UC 診斷及治療中常用的生物學指標，與UC 病情活動有關，本研究發現兩者是UC 復發的危險因素。可能是機體炎癥介質如IL-1、TNF-α 等水平升高促進肝臟合成CRP 合成，因而CRP水平越高的UC患者復發風險越高。此外，血清中某些蛋白成分改變及紅細胞壓積的變化常引起ESR 上升，ESR 較高反映機體仍處于炎癥狀態，增加UC 復發的風險。UC 病變以腸道為主，但同時可伴有關節炎、口腔潰瘍等腸外表現，本研究中伴有腸外表現的患者UC 復發率較高。其原因可能是UC 腸外表現與腸道的炎癥程度密切相關，腸道炎癥程度越重，腸外表現的發生率越高，增加UC復發［19］。

綜上所述，UC 患者血清miR-155 表達高，miR-155與IBD疾病活動性及活動期嚴重程度有關，血清高miR-155 表達是UC 疾病復發的危險因素。miR-155 有可能成為反映UC 患者病情及判斷預后的血清標志物，具有一定的臨床價值。